專利名稱：通過PARP1基因、CYP1A1基因和ERCC2基因的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行肺癌易感性檢測(cè)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢糖用的試劑盒，尤其是一種檢測(cè)肺痛易感性的試劑盒，通過同時(shí)檢測(cè)多 聚ADP核糖轉(zhuǎn)移瞎家族成員1 (poly(ADP-ribose) polymerase family, member 1 ， PARP1 ，又簡(jiǎn)寫為ADPRT)、 細(xì)胞色素P4501A1嗨基閃(cytochrome P450, family 1， subfamilyA， polypeptide 1, CYPlAl)和切除修復(fù)復(fù) 合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2 ) 的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。背錄技術(shù)原發(fā)性支氣管肺癌，簡(jiǎn)稱肺痛，為當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫癯之一，是一種嚴(yán)重威脅人類健康和 生命的疾病。腫癯細(xì)胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺激性咳嗽、瘐 中帶血等呼吸道癥狀，病情進(jìn)展速度與細(xì)胞的生物特性有關(guān)。半個(gè)世紀(jì)以來，世界各國(guó)肺痛的發(fā)病率和病死率都有明顯塌高趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報(bào)吿: 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%，其中肺癌占惡性腫癯死亡的19%，居 惡性腫癍死因的第一位。我國(guó)1990~1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫癯死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1訴0 1969年間為197.87/10萬，1970~1979年間上升到219.10/10萬.這在全世界也是罕見的。英國(guó) 著名腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)言如果我國(guó)不及時(shí)控制吸煙和空氣污染，到2025年我國(guó)每年肺痛將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國(guó)。病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確。一致認(rèn)為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動(dòng)吸煙和被動(dòng) 吸煙)②職業(yè)致癌因子，己被確認(rèn)的致人類肺痛的職業(yè)因素包括石棉、無機(jī)砷化合物、二氣甲瞎、鉻及 其化合物、錁、氡、芥子氣、氣乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染);.④電離輻射⑤飲食與營(yíng)養(yǎng)，美國(guó)紐約和芝加哥開展的前瞎性人群觀察的結(jié)果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入紫與十兒年后痛癥的發(fā)生雖負(fù)相關(guān)，其中雖突出的是肺痛⑥其他，美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)將結(jié)核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺痛的危險(xiǎn)性是 正常人群的10倍。其主要組織學(xué)類型是腺癌，此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲每)、機(jī)體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對(duì)肺痛的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些痛基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。已經(jīng)證明的幾個(gè)癌基因 家族包括引起突變的旭族、放大基因的myc族、C>erB2、機(jī)制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等?；鹆垦芯勘砻鰿-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細(xì)胞肺癌中均有過度表達(dá)。 非小細(xì)胞肺癌中則常可見ras族基因的過度表達(dá)。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)，SNP(single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%。這些基閎組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異.PARP1基因位于第1號(hào)染色體lq41"q42位置，全長(zhǎng)47.31*, mRNA全長(zhǎng)3861bp，共有23個(gè)外顯子， 編碼1015氨基酸的多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶蛋白。這種酶通過聚ADP核糖基化反應(yīng)條正多種核蛋白.這種 修正以DNA為基礎(chǔ)，參與多種重要的細(xì)胞活動(dòng)，例如分化，增殖，腫癯轉(zhuǎn)移等，同時(shí)也參與分子水平 的活動(dòng)，例如修復(fù)DNA受損的細(xì)胞等等。PARP1的主要功能通常被描述為3個(gè)方面1. DNA修復(fù)功能 (BER〉 2.抑制受損DNA的轉(zhuǎn)錄；3.耗盡細(xì)胞中的能^;,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡4.參與部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控. 這些功能可以修復(fù)細(xì)胞中受損的DNA,抑制破損DNA的轉(zhuǎn)錄，甚至殺死無法修復(fù)的細(xì)胞，達(dá)到抑制痛癥 發(fā)生的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PARP1功能缺失會(huì)提髙乳腺痛，肺癌等癌癥的發(fā)病率。rall36410是位于第l號(hào) 染色體上PARP1基因上的一個(gè)T/C多態(tài)，引起PARP1基因編碼的蛋白第762個(gè)氨基酸由Val變?yōu)锳la.
NCBI公布的世界人群中的該多態(tài)的頻率分布.T占0,抑8， C占0.192左右，雜合度為0.311*分子生物學(xué) 研究表明，PARP1上762號(hào)氨基酸由Val轉(zhuǎn)化為Ala，降低了酶的活性，導(dǎo)致多種痛癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升商。 尤樣本的中國(guó)人群的關(guān)聯(lián)分析顯示，該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象是中國(guó)人群中重要的肺痛影響因素之一。CYP1A1基因位于第15號(hào)染色體I5q22i24位置，全長(zhǎng)6.0kb, mRNA全長(zhǎng)260lbp，共有7個(gè)外顯子， 編碼5l3個(gè)氨基酸的細(xì)胞色素P450lAl。 P450lAl是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYPIAI能將多種環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳雖化合物轉(zhuǎn) 化為細(xì)胞毒素或其他致痛物質(zhì)，從而増加痛癥發(fā)生的危險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外的眾多研究顯示CYPIAI的多態(tài)與野生 型相比有更高的酶接觸反應(yīng)活性和可誘導(dǎo)性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道痛、前列腺痛等疾病的 危險(xiǎn)度。細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是細(xì)胞內(nèi)^耍的I相代謝嗨，在致癌物的活化和解毒過程中起著重 耍的作用。P450lAl(CYPlAl)是活化多環(huán)芳妤類致癌物的主耍酶類。CYPIAI作為一種微神經(jīng)元體細(xì)胞瞎 與一些致癌物質(zhì)的生物激活有關(guān)，例如benzo[a]pyrene。同時(shí)，CYPIAI易于被TCDD和多環(huán)的芳香族化 合物所誘變，包括3-甲基膽葸等實(shí)驗(yàn)室用致癌物質(zhì)。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CYPIAI的表達(dá)與芳基碳敏化 合物受體(AhR)和Arnt (A欣NuclearT咖slocator)的激動(dòng)劑，以及USFl (Upstream Stimulatoiy Factor) 的拮抗劑有關(guān)。同時(shí)，CYPIAI通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動(dòng)。rel048943是位于CYPIAI基 閃上的一個(gè)A/G多態(tài)，位于第7外顯子462號(hào)氨基酸由lie轉(zhuǎn)化為Val。目前NCBI公布的世界人口頻率 A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1A1 He462Val位點(diǎn)VaIVal和Vallle基 因型在肺痛病例組中的頻率明顯高于對(duì)照組，在女性中風(fēng)險(xiǎn)度尤其突出?；诙鄠€(gè)中國(guó)人群肺癌發(fā)病與 CYPlAlIle462Va!位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析研究，上千例肺癌個(gè)體與健康對(duì)照個(gè)體的分析，顯示CYP1A1 Ite462Val 這種位于嗨蛋白的血紅素結(jié)合區(qū)的變異，是中國(guó)人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一，在女性中尤為突出. 酶動(dòng)力學(xué)研究表明,3種基因型表達(dá)的嗨活性存在差異。Wl/Val活化毒物的能力最強(qiáng)，He/Val次之,而He/Ile 最弱。研，顯示，CYPlAlValVal基因型是中國(guó)人群中重要的肺痛遺傳易感因素之一。ERCC2,位于第19號(hào)染色體19ql3,3位置，共有23個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)19.0kb, mRNA全長(zhǎng)2355bp, 編碼含761個(gè)氨基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復(fù)，它可識(shí)別與修復(fù)結(jié) 構(gòu)無關(guān)的大范圍的損傷，如大的加合物和胸腺哦啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物BTF2/TFIIH的一 個(gè)組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，并且屬于RAD3/XPD解旋瞎亞家族，ERCC2的 功能缺失導(dǎo)致基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物不能正確識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)，從而使堿基切除條復(fù)無法正確進(jìn)行，導(dǎo) 致DNA上的致痛損傷積累。ERCC2基閑的突變或者失活可能導(dǎo)致的疾病包括癌癥、著色性干皮病、毛 發(fā)琉營(yíng)養(yǎng)不良、柯凱因氏綜合癥。rsl799793是位于第19號(hào)染色體ERCC2基因第十號(hào)外顯子段Asp312Asn 的G/A多態(tài)。世界人群中的頻率約為G:A4778:0.222,中國(guó)人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多 .項(xiàng)研究表明，該位點(diǎn)的多態(tài)會(huì)導(dǎo)致ERCC2參與構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的性能發(fā)生弱化，從而使得對(duì)DNA 損傷修復(fù)的能力下降，轉(zhuǎn)錄因子的能力也同時(shí)發(fā)生下降，導(dǎo)致一系列諸如肺痛，前列腺癌等疾病的發(fā)生。 ERCC2Asp312Asn多態(tài)性與肺癌特別是肺鱗癌發(fā)生有顯著關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象被認(rèn)為是中國(guó)人群中肺 癌遺傳易感因素之一。國(guó)內(nèi)外的大景的關(guān)聯(lián)分析表明，PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為C時(shí)肺痛的發(fā)生幾率 增加CYP1A1基因上rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為G時(shí)肺豳的發(fā)生兒率增加；ERCC2基因上rsl799793 號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為A時(shí)肺癌的發(fā)生幾率增加。這三個(gè)SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)肺痛的易感 性。發(fā)明內(nèi)容基于PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上 的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)肺癌的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)肺癌易 感性的試劑盒。該試劑盒包括檢淵PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè) CYP1/U基因上的rsl0幼943號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè)ERCC2基因上的rsl799793 號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、T叫酶、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定紫PCR反應(yīng)緩
沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)PARP1基閃上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出耙位點(diǎn)的DNA片 段.設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有S印ID NO: 1和2 所示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引 物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這 三對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)PARPl基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPlAl基因上的 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性 檢測(cè)出這三個(gè)SNPs位點(diǎn)肺癌易感基閑型的探針。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的，優(yōu)選 地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 7、 8承l(wèi) 9所示序列的T叫man探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成 技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這三條探針，所有可用于熒 光定量PCR檢測(cè)PARPl基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPlAl基岡上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2 基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 lul 10 X熒光定黹PCR反應(yīng)緩沖液， 0.1|U 25mM dNTP混合液， 0. 5^1 25mH MgCh溶液， 0.02|U (5units/pl) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(duì)(六條)各O. 225^1, 10fiM特異性熒光探針(三條)各0.25nl， 去離子水4. 28(il。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2ox:。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步爽l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組咖A。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測(cè)肺癌易感性的熒光定ttPCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和炎光探針:有義引物l:5'-TTTGCCATTCACTGTCTTGG -3，(SEQID NO:1) Tm值為58"C反義引物1:5，-ATCCTTGCTGCTATCATCA -3'(SEQID NO:2) Tm值為541C有義引物2:5'- GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT -3，(SEQID NO:3〉 Tm值為56lC反義引物2:5'-AGGATAGCCAGGAAGAGAAA -3'(SEQID NO:4) Tm值為58TC有義引物3:5'-ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3'(SEQID NO:5) Tm值為581C反義引物3:5'-TCAGGAAGCCCAGGAAAT -3，(SEQID NO:6) Tm.值為54匸熒光探針1:5'-CAGGCCAAGGCGGAAATGCT -3，(SEQID NO:7〉 Tm值為64"C 炎光探針2: 5， - TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3' (SEQ ID NO: 8) Tm值為64r熒光探針3: 5， _ TGCCCMCGAAGTGCTGCAG -3' (SEQ ID NO: 9) Tm值為64TC有義引物1,反義引物1和熒光探針1特異地針對(duì)檢測(cè)PARP1基閃上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性: 有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對(duì)檢測(cè)CYP1A1基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性有 義引物3，反義引物3和熒光探針3特異地針對(duì)檢測(cè)ERCC2基因上rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性。熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積lOpl,包含濃度為20ng/fil的DNA模板2jd、 ljil 10 X熒光定 PCR 反應(yīng)緩沖液、0. 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0.02(il (5units/|il) T叫DNA聚合,、 20jiM的有義引物1、 2和3各0. 225jil、 20pM的反義引物1、 2和3各0. 225jil、 lO)iM的熒光探針1、 2和 3各0.25fil,去離于水4. 28fil 。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C、 2分鐘，951C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 訴1C、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在旭I7900型熒光定景PCR儀上讀取樣品熒光紫， 步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針1最終的熒光信號(hào)明顯離于 正常對(duì)照,說明被檢搠DNA的PARP1基因上的rsl 136410號(hào)SNP位點(diǎn)基因荊攜帶有C型，為肺癌易感型 熒光探針2最終的熒光信號(hào)明顯髙于正常對(duì)照，說明被檢測(cè)DNA的CYP1A1基因上rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn) 基因型攜帶有G型，為肺痛易感型;熒光探針3雖終的熒光信號(hào)明顯布于正常對(duì)照，說明被檢擁DNA的ERCC2 基因上rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實(shí)施例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌的服務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項(xiàng)服務(wù)。 步驟l: DNA提取對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)is問巻調(diào)査表。依照取樣盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提， 步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢湖者DNA的PARP1基閃上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行熒光定承PCR檢豕j，確定這三個(gè)SNPs 位點(diǎn)的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌通過對(duì)被檢測(cè)者SNPs基肉型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和被檢測(cè)者個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告.基因 檢測(cè)報(bào)告詳細(xì)說明了被檢測(cè)者肺痛易感程度的高低以及患病的概率大小。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢擁者 的基因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)者肺痛遺傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)* 同時(shí)制定出針對(duì)于被檢擁者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等，并 為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。 序列表<iio>上海主健生物工程有限公司<120>通過PARP1基因、CYPlAl基因和ERCC2基因的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行肺痛易感性檢測(cè)的試劑盒<160> 9<210> 1 <211> 20 〈212>陽(yáng) <213>人l:序列〈220><223>引物 <400> 1tttgccattc actgtgttgg 20<210> 2 <211> 19 <212> DNA <213>人丄序列〈220><223>引物 <400> 2atccttgctg ctatcatca 19<210> 3 <211> 20 <212> DM <213>人工序列<220><223>引物 <400> 3gtgtt卿tg ag助ggtgat 20 <210> 4 <211> 20 <212>腿 <213>人工序列<220><223>引物 <400> 4aggatagcca gg卿agaaa. 20<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人l:序列<2加><223>引物 <柳> 5atcaaag卿cagacgagca 20<210> 6 <211> 18 <212> DNA <213>人..L:序列<2加><223>引物 <衡6tcaggaagcc c鄉(xiāng)aaat 18<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探針 <400> 7caggccaagg cggaaatgct<210> 8<211> 20 <212>咖A <213>人l:序列<220><223>探針 <柳> 8tatcggtgag accgttgccc<210> 9 <211〉 20 <212> DM <213>人工序列<220〉<223>探針 <400> 9tgccc咖ga agtgctgcag
權(quán)利要求
1. —種檢測(cè)肺痛易感性的試劑盒，包括同時(shí)檢測(cè)PARP1基閎上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI 基因上的rsl0幼943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探 針、Taq解、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)PARP1基因上的 rsl 136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn) 而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含PARPl基閔上的rsll36410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI基因上的rsl048943號(hào)SNP 位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)PARP1基因上的 rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI基因上的rsl0幼943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn) 而設(shè)計(jì)，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這三個(gè)SNPs.位點(diǎn)肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利耍求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQh)NO: l和2所 示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物 對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 7、 8 和9所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利耍求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括lul IOX熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液，0. ljil 25mM dNTP泡合液，CL5nl 25mM MgCl2溶液，0.02|il (5units/(il) T叫DNA聚合,， 20jiM特異性引物對(duì)(六條)各0.225ji1, 10nM特異性熒光探針(三條)各0.25jxl，去離子水4.28(il。本試劑盒供一人份檢擁應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-加ic。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)PARP1基因上的rs1136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上rs1048943號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rs1799793號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測(cè)分析個(gè)體的PARP1基因、CYP1A1基因和ERCC2基因上SNPs位點(diǎn)基因攜帶型來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。
文檔編號(hào)G01N21/00GK101144773SQ20061011609
公開日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司