通過(guò)莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻斷3’dna末端的聚合酶延伸的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻斷3' DNA末端的聚合酶延伸的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年4月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/816, 431的優(yōu)先權(quán)，該申 請(qǐng)通過(guò)引用納入本文用于所有目的。
[0003] 聯(lián)邦資助的研究與開(kāi)發(fā)下作出發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004] 本發(fā)明部分得到NHGRI資助號(hào)：1R43HG005144-01的支持。聯(lián)邦政府可享有本發(fā) 明的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 核酸試驗(yàn)通常采用DNA聚合酶，以及任選的具體DNA探針來(lái)生成試驗(yàn)信號(hào)。例如， 試驗(yàn)可采用標(biāo)記的DNA寡核苷酸作為DNA聚合酶的引物。在這類(lèi)試驗(yàn)中，DNA引物的結(jié)合 和延伸在試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估中起到作用。引物依賴性聚合酶試驗(yàn)的潛在失效模式的一個(gè)示例 是在沒(méi)有引物雜交的情況下DNA聚合酶延伸的啟動(dòng)。這種失效可源于DNA靶分子或擴(kuò)增子 的自啟動(dòng)或由混合物中其它模板分子的啟動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供了用于防止聚核酸的3'末端啟動(dòng)聚合酶依賴反應(yīng)的方法和組合物。該 方法包括向核酸的3'末端添加結(jié)構(gòu)以防止聚合酶延伸。
[0007] 在一些實(shí)施方式中，提供了一種引物延伸產(chǎn)物所致假啟動(dòng)減少的進(jìn)行引物延伸的 方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括：
[0008] 提供包含以下組分的反應(yīng)混合物：
[0009] 包含5'末端和3'末端的單鏈多核苷酸模板，所述多核苷酸模板在3'末端的6個(gè) 核苷酸內(nèi)包含5-25個(gè)核苷酸的雙鏈莖；
[0010]引物，當(dāng)該多核苷酸模板中存在靶序列則該云霧與該靶序列退火結(jié)合；和
[0011] 聚合酶；
[0012] 將反應(yīng)混合物暴露于這樣的條件即該條件下，當(dāng)該靶序列存在則該引物與該靶序 列退火且該聚合酶以模板依賴的方式延伸引物；并且
[0013] 檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物的存在或量。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，靶序列存在于多核苷酸模板中。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖是莖環(huán)的部分，雙鏈莖的兩條鏈由環(huán)連接。在一些實(shí)施 方式中，環(huán)包含1-10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多 核苷酸模板的3'末端。在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖包含3'端并且連接到莖的3'端是1-5 個(gè)核苷酸，這些核苷酸不構(gòu)成莖的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成雙鏈莖的第一條鏈，該 莖的第二條鏈?zhǔn)桥c之區(qū)分的與該核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中，反 義寡核苷酸經(jīng)阻斷不被聚合酶延伸（例如，寡核苷酸不包含3' -OH部分）。在一些實(shí)施方 式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，多核苷酸模板包含猝滅劑/焚光標(biāo)簽對(duì)中的一成員并且抑制 劑寡核苷酸與引物下游的多核苷酸模板退火，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒光標(biāo)簽 對(duì)中的第二員，由此，當(dāng)抑制劑寡核苷酸與多核苷酸模板退火時(shí)，來(lái)自標(biāo)簽的信號(hào)被猝滅。 在一些實(shí)施方式中，暴露包括用聚合酶來(lái)延伸引物，從而置換抑制劑寡核苷酸并使得猝滅 劑/熒光標(biāo)簽對(duì)不猝滅從而生成熒光信號(hào)；并且檢測(cè)熒光信號(hào)并將信號(hào)的量與靶序列的存 在或量相關(guān)聯(lián)。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，該聚合酶是DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中，該聚合酶是RNA 聚合酶。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物中的核苷酸三磷酸整合到引物延伸產(chǎn)物中并且所 述核苷酸三磷酸中的至少一些包含標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，核苷酸三磷酸包含熒光標(biāo)簽 和猝滅劑對(duì)，這樣，當(dāng)核苷酸三磷酸完整時(shí)，熒光標(biāo)簽被猝滅劑猝滅，而當(dāng)核苷酸整合到引 物延伸產(chǎn)物時(shí)熒光標(biāo)簽不猝滅。
[0019] 也提供了包含5'末端和3'末端的單鏈多核苷酸，所述多核苷酸模板在3'末端的 6個(gè)核苷酸內(nèi)包含5-25個(gè)核苷酸的雙鏈莖。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖是莖環(huán)的部分，雙鏈莖的兩條鏈由環(huán)連接。在一些實(shí)施 方式中，環(huán)包含1-10個(gè)核苷酸。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0022] 在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖包含3'端并且連接到莖的3'端是1-5個(gè)核苷酸，這些 核苷酸不構(gòu)成莖的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成雙鏈莖的第一條鏈，所 述莖的第二條鏈?zhǔn)桥c之區(qū)分的與核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中，反 義寡核苷酸不包含3' -OH部分或者經(jīng)阻斷而不被聚合酶延伸。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0025] 在一些實(shí)施方式中，多核苷酸模板包含猝滅劑/焚光標(biāo)簽對(duì)中的一成員。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，單鏈多核苷酸長(zhǎng)10-5000個(gè)核苷酸。
[0027] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的反應(yīng)混合物。在一些實(shí) 施方式中，多核苷酸包含猝滅劑/熒光標(biāo)簽對(duì)中的一成員并且反應(yīng)混合物還包含抑制劑寡 核苷酸，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒光標(biāo)簽對(duì)中的第二員，由此，當(dāng)抑制劑寡核苷 酸與多核苷酸退火時(shí)，來(lái)自標(biāo)簽的信號(hào)被猝滅。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物還包含以下 中的至少一種（或全部）：DNA或RNA聚合酶；核苷酸三磷酸或脫氧核苷酸三磷酸；與單鏈多 核苷酸中的靶序列退火的引物；或抑制劑寡核苷酸，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒 光標(biāo)簽對(duì)中的第二成員，由此，當(dāng)抑制劑寡核苷酸與多核苷酸退火時(shí)，來(lái)自標(biāo)簽的信號(hào)被猝 滅。
[0028] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的試劑盒。
[0029] 還提供了制備上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的方法。在一些實(shí)施方式 中，該方法包括將包含模板核酸的核酸樣品與DNA聚合酶和至少第一寡核苷酸引物接觸以 形成混合物，所述第一寡核苷酸引物包含莖環(huán)，所述引物具有5'末端和3'末端并且從5' 末端到3'末端包含：任選的5'末端處不形成莖環(huán)部分的1-6個(gè)核苷酸，之后是形成莖環(huán)的 前一半莖的核苷酸，之后是形成莖環(huán)的環(huán)的核苷酸，之后是形成與前一半莖環(huán)雜交的后一 半莖的核苷酸，之后是在3'末端處與模板核酸互補(bǔ)的序列；并且將混合物暴露于這樣的條 件，即所述條件下，使得第一寡核苷酸引物的3'末端與模板核酸退火并且DNA聚合酶以模 板依賴的方式延伸第一寡核苷酸引物的3'末端以形成包含模板核酸的互補(bǔ)物和第一寡核 苷酸引物的單鏈擴(kuò)增子，從而擴(kuò)增模板核酸。在一些實(shí)施方式中，混合物還包含含有與單鏈 擴(kuò)增子互補(bǔ)的序列的第二寡核苷酸引物，并且其中暴露導(dǎo)致第二寡核苷酸引物與單鏈擴(kuò)增 子退火并用DNA聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成與單鏈擴(kuò)增子互補(bǔ)并在多核苷酸的 5'末端處有莖環(huán)的多核苷酸，從而形成雙鏈擴(kuò)增子。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，第二寡核苷酸引物具有3'和5'末端，并且第二寡核苷酸引物 包含在第二寡核苷酸引物的5'末端的3個(gè)核苷酸內(nèi)結(jié)束的莖環(huán)。
[0031] 在一些實(shí)施方式中，暴露包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。
[0032] 在一些實(shí)施方式中，第一或第二寡核苷酸包含標(biāo)簽，使得雙鏈擴(kuò)增子中的至少一 條鏈包含標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)簽帶熒光。
[0033] 在一些實(shí)施方式中，第一或第二寡核苷酸引物包含猝滅劑，使得雙鏈擴(kuò)增子中的 至少一條鏈包含猝滅劑。
[0034] 在一些實(shí)施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式 中，2-6個(gè)核苷酸形成莖環(huán)的環(huán)。在一些實(shí)施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處僅一 個(gè)核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實(shí)施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處的2個(gè) 核苷酸不形成莖環(huán)的部分。
[0035] 在一些實(shí)施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端處并與模板核酸互補(bǔ)的序列 至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
[0036] 還提供了包含莖環(huán)的寡核苷酸引物，所述引物具有5'末端和3'末端并且從5'末 端到3'末端包含：任選的5'末端處不形成莖環(huán)部分的1-6個(gè)核苷酸，之后是形成莖環(huán)的前 一半莖，之后是形成莖環(huán)的環(huán)的核苷酸，之后是與莖環(huán)的前一半反向互補(bǔ)的莖環(huán)的后一半 莖，之后是在3'末端處的序列（例如，與模板核酸互補(bǔ)）。
[0037] 在一些實(shí)施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式 中，2-6個(gè)核苷酸形成莖環(huán)的環(huán)。在一些實(shí)施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處僅一 個(gè)核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實(shí)施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處的2個(gè) 核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實(shí)施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端處并與模 板核酸互補(bǔ)的序列至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
[0038] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方 式中，反應(yīng)混合物還包含以下的一種或多種：DNA聚合酶；或具有與所述寡核苷酸引物不同 的序列的第二寡核苷酸。
[0039] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的試劑盒。
[0040] 定義
[0041] 除非另有說(shuō)明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 所理解的含義。通常，本文所用的命名和下述細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué) 以及雜交中的實(shí)驗(yàn)室步驟均為本領(lǐng)域熟知和常用的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行核酸和肽合成。按 照本領(lǐng)域和各種通用參考文獻(xiàn)所述的常規(guī)方法進(jìn)行這些技術(shù)和步驟（通常參見(jiàn)，Sambrook 等，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL)，第 2 版（1989) 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約冷泉港（Cold Spring Harbor，N. Y.)，其通過(guò)引用納入本文），將它們引入本文全文中。本文所用的命名以及下述 分析化學(xué)和有機(jī)合成中的實(shí)驗(yàn)室步驟均為本領(lǐng)域熟知且常用。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增反應(yīng)"指用于倍增核酸靶序列拷貝的任何體外方法。這類(lèi)方法包括但 不限于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、DNA連接酶鏈反應(yīng)（參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 683, 195和4, 683, 202 ; 《PCR方案：方法和應(yīng)用指南》(Innis等編，1990))、（LCR)、QBeta RNA復(fù)制酶、和基于RNA轉(zhuǎn) 錄（如TAS和3SR)的擴(kuò)增反應(yīng)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它反應(yīng)。
[0043] "擴(kuò)增"是指將溶解置于足以進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增的條件下的步驟（如果反應(yīng)的所有 組分是完整的）。擴(kuò)增反應(yīng)的組分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù) 語(yǔ)"擴(kuò)增"一般是指靶核酸的"指數(shù)"增長(zhǎng)。然而，本文所用的"擴(kuò)增"也可指核酸的選擇靶 序列數(shù)量的線性增長(zhǎng)，如由循環(huán)測(cè)序所得。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增反應(yīng)混合物"是指包含用于擴(kuò)增靶核酸的各種試劑的水性溶液。這些 試劑包括酶、各種緩沖劑、鹽、擴(kuò)增引物、靶核酸和三磷酸核苷。擴(kuò)增反應(yīng)混合物還可包含穩(wěn) 定劑和其它添加劑以優(yōu)化效率和特異性。根據(jù)上下文，混合物還可以是完整或不完整的擴(kuò) 增反應(yīng)混合物。
[0045] "聚合酶鏈反應(yīng)"或"PCR"是指靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子序列以等比級(jí)數(shù)擴(kuò) 增的一種方法。PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 683, 195和 4, 683, 202 ;和《PCR方案：方法和應(yīng)用指南》，Innis等編，1990。示例性PCR反應(yīng)條件一般 包括兩個(gè)或三個(gè)步驟循環(huán)。兩步驟循環(huán)具有變性步驟，之后是雜交/延長(zhǎng)步驟。三步驟循 環(huán)包括變性步驟，之后是雜交步驟，之后是分開(kāi)的