專利名稱：用于檢測活細胞活性的裝置和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明一般涉及細胞檢測，并且更具體地，涉及使用成像傳感器的神 經(jīng)元活性的熒光檢測，并且涉及游動細胞類型的細胞活性的光學檢測。
背景技術(shù)：
細胞學是涉及細胞的形成、結(jié)構(gòu)和功能研究的生物學的一個分支。當 在實驗室環(huán)境中應用時，科學家或其他醫(yī)學專業(yè)人員研究細胞，例如，確 定細胞的機能或進行患者病癥的醫(yī)學診斷。
對微小生物樣品例如培養(yǎng)的細胞的觀察典型地通過顯微鏡進行。當記 錄顯微圖像時，使用安裝在顯微鏡上的照相機或攝像機。另外，尤其是如 果必須保持樣品的溫度和濕度不變，則可能需要接近顯微鏡位置安裝或安 裝在顯微鏡位置上的其它設備。這樣的安排可能昂貴并且復雜。
已經(jīng)開發(fā)了各種神經(jīng)電子器件用于同時監(jiān)測少量細胞的電活性。通常， 這些使用了具有細胞外微電路電極陣列的動作電位的細胞外記錄；然而， 許多涉及了細胞間微電極的使用。神經(jīng)元由穿透細胞壁的微米-尺寸電極所 刺穿。由創(chuàng)傷所導致的細胞死亡通常在電極插入的幾個小時之內(nèi)。這些方 法還限制在不能將它們擴展到非常大的陣列。
在美國專利公布2004/0219184中公開的神經(jīng)電子器件依賴于用于監(jiān)測 神經(jīng)網(wǎng)絡活性的處于細胞和檢測器之間的靜電耦合；由此將所述專利的全
部公開內(nèi)容通過引用而結(jié)合在此。
此外，在美國專利號4,401,755、 4,985,353、 5,462,856、 5,919,646、 6,631,331、 6,770,449、 6,778,724和6,913,877中一般描述了各種檢測和操作方法和/或診斷工具；由此將所述專利的全部公開內(nèi)容通過引用而結(jié)合在 此。
因而，本發(fā)明的目的是提供用于有效檢測細胞活性的裝置、系統(tǒng)和方 法，而不用復雜而昂貴的光學元件。
發(fā)明概述
一般地，本發(fā)明涉及用于傳感位置緊密接近成像傳感器的活細胞的神 經(jīng)元活性的裝置、系統(tǒng)和方法。對細胞進行處理，使得它們將響應刺激而
發(fā)熒光或發(fā)光。在一個實施方案中，使用的細胞是神經(jīng)元；然而，其它細 胞材料是預期的，并且在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明超越現(xiàn)有技術(shù)的一個 優(yōu)點在于，在觀察的培養(yǎng)基和檢測器之間沒有光學透鏡。也沒有用于調(diào)整 光的路徑的反射鏡。在檢測器陣列和通過該陣列傳感的區(qū)域之間存在一一 對應。
在一個方面中，本發(fā)明涉及用于檢測細胞活性的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用 于接收布置在成像檢測器之上或附近的細胞材料的設備。用于接收細胞材 料的設備可以包括用于將細胞材料與成像檢測器隔離的保護層和/或金剛 石狀碳層。在各種實施方案中，成像檢測器是傳感器或傳感器區(qū)域的陣列， 并且可以包括電荷耦合器件(CCD)、互補金屬-氧化物半導體器件(CMOS)、 電荷注入器件(CD)、攝像機、二極管陣列或類似的器件。該系統(tǒng)還可以包 括用于收集和處理由該系統(tǒng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的處理器、用于儲存所述數(shù)據(jù)的存 儲器、以及用于顯示該數(shù)據(jù)的設備。
所述系統(tǒng)還可以包括光源，例如，諸如激光器、燈(例如白熾的、鹵素 的或熒光的)、或發(fā)光二極管。光源可以提供處于各種波長或多重波長的光。 光源還可以包括電源；濾波器，例如陷波濾波器或二向色濾波器；以及用 于例如將通過光源供給的光束聚焦或校準的透鏡。
在各種實施方案中，所述系統(tǒng)包括用于操作和/或處理細胞材料的設 備。例如，所述系統(tǒng)可以包括用于向細胞材料的環(huán)境引入氣體的設備，或 用于從細胞材料的環(huán)境取樣用于例如毒素的測試的設備。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種檢測細胞活性的方法。該方法包括 下列步驟提供這樣的波長的光，所述波長的光適于從例如神經(jīng)元細胞體中的雙離子化鈣離子((^++)追蹤染料刺激熒光發(fā)射；收集發(fā)射的熒光的至
少一部分；關(guān)于傳感器定位活化的神經(jīng)元；以及表征檢測信號的時間 (temporal)和/或振幅。
在一個實施方案中，發(fā)射的光的收集是通過在近場中直接位于細胞以 下的光-傳感位點(像素)的陣列實現(xiàn)的，而不需要任何的光學傳遞組件，例 如透鏡或反射鏡。
在各種實施方案中，可以檢測可能位于檢測器的頂部之上，或在緊密 接近成像檢測器的光亮的支架盤的下垂(lop)上的任意細胞過程。另外，可 以將細胞材料摻雜，或以別的方式處理。例如， 一些神經(jīng)元可以用一種追 蹤鈣或鉀離子的熒光物質(zhì)處理，或該材料可以用用于離子追蹤的電壓-敏感 染料、用于追蹤細胞離子通道或活細胞中離子運動的光子-發(fā)射化合物處 理。
通過參考下列描述和附圖，這里公開的本發(fā)明的這些和其它目的，連 同優(yōu)點和特征將變得明顯。此外，應當理解的是，這里描述的各種實施方 案的特征不是相互排斥的，而是可以以各種組合和排列而存在的。
附圖簡述
在附圖中，同樣的參考標記在全部不同的視圖中通常是指相同的部分。 另外，附圖不必成比例、而重點一般是用于舉例說明本發(fā)明的原則。在下 列描述中，通過參考下列附圖描述本發(fā)明的各種實施方案，其中


圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的用于檢測細胞活性的器件的示意 性正視圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的用于檢測細胞活性的整個系統(tǒng)的 示意性表示；
圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的用于檢測細胞活性的器件的一部 分示意性正視圖；和
圖4是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的檢測細胞活性的方法的流程圖。
發(fā)明詳述以下描述本發(fā)明的實施方案。然而，清楚指出的是，本發(fā)明不限制于 這些實施方案，而是意圖在于，還包括對于本領域技術(shù)人員顯然的變化、 更改和等價物。例如，通過參考使用某些染料和熒光的細胞材料測量神經(jīng) 元活性而典型描述這里公開的裝置、系統(tǒng)和方法；然而，清楚指出的是， 可以用其它類型的細胞材料、染料和光源來實施本發(fā)明。
如圖1中所示，將神經(jīng)元(ioo)生長或放置在成像檢測器或傳感器(ioi)
的頂部上，而沒有任何的居間透鏡或反射鏡、光纖或任何其它類型的光學 中繼系統(tǒng)。裝配成像傳感器，使得它在其整個操作中不損傷神經(jīng)元。例如，
可以在神經(jīng)元和成像傳感器之間放置惰性保護層(102)和金剛石狀碳層 (111)。惰性保護層和金剛石狀碳層的實例在美國專利公布2004/0219184
中有描述。
在細胞培育氣氛(106)中，在液態(tài)細胞培養(yǎng)營養(yǎng)浴(105)中的細胞生長培 養(yǎng)基(104)中生長神經(jīng)元。所述營養(yǎng)浴和氣氛是封裝的(103)并且由外部氣體 源通過端口(107)以及外部液體源通過端口(108)所供給?？梢酝ㄟ^任意必要 的管道或類似的運輸設備將外部氣體和液體源遞送到適當?shù)亩丝?。該系統(tǒng) 還包括細胞液體排放口(109)、細胞氣氛開關(guān)(110)和用于向細胞材料引入信 號的設備(120)。
當動作電位穿過細胞體傳播時，產(chǎn)生熒光。 一些光將由成像傳感器檢 測，表明了神經(jīng)元活性的存在。應當指出，這里所述的技術(shù)使用了熒光發(fā) 射光的光學檢測，而決不依靠靜電耦合。
成像檢測器由可以傳感光子的傳感位點或像素的陣列組成。這樣的器 件可以是CCD、 CMOS有源像素傳感器，或適于可見的或近紅外的成像 的具有傳感位點陣列的任意其它器件。由于光子緊密接近成像傳感器發(fā) 射，因此它們在近場中傳播。
圖2描繪了一個優(yōu)選實施方案的整個系統(tǒng)布局圖，包括成像器件和輔 助元件?？梢栽谄渌鼩怏w(210)和液體(220)中將培育氣氛和營養(yǎng)流體混合。 這樣，可以將所述器件用于測試毒素或液體或氣體的不同化學藥品對處于 培養(yǎng)下的細胞的影響。可通過傳感器陣列檢測的細胞行為上的變化將顯示 對引入的化學藥品的反應。該系統(tǒng)包括有助于用在此系統(tǒng)中的各種氣體和 液體的引入、移出和監(jiān)測的必要的閥和管件。下列描述是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的一個實施方案的操作的一般描述。在 操作中，以標準方式使用成像器件(即，在需要時，將成像器的殘留圖像清 除，并且將成像器以其中它收集光子的曝光模式設定)；細胞以一些方式受
刺激或它們自-刺激，從而發(fā)光；以及將收集的光子轉(zhuǎn)化為數(shù)字形式。
在一個具體實施方案中，成像器是首先被清除了任何累積電荷的 CCD。應當將它的鐘波形設定為積分模式，其中光子在像素阱(pixel well) 中被轉(zhuǎn)化為光電子。施加細胞刺激，熒光-刺激的輻射將照射該器件，并且 將發(fā)生曝光。在一段時期以后，曝光將終止，并且以標準方式讀取CCD。 得到的圖像將顯示已經(jīng)出現(xiàn)熒光的亮區(qū)域。
可以得到一系列圖像，并且各種圖像之間的差異將說明細胞活性上的 變化。這類似于檢査連續(xù)的照片以辨別變化， 一種在許多不同科學領域中 長期使用的技術(shù)。例如，在20世紀早期，Henrietta Leavitt使用此技術(shù)來 發(fā)現(xiàn)附近星系中的變星。通過測量在亮度上變化的恒星的亮度，并且制作 它們隨時間的位置和亮度變化表，她能夠為超過1000顆變星分類。
本發(fā)明的各種實施方案包括使用來自Invitrogen(卡爾斯巴德，CA)的以 氟-3染料形式的離子指示熒光染料。這是一種鈣離子追蹤染料，其由結(jié)合 到雙離子化鈣離子(Ca—)的抗體組成。本領域普通技術(shù)人員將理解的是， 在本發(fā)明的上下文中，還可以使用以相同的一般方式起作用的其它的離 子、pH或電壓指示染料?？梢詫ι窠?jīng)元施加動作電位剌激信號(112)。在 神經(jīng)元將動作電位沿它的細胞體傳導到突觸時，Ca^離子郁滯在動作電位 將跨越鄰近突觸的細胞體的區(qū)域中。通過用標稱約490 nm的適當波長的 光照射細胞培養(yǎng)基，將由Ca^離子發(fā)射波長約505至約535 nm、峰值約 515nm的光。g卩，該515 nm的光將指示已經(jīng)發(fā)放的神經(jīng)元的位置。可以 通過光濾波器的放置來將此515 nm的光與490 nm的光區(qū)分，所述光濾波 器阻塞500nm以下的光，而透射500 nm以上的光。在此實施方案中，應 當將此濾波片放置在成像檢測器(101)(在此情形中，CCD)和保護層(102) 之間。從神經(jīng)細胞的底部至成像傳感器的頂部的總距離應當小于約1 mm(參見圖3)。圖4在流程圖中說明了上述過程。
在類似于剛剛描述的實施方案的一個備選實施方案中，沒有使用光濾 波器。代替地，直接在細胞以下的像素中檢測到的來自刺激細胞的稍微提高的光信號將指示神經(jīng)信號已經(jīng)在陣列中的何處通過。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，電壓-活化的染料可以代替熒光染料使 用。電壓-活化的染料響應于電壓中的變化并且發(fā)射光。可以將電壓-敏感 染料注入到細胞中，或通過營養(yǎng)流體浴引入。當動作電位跨越處于檢測下 的單個的神經(jīng)元傳播時，將會由染料發(fā)射光。將由活化的連續(xù)的神經(jīng)元類 似地發(fā)射光。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，可以使用除神經(jīng)元之外的細胞類型。 將處理這些細胞，使得它們將響應于刺激或沒有刺激而發(fā)熒光或發(fā)射其它 信號。該器件將允許系統(tǒng)的使用者(例如，科學家)迅速建立并量化化合物 對正在被研究的細胞的代謝影響?？梢允褂玫募毎ɡ缧募〖毎?、內(nèi) 皮細胞、上皮細胞和生殖細胞。
本發(fā)明的另一個實施方案將利用游動細胞類型例如肌肉細胞。 一個或 多個細胞的動態(tài)運動將被用作代謝活性的指示劑。細胞運動的檢測可以通 過亮場、熒光或其它細胞照射方式來進行。
在前述實施方案中，可以將CCD用于傳感直接放置在像素(芯片傳感 器)的頂部上的心肌細胞的收縮比和振幅?？梢酝ㄟ^收縮比率和振幅上的變 化(增加或減少)來傳感毒劑。用于誘導心細胞收縮的刺激可以是，但不限 于，單獨或與其它刺激組合的電場刺激、化學刺激或增加的細胞外的鉀。
收縮的傳感可以通過在用心細胞綴合的CCD上發(fā)光(亮場照射)來實現(xiàn)。 CCD將作為用于記錄刺激-誘導的細胞收縮的照相機。除CCD傳感器以外， 還預期可以放置在芯片上的其它傳感器，例如納米線或可以測量由肌細胞 或其它細胞產(chǎn)生的動作電位的其它電壓敏感器件。
上述光源可以是任意的亮場直流電動力的發(fā)光器。此技術(shù)超越其它技 術(shù)的一個優(yōu)點在于，不需要使用為了解析毒素對離子通道的影響的熒光或 靜電檢測方法。由于本發(fā)明不需要熒光，因此不需要熒光光源以及用于僅 看到由染料發(fā)射的熒光的光濾波器。此外，對于靜電檢測需要的消除去除 了對于對神經(jīng)或肌肉細胞放電(動作電位)敏感的芯片的需求。本發(fā)明可以 使用單個的肌細胞或肌細胞的片。在缺乏和存在毒素的兩種情況下都可以 分析在特定的刺激頻率下的收縮數(shù)據(jù)，例如比率和振幅。
已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些實施方案，對于本領域的普通技術(shù)人員將顯然的是，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以使用結(jié)合了這里公 開的概念的其它實施方案。所述的實施方案在各個方面上都應當認為僅是 說明性的，而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測活細胞活性的裝置，所述裝置包括固體支架，所述固體支架具有a)細胞生長培養(yǎng)基層；b)惰性保護層；c)光源；和d)檢測器，e)用于收集和處理由所述系統(tǒng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的處理器；f)用于儲存所述數(shù)據(jù)的存儲設備；和g)用于顯示所述數(shù)據(jù)的顯示設備，其中所述活性由所述裝置檢測，而不用任何的光學傳遞組件例如透鏡或反射鏡。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述支架被封裝，并且能夠包含 液體生長培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述支架具有至少一個入口/出口 端口。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述裝置還包括插入所述細胞生長培 養(yǎng)基層a)和所述惰性保護層b)之間的金剛石狀碳的層d)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測器能夠檢測光發(fā)射或透 射、電壓變化、以及細胞運動。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其中所述檢測器選自由下列組成的組 電荷耦合器件(CCD)、互補金屬氧化物半導體器件(CMOS)、電荷注入器件 (CD)和二極管陣列，或類似的固態(tài)光子檢測器件。
7. —種用于檢測活細胞活性的裝置，所述裝置包括成像傳感器(101)、 惰性保護層(102)、封裝支架(103)、細胞生長培養(yǎng)基(104)、液體細胞培育 營養(yǎng)浴(105)、細胞培育氣氛(106)、第一端口(107)和第二端口(108)、細胞 液體排放口(109)、細胞氣氛開關(guān)(IIO)、光源(130)、以及用于向細胞材料 引入信號的設備(120)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，所述裝置還包括插入所述細胞生長培養(yǎng)基層(104)和所述惰性保護層(102)之間的金剛石狀碳層(111)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，所述裝置還包括插入所述成像傳感器 (101)和待檢測的細胞(100)之間的光濾波器(300)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，所述裝置還包括連接到氣體混合閥 (210)的第一氣體端口(205)，所述氣體混合閥(210)還連接到第二氣體端口 (200)，所述氣體混合閥出口被連接到氣體入口閥(215)然后連接到氣體入口 端口(107)，所述裝置還具有連通到裝置(103)外部的連接到出口閥(220)的 氣體出口端口(IIO)，另外，所述裝置包括連接到液體混合閥(235)的第一液 體端口(230)，液體混合閥(235)還連接到第二液體端口(225)，所述液體混 合閥出口被連接到液體入口閥(240)然后連接到液體入口端口(108),所述裝 置還具有連通到裝置(103)外部的連接到液體出口閥(245)的液體出口端口 (109)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，所述裝置還包括連通到裝置(103)外 部的第一氣體端口 ，所述第一氣體端口通過濾器連接到流體入口端口 (109)，所述裝置還具有連通到裝置(103)外部的氣體出口端口(107)，所述 裝置還具有液體出口端口(108)。
12. —種用于檢測活細胞中活性的方法，所述方法包括下列步驟a) 將關(guān)注的細胞放入到權(quán)利要求1的裝置中；b) 允許所述關(guān)注的細胞吸收熒光指示劑染料達充分的時間；c) 使所述關(guān)注的細胞暴露于處于對應于所述指示劑染料的激發(fā)波長的 波長的光源；d) 檢測處于對應于所述指示劑染料的發(fā)射波長的波長的發(fā)熒光的光發(fā) 射；和e) 分析發(fā)射的光的量。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述指示劑染料為氟-3或氟-4， 并且所述激發(fā)波長在490 nm和510 nm之間，以及所述發(fā)射波長在約505 nm和535 nm之間，優(yōu)選約515nm。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述指示劑染料為鈣指示劑染料。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鈣指示劑染料選自由氟衍生物(fluo derivative)染料、呋喃衍生物(fora derivative)染料、吲哚衍生物 (indoderivative)染料、rhod-2、鈣綠和quin-2組成的組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述指示劑染料是離子指示劑 染料。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述指示劑染料是電壓或pH 指示劑染料。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述關(guān)注的細胞是神經(jīng)元細胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述關(guān)注的細胞是非-神經(jīng)元 細胞。
20. —種用于檢測活細胞中活性的方法，所述方法包括下列步驟a) 將關(guān)注的細胞放入到權(quán)利要求1的裝置中；b) 使關(guān)注的細胞暴露于光源；c) 在特定的時間間隔拍攝所述關(guān)注的細胞的圖像，并且將所述圖像儲 存用于隨后的分析；和d) 分析所述圖像中的區(qū)別。
全文摘要
一種用于檢測活細胞活性的裝置，所述裝置包括用于接收細胞(100)的細胞生長培養(yǎng)基層(104)和成像傳感器(101)例如CCD陣列，其中所述細胞生長培養(yǎng)基層和所述成像傳感器僅通過惰性保護層(102)和任選的金剛石狀碳層(111)而相互分離。細胞可以由熒光染料例如鈣、離子、電壓或pH指示劑染料染色。在用光源(130)照射時，細胞發(fā)射熒光，所述熒光直接由成像傳感器檢測，而不需任何的光學傳遞元件例如透鏡或反射鏡?？梢詫⒃撗b置封入提供有氣體和液體端口(107，108，109)的外殼(103)中。此外，該裝置可以包括用于將刺激信號應用到細胞的設備(120)。
文檔編號G01N21/64GK101310173SQ200680041273
公開日2008年11月19日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者凱文·T·C·吉姆, 凱文·休·金, 布里安·延, 漢克·吳 申請人:細胞生物工程公司