專利名稱：液體色譜洗出液的分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類的分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
含有與載體蛋白相偶聯(lián)的莢膜糖的免疫原為本領(lǐng)域所熟知。這種偶聯(lián)將不依賴于T細(xì)胞的抗原轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性抗原，從而提高了記憶應(yīng)答并產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，原型偶聯(lián)物疫苗用于b型流感嗜血桿菌(Hib)[例如，參見參考文獻(xiàn)1的第14章]。自Hib疫苗以來，開發(fā)了保護(hù)性的抗腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的偶聯(lián)糖疫苗。感興趣的偶聯(lián)疫苗涉及的其它微生物有無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B族鏈球菌)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
當(dāng)疫苗和其它生物制品中含有糖類時(shí)，之后的調(diào)節(jié)通常取決于它們的特性。用于糖類定型的常規(guī)技術(shù)是陰離子色譜法，尤其是高效陰離子交換色譜(HPAEC)，它通常帶有脈沖電流檢測(PAD)[2，1]。合適的HPAEC-PAD系統(tǒng)由DionexTMCorporation(Sunnyvale，CA)提供，例如BioLCTM系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可定量分析混合物中的各種糖類，不需要進(jìn)行衍生化(derivatisation)或預(yù)分析分離，且混合糖的分析可用于表征糖類。
當(dāng)分析糖類時(shí)，HPAEC柱的洗出液通常用脈沖電流檢測器(PAD)分析，即檢測是基于電流的。在合適的(高)pH時(shí)，通過施加正電勢可在電極表面電催化氧化碳水化合物。用這種方法產(chǎn)生的電流與碳水化合物濃度成比例，從而可通過電流分析法檢測并量化碳水化合物。與簡單的電流檢測相比，PAD技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)檢測電勢中加入了清除電勢和再生電勢的短脈沖，從而避免了分析物的氧化產(chǎn)物污染電極帶來的問題。除了用于HPAEC分析，PAD也可用于分析HP陽離子交換色譜[2]和其它HPLC分離。
為獲得其它分析信息，尤其是當(dāng)處理無電流分析活性的化合物和具有化學(xué)修飾的化合物時(shí)，發(fā)明人決定通過光譜方法分析洗出液。不幸的是，HPAEC分析莢膜糖時(shí)采用的高pH使洗出液中出現(xiàn)了氫氧化物離子，而這些離子的高吸收(尤其在紫外區(qū)域)使加入光譜分析變得不容易。用微膜化學(xué)抑制劑裝置能除去氫氧化物離子，但通常用作洗脫莢膜糖的‘推進(jìn)劑’(pushing agent)的乙酸鹽會(huì)被抑制劑轉(zhuǎn)變成高吸收劑乙酸，因此會(huì)帶來新的問題。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供另一種改進(jìn)的用陰離子色譜法表征糖類的方法和系統(tǒng)。具體地說，其目的是克服由于存在氫氧化物離子或在氫氧化物離子被轉(zhuǎn)化后存在乙酸而造成的對(duì)洗出液進(jìn)行光譜分析中的困難。
發(fā)明概述為克服使用氫氧化物/乙酸鹽-基洗脫液造成的這些困難，發(fā)明人采用了兩種方法。首先，他們選擇使用不需要乙酸鹽推進(jìn)劑的較弱的陰離子交換載體。這種柱目前不被用于分析碳水化合物，而更常見用于分析大量無機(jī)酸和有機(jī)酸陰離子[3]。其次，他們選擇使用具有低光譜吸收的推進(jìn)劑。這兩種方法都能使光譜檢測與PAD檢測相結(jié)合。此外，它們還與常規(guī)HPAEC-PAD法兼容，并且即便當(dāng)不需要光譜檢測時(shí)它們也是有利的，尤其是它們能更好地分辨長鏈寡糖。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，電流檢測與光譜檢測偶聯(lián)，使得能使用這兩種方法。因此，本發(fā)明提供了一種分析液相色譜柱的洗出液的方法，其中所述洗出液用電流分析法和光譜法分析。本發(fā)明還提供了一種分析樣品的設(shè)備，其中所述設(shè)備包括(i)液相色譜柱，(ii)電流檢測器，和(iii)光譜檢測器，其中的兩個(gè)檢測器用來接收柱洗出液。
曾報(bào)道了單獨(dú)使用PAD或UV檢測來分析HPAEC柱的流出液[4]，但同時(shí)使用電流和光譜技術(shù)來分析同一種流出液是新的。使用這兩種檢測得出的信息優(yōu)于任何一種檢測方法單獨(dú)得出的信息，例如可見

圖1，一些峰在UV中的動(dòng)態(tài)范圍好于PAD，而一些峰在PAD中好于UV。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種從陰離子交換色譜柱洗脫莢膜糖分析物的方法，其中的分析物用含有除乙酸根和氫氧根之外的陰離子的洗脫液洗脫。所述洗脫液宜含有選自下組的陰離子硝酸根、氯離子、碳酸根和硼酸根。也可使用這些陰離子的鈉鹽。當(dāng)洗脫液呈堿性時(shí)(例如，pH＞9)該方法特別有用，如果使用氫氧化物離子的化學(xué)抑制劑則更有效，且這樣可以更好地分辨長鏈寡糖。此外，該方法特別適用于分析乙?；奶穷?。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種通過陰離子交換色譜法分析糖類的方法，其中的色譜法用容量小于50μeq(例如≤40μeq、≤30μeq、≤20μeq等)的柱進(jìn)行。使用低容量柱能快速洗脫且無需使用推進(jìn)劑。這樣不用生成乙酸就能使用氫氧化物抑制。通常將使用不含乙酸鹽的氫氧化物洗脫液，避免乙酸根離子對(duì)于分析乙?；奶穷愄貏e有用。低容量柱能更好地分辨長鏈寡糖。
一起使用本發(fā)明的第二和第三方面是有利的，即本發(fā)明提供了一種通過陰離子交換色譜法分析莢膜糖分析物的方法，其中的色譜法用容量低于50μeq的柱進(jìn)行，且其中從柱的洗脫用含有選自硝酸根離子和氯離子的離子的洗脫液進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明色譜方法的洗出液。本發(fā)明還提供了一種含有用本發(fā)明方法分析的物質(zhì)作為活性成分的藥物。具體地說，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，如疫苗，該組合物含有用本發(fā)明方法分析的細(xì)菌莢膜糖。
液相色譜柱本發(fā)明的第一方面用來分析液相色譜柱的流出液。該方面可用于各種液相色譜柱，但特別適用于高效液相色譜(HPLC)。本發(fā)明特別適用于分析用高效陰離子交換色譜(HPAEC)或高效陽離子交換色譜(HPCEC)分離的結(jié)果。
優(yōu)選的柱是那些自發(fā)保留糖類的柱，這樣就需要從柱上洗脫下糖類。從色譜柱上洗脫可以是等度洗脫或梯度洗脫。含有氫氧化鈉和/或乙酸鈉的洗脫液是糖類的HPAEC-PAD分析中通常使用的洗脫液。然而在本發(fā)明的第二個(gè)方面，使用了硝酸鹽和/或氯鹽洗脫液(通常為鈉鹽)，通?；旧喜淮嬖谌魏我宜猁}洗脫液。為從陰離子交換柱上洗脫分析物，洗脫液通常呈堿性，例如可使用pH＞8、＞9、＞10、＞11、＞12、＞13等的氫氧化物鹽(例如NaOH)以達(dá)到所需pH，且氫氧化物離子通常被用于陰離子交換洗脫液。
洗出液可進(jìn)行化學(xué)抑制氫氧化物離子，尤其是當(dāng)氫氧化物離子與使用的分析檢測技術(shù)相互干擾時(shí)。通?？墒褂梦⒛?micromembrane)抑制劑，如DionexTM的MMS產(chǎn)品?！甅MS III’產(chǎn)品采用連續(xù)化學(xué)抑制以提高分析物的電導(dǎo)率同時(shí)降低洗脫液的電導(dǎo)率，并能在使用等度洗脫或?qū)挐舛确秶鷥?nèi)的梯度洗脫進(jìn)行離子交換時(shí)直接進(jìn)行電導(dǎo)率檢測。當(dāng)洗脫液中含有乙酸根離子及產(chǎn)生的乙酸干擾所用分析檢測技術(shù)時(shí)宜避免使用從乙酸根離子產(chǎn)生乙酸的抑制劑。
用于本發(fā)明第一和第二方面的優(yōu)選的HPAEC柱是Dionex牌的“CarboPac”柱，如PA1[10μm直徑聚苯乙烯基質(zhì)，2％與二乙烯基苯交聯(lián)，與500nm MicroBead季銨官能化乳膠團(tuán)聚(5％交聯(lián))]、PA100、PA20、PA10[10μm直徑乙基乙烯基苯基質(zhì)，55％與二乙烯基苯交聯(lián)，與460nm MicroBead雙官能季銨離子團(tuán)聚(5％交聯(lián))]、PA200或MA1柱。優(yōu)選的HPCEC柱是同為Dionex牌的“IonPac”柱，包括CS10柱。
作為使用液相色譜法的一個(gè)替代，本發(fā)明的第一個(gè)方面也可用來分析毛細(xì)管電泳分離系統(tǒng)例如Beckman-Coulter P/ACE系統(tǒng)的流出液。
本發(fā)明的第三方面是離子容量小于50μeq(毫克當(dāng)量電荷)，例如＜40μeq、＜30μeq、＜20μeq等的陰離子交換柱。優(yōu)選的HPAEC柱是Dionex牌的氫氧化物選擇性“IonPacAS”柱，如AS11柱，該柱帶有烷醇季銨官能團(tuán)。當(dāng)以其2×250mm分析模式使用時(shí)，AS11柱的容量為11μeq，當(dāng)以4×250mm模式使用時(shí)其容量可增加到45μeq。低容量氫氧化物選擇柱是優(yōu)選的。
電流和光譜檢測本發(fā)明的第一個(gè)方面通過電流和光譜分析了液相色譜柱的洗出液。從柱子上洗脫的物質(zhì)可被分流，一部分通過電流分析，另一部分通過光譜分析?；蛘?，從柱子上洗脫的物質(zhì)可以不被分流先通過電流再通過光譜或者先通過光譜再通過電流連續(xù)分析。圖2和3例舉了這兩種不同的常規(guī)方法。當(dāng)采用連續(xù)分析時(shí)，優(yōu)選先進(jìn)行光譜檢測再進(jìn)行電流檢測，特別是當(dāng)光譜檢測相對(duì)于電流檢測無破壞性時(shí)。
電流檢測宜為脈沖電流檢測(PAD)。PAD中可采用各種波長[5]，包括圖4所示的任何曲線。優(yōu)選使用負(fù)電勢來清潔電極。圖4A的波形采用負(fù)電勢進(jìn)行電極清潔，這樣提高了長期再現(xiàn)性并降低了電極損耗。
用于電流檢測的電極優(yōu)選是金電極。
光譜檢測宜基于電磁輻射的吸收和/或發(fā)射，電磁輻射的波長宜在100nm和900nm之間(例如，波長為100-200nm、150-250nm、200-300nm、250-350nm、300-400nm、350-450nm、400-500nm、450-550nm、500-600nm、550-650nm、600-700nm、650-750nm、700-800nm、750-850nm、800-900nm)?？筛鶕?jù)要檢測的分析物選擇采用的光的波長。紫外(UV)吸收光譜法(例如，200nm)和可見光吸收光譜法是兩種特別優(yōu)選的分析糖類的方法。
作為電流檢測的一種替代方法，本發(fā)明可采用電導(dǎo)率檢測(包括抑制電導(dǎo)率檢測)。
分析物本發(fā)明用來分析液相色譜柱的洗出液。洗出液是樣品中一種或多種分析物的色譜分離結(jié)果。
本發(fā)明特別適用于分析糖類分析物。它們可以是多糖(例如聚合程度至少為10，例如20、30、40、50、60或更高)、寡糖(例如聚合程度從2到10)或是單糖。寡糖和單糖可以是母體多糖解聚和/或水解的結(jié)果，例如分析物可以是較大糖類的含糖片段。
優(yōu)選的糖類分析物是細(xì)菌糖類，尤其是細(xì)菌莢膜糖，例如腦膜炎奈瑟球菌(血清組A、B、C、W135或Y)、肺炎鏈球菌(血清型4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、無乳鏈球菌(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)(a、b、c、d、e或f型菌株)、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等的莢膜糖。其它糖類分析物包括葡聚糖(例如真菌的葡聚糖，如白色念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖，和真菌的莢膜糖，如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)的莢膜糖。
腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清組A的莢膜是(α1→6)-連接的N-乙酰-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清組B的莢膜是(α2→8)連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清組C的莢膜糖是(α2→9)連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清組W135 的糖類是由唾液酸-半乳糖二糖單元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]構(gòu)成的聚合物。腦膜炎奈瑟球菌血清組Y的糖類類似于血清組W135的糖類，但二糖重復(fù)單元用葡萄糖代替半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。b型流感嗜血菌(H.influenzae)的莢膜糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物[‘PRP’，(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)]。
除了可用于分析全長莢膜糖，本發(fā)明也可用于分析它們的寡糖片段。
其它優(yōu)選的糖類抗原剪切自糖綴合物，例如來自糖類-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗抗原。在已經(jīng)證明可用于人類的三種腦膜炎奈瑟球菌血清組C偶聯(lián)疫苗中，MenjugateTM[6]和MeningitecTM基于寡糖，而NeisVac-CTM使用全長多糖。
其它優(yōu)選的糖類抗原的真核生物的糖類，例如真菌的糖類、植物的糖類、人類的糖類(例如癌抗原)等。
在中性pH時(shí)帶有電荷的糖類(例如陰離子性的)是優(yōu)選的分析物。可用本發(fā)明的方法分析帶有多個(gè)磷酸基團(tuán)和/或多個(gè)羧酸基團(tuán)的糖類分析物。因此，本發(fā)明特別適用于分析多陰離子糖類分析物。
其它優(yōu)選的分析物是脂多糖和脂寡糖。
本發(fā)明特別適用于包括各種不同長度的糖，例如同種母體糖的不同片段的分析物。
HPAEC的結(jié)果是，分析物通常在水溶液中，且這種溶液有高pH和高鹽濃度。
典型的分析物是那些可通過電流和光譜技術(shù)檢測的分析物。
要分析的含有感興趣分析物的樣品可包含其它物質(zhì)。這些物質(zhì)可能會(huì)或不會(huì)被色譜柱保留，因此可能會(huì)或不會(huì)出現(xiàn)在洗出液中。這種組分通常不會(huì)結(jié)合到柱上。
因此，用本發(fā)明方法分析的洗出液將含有這些分析物或者可能含有這些分析物。
分析物可以是釋放前檢測的產(chǎn)品(例如在制造或質(zhì)量控制檢測中)，或者可以是釋放后檢測的產(chǎn)品(例如為評(píng)定穩(wěn)定性、半衰期等)。
其它步驟在分析液相色譜柱的洗出液之前，本發(fā)明方法可包括在柱中加入含有分析物的樣品(或懷疑含有分析物)。因此，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中分析物的存在的方法，該方法包括以下步驟(a)將樣品施加到液相色譜柱，以使樣品中的分析物被該柱保留；(b)從該柱洗脫分析物；和(c)如上所述分析洗出液。
為進(jìn)行糖類分析，在進(jìn)入柱之前可能需要從樣品中過濾至少一些非分析物化合物，DionexTM的前置柱能用于這種目的的截留和防護(hù)，例如可以截留氨基以除去氨基酸、截留硼酸鹽等。
洗脫和分析之后，本發(fā)明還可包括測定所檢測分析物的特征的步驟，如其DP(通常是平均DP)、其分子量、其純度等。
經(jīng)過電流和光譜檢測器之后，可將洗出液引入質(zhì)譜儀，例如FAB/MS或ESI/MS。
利用本發(fā)明選擇所需糖類本發(fā)明在綴合之前特別有用，此時(shí)需要確保選擇大小正確的糖鏈以制造綴合物。
本發(fā)明能夠在綴合之前檢測或監(jiān)測全長多糖的片段化過程。當(dāng)需要特定長度(或長度范圍)的寡糖時(shí)，重要的是不能使多糖的片段化程度過大而使解聚超過所需的點(diǎn)(例如最終得到單糖)。通過隨時(shí)間推移測量糖鏈長度，本發(fā)明能夠監(jiān)測這種部分解聚過程。因此，本發(fā)明提供了一種分析組合物中的糖類的方法，該方法包括以下步驟(a)開始解聚組合物中的糖類；和在這之后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(b)分析上述糖類。在初次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)通常在一些時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析以確定隨時(shí)間的進(jìn)展，但在已經(jīng)建立標(biāo)準(zhǔn)條件之后，出于證實(shí)的目的通常在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)分析。一旦達(dá)到所需終點(diǎn)，該方法還可包括以下步驟(c)停止解聚，例如通過洗滌、分離、冷卻等。該方法還可進(jìn)一步包括在任選的化學(xué)活化之后將解聚的糖類綴合到載體蛋白上的步驟。
本發(fā)明還能夠在片段化之后選擇所需寡糖鏈。因此，本發(fā)明提供了一種選擇用于制備糖綴合物的糖類的方法，包括以下步驟(a)獲得含有不同多糖片段的混合物的綴合物；(b)將此混合物分離出亞混合物；(c)用這里所述的方法分析一種或多種亞混合物；和(d)利用步驟(c)的結(jié)果選擇一種或多種用于綴合的亞混合物。該方法可包括在步驟(a)之前片段化多糖，或者可以從已經(jīng)制好的混合物開始。所述片段可以是同種多糖例如同種血清組的片段。步驟(d)之后，該方法可包括在任選的化學(xué)活化之后與載體蛋白綴合的步驟。
綴合之前，通常將糖類化學(xué)活化以引入能與載體反應(yīng)的官能團(tuán)。糖類活化的條件可造成水解，因此在活化之后分析糖類是有益的。適當(dāng)時(shí)，術(shù)語“糖類”可包括那些活化的糖類。此外，本發(fā)明提供了一種制備用于制造糖綴合物的活化的糖類的方法，包括以下步驟(a)獲得糖類；(b)化學(xué)活化糖類以引入能與載體蛋白反應(yīng)的官能團(tuán)；和(c)分析上述步驟(b)的產(chǎn)物。該方法還可包括以下步驟(d)使活化的糖類與載體蛋白(其自身也可已經(jīng)被活化)反應(yīng)以得到糖綴合物。該方法可包括在步驟(a)之前將多糖片段化，或者可以從已經(jīng)制好的混合物開始。
本發(fā)明還可在綴合之后使用。綴合后可采用本發(fā)明通過三種途徑分析綴合物首先，可測量組合物中的總糖。例如在混合不同綴合物之前或者在疫苗釋放之前(出于調(diào)整或質(zhì)量控制的目的)；第二，可測量組合物中游離的非綴合的糖類，例如以檢查是否存在不完全綴合，或者通過監(jiān)測游離糖隨時(shí)間的增加來了解綴合物的水解情況；第三，出于同樣的原因可測量綴合物中的綴合糖類。第一和第二途徑需要糖類在分析之前從綴合物中釋放出來。為單獨(dú)評(píng)估綴合和非綴合糖類必須將它們分離?？捎酶鞣N方法將水性組合物中的游離(即非綴合)糖類與綴合糖類分離。綴合反應(yīng)改變了糖類的各種化學(xué)和物理參數(shù)，可利用這種差異來分離。例如，可利用大小分離來分離游離和綴合糖類，綴合物質(zhì)由于含有載體蛋白而具有較大質(zhì)量。超濾是一種優(yōu)選的大小分離方法。另一種方法是，如果綴合物已被吸附到佐劑上則將離心分離吸附的綴合物(顆粒)和水解后解吸的游離糖類(上清液)。
本發(fā)明提供了一種分析糖綴合物的方法，包括以下步驟(a)處理糖綴合物以使糖類從載體釋放；和(b)如文中所述分析釋放的糖類。本發(fā)明提供了一種分析糖綴合物組合物的方法，包括以下步驟(a)將綴合物中的非綴合糖類與綴合糖類分離；和(b)如上所述分析非綴合和/或綴合糖類。
本發(fā)明還提供了一種供醫(yī)師使用的釋放疫苗的方法，包括以下步驟(a)制造疫苗，包括這里所述的分析步驟；和，如果步驟(a)的結(jié)果顯示疫苗可用于臨床應(yīng)用則(b)由臨床醫(yī)師釋放疫苗。步驟(a)宜對(duì)包裝的疫苗、對(duì)包裝前的成批疫苗、對(duì)綴合前的糖類等進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了一種疫苗批次，該批次中的一支疫苗已用本發(fā)明的方法分析。
通用術(shù)語術(shù)語“含有”包括“包括”以及“由……組成”，例如“含有”X的組合物可排他性地由X組成或者可以包括其它的物質(zhì)，例如X+Y。
詞“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可以完全不含Y。如果需要，詞“基本上”可從本發(fā)明的定義中省去。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x±10％。
本發(fā)明的方法可用于分析和/或制備目的。當(dāng)提及“分析”等時(shí)不能認(rèn)為排除了制備方法。
糖類的聚合度(DP)定義為糖類中重復(fù)單元的數(shù)目。因此，對(duì)于均聚物，SP與單糖單元的數(shù)目相同。然而對(duì)于雜聚物，SP是整個(gè)糖鏈中單糖單元的數(shù)目除以最小重復(fù)單元中單糖單元的數(shù)目，例如，(Glc-Gal)10的DP是10而不是20，(Glc-Gal-Neu)10的DP是10而不是30。
附圖簡述圖1顯示了通過電流法(上圖)和UV200nm光譜法(下圖)連續(xù)分析的HPAEC的流出液。上圖的測量單位是nC；下圖采用任意單位。
圖2顯示了電流和光譜檢測的串聯(lián)排列，而圖3顯示了平行排列。
圖4顯示了三種PAD波形。x-軸為時(shí)間，單位是秒。y-軸為相比Ag/AgCl參考電極的電勢，單位是伏特。所有三種波形都有延遲期(第一條豎線)、檢測期(第二條豎線)和之后的清除期。
圖5顯示了通過PAD(下面的軌跡)或UV(上面的軌跡)檢測的PA1柱洗脫液的分析結(jié)果。
圖6顯示了儲(chǔ)存在不同條件下的血清組A樣品的PA1柱洗出液的分析結(jié)果。洗脫程序與圖19相同。
圖7和8顯示了在PA100柱上用不同洗脫液洗脫血清組W135糖類的洗出液分析結(jié)果。圖9顯示了在PA1柱上洗脫同種分析物的結(jié)果，圖10顯示了在PA200柱上洗脫同種分析物的結(jié)果。
圖11顯示了Hib寡糖在PA100柱上洗出液的分析結(jié)果。
圖12顯示了水解的Hib糖類在AS11柱上洗出液的分析結(jié)果。
圖13顯示了血清組A多糖在SA11柱上洗出液的分析結(jié)果。糖類水解后的相同分析結(jié)果示于圖14。
圖15顯示了血清組C標(biāo)準(zhǔn)品的MALDI-TOF質(zhì)譜，圖16顯示了相同標(biāo)準(zhǔn)品在PA1柱上的洗出液的分析結(jié)果。還用AS11柱分析了標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果示于圖17。
圖18顯示了用AS11柱分析水解的血清組C多糖的結(jié)果。
圖19顯示了在214nm測得的水的洗脫曲線，采用PA1柱，用乙酸鹽/氫氧化物和硝酸鹽/氫氧化物作為洗脫液，有微膜抑制。洗脫程序與圖6相同。
實(shí)施本發(fā)明的方法HPAEC流出液的紫外檢測HPAEC分析莢膜糖時(shí)采用的高pH是指洗出液中存在氫氧化物離子，但這些離子在紫外區(qū)域具有高吸收。如圖19所示，使用在CarboPac PA1柱上僅用水得到的標(biāo)準(zhǔn)乙酸鹽/氫氧化物洗脫液，得到的洗脫曲線在UV區(qū)域觀察不到任何感興趣的分析物。因此，為對(duì)HPAEC洗脫液的分析結(jié)果進(jìn)行UV檢測需要不同的方法。
HPAEC洗脫液的PAD和UV聯(lián)合分析將血清組A腦膜炎雙球菌的莢膜糖解聚得到帶有電荷的(磷酸鹽，來自甘露糖胺-1-磷酸單體)混合長度的糖類(高DP)。與HPAEC分離時(shí)采用的PA1柱不同，該混合物在帶有制造商建議的保護(hù)柱的Dionex IonPac AS11柱上分離，采用氫氧化鈉梯度作為洗脫液(流速為1.0ml/min)。HPAEC柱的洗出液用電化學(xué)(PAD，金電極)和UV檢測器依次分析。整個(gè)電流檢測的結(jié)果示于圖1的上部，UV可見區(qū)檢測(200nm)的結(jié)果示于下部。
AS11柱具有低容量(11μeq)。將相同的分析物加到高容量Dionex CarboPac PA1柱(100μeq)，并將氯化鈉用作洗脫液中的推進(jìn)劑。如圖5所示，PA1柱的洗脫液不能通過PAD檢測(下面的軌跡)，但能通過UV檢測(上面的軌跡)。因此通過UV檢測使得低容量AEC柱能用于分析莢膜糖。
硝酸鹽和乙酸鹽洗脫液的比較通過常規(guī)HPAEC-PAD分析血清組W135腦膜炎雙球菌莢膜糖的寡糖片段集合，采用CarboPac PA100柱，用乙酸鈉和100mM氫氧化鈉梯度洗脫。結(jié)果示于圖7。
為進(jìn)行比較，在洗脫液中用硝酸鈉代替乙酸鈉進(jìn)行相同分析。如圖8所示，結(jié)果的動(dòng)態(tài)范圍很大，而高DP片段的分辨率較好?？蓹z測DP50片段。
變成CarboPac PA1柱進(jìn)一步加大了動(dòng)態(tài)范圍(圖9)，可檢測DP40片段。用5μmPA200柱可看到DP80片段(圖10)。
因此，硝酸鹽可用于從陰離子交換柱洗脫不同長度的莢膜糖。
硝酸鹽洗脫液用于隨時(shí)間進(jìn)行DP檢測偶聯(lián)疫苗的糖類組分可被逐步水解，這樣導(dǎo)致DP隨時(shí)間降低并減少了結(jié)合到蛋白載體的糖類的量?？刹捎肅arboPac PA1柱通過HPAEC-PAD監(jiān)測腦膜炎球菌血清組A的糖類在不同pH條件下的解聚。洗脫液為100mM氫氧化鈉中乙酸鈉和硝酸鈉的混合物，流速為1.0ml/min。
采用三種不同儲(chǔ)存條件(1)pH約9，37℃，4天；(2)pH約4，37℃，4天；和(3)pH約7，-20℃，即推薦的儲(chǔ)存條件。
如圖6所示，在洗脫液中加入硝酸鹽使得PAD可用于洗出液，并使解聚后的低DP片段可被檢測。對(duì)于儲(chǔ)存于37℃的材料可見到短片段，而對(duì)于儲(chǔ)存于0度以下的材料在相同的地方看不到峰(頂上的線)。
用低容量柱分析流感嗜血菌在CarboPac PA100柱上用常規(guī)HPAEC-PAD分析了Hib寡糖(DP 2-6)集合。洗脫液為24分鐘內(nèi)30mM-100mM的乙酸鈉梯度和100mM NaOH，流速為0.8ml/min(分鐘)。結(jié)果見圖11。
只有短鏈低聚物從CarboPac PA-100上洗脫，洗脫需要高百分比的乙酸鈉作為推進(jìn)劑。即便如此，DP5和DP6低聚物只能較弱分辨且靈敏度低。因此CarboPac PA-100不適合分析DP＞4的Hib寡糖集合。因此研究了不同的色譜柱。
IonPac AS11柱被用來分析平均DP為12.44的水解的Hib糖類集合。該柱具有高氫氧化物選擇性，因此能夠在低于以前用于強(qiáng)保留性聚陰離子(例如Hib片段)的氫氧化物濃度下洗脫帶高電荷的陰離子。洗脫液為15分鐘內(nèi)3mM-150mM NaOH。結(jié)果見圖12，該圖還顯示，低容量柱可用于分析細(xì)菌莢膜糖。洗脫非?？?，且只需要?dú)溲趸锾荻?。Hib集合的所有組分可在少于10分鐘的色譜運(yùn)行中分辨。
用低容量柱分析腦膜炎球菌血清組A的糖類IonPac AS11柱被用于分析血清組A腦膜炎球菌莢膜多糖的分子量分布。圖13顯示了采用19分鐘內(nèi)10-150mM氫氧化物梯度得到的DP約200的多糖樣品的色譜圖。奇怪的是，該柱能分離如此高M(jìn)W的聚陰離子，且該柱的效率如此之高以至于可在17分鐘內(nèi)在相對(duì)較窄的峰內(nèi)洗脫出分析物。該結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于諸如凝膠滲透色譜法的方法。
相同的柱子被用來分析多糖酸解后得到的寡糖。如圖14所示，可分辨DP升高的寡糖，DP與HPAEC-PAD保留時(shí)間相關(guān)。
用低容量柱分析腦膜炎球菌血清組C的糖類血清組C的多糖是部分O-乙?；摩?2，9-連接的N-乙酰-神經(jīng)氨酸的均聚物。因此是聚羧酸陰離子。由于O-乙?；拇嬖?，血清組C糖類的色譜圖較為復(fù)雜，因?yàn)楦鞯途畚锒紩?huì)根據(jù)結(jié)構(gòu)中乙?；姆植籍a(chǎn)生許多峰。
通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析了純化的DP5標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)其中分布有多種不同的低聚物(圖15)。在CarboPac PA1柱上通過HPAEC-PAD對(duì)相同標(biāo)準(zhǔn)品的分析示于圖16從該柱上洗脫需要較強(qiáng)條件(500mM乙酸鈉，100mM氫氧化鈉)，圖15和16之間的區(qū)別顯示，乙酸鹽處理改變了糖類中乙?；奶烊环植?。因此采用非常高容量的AEC柱分析乙?；奶穷惒皇亲罴训摹?br> 因此使用與受抑電導(dǎo)率檢測偶聯(lián)的IonPacAS11柱作為替代。如圖17所示，采片10mM-60mM氫氧化鈉梯度(無乙酸鹽)能夠洗脫DP5標(biāo)準(zhǔn)品，其洗脫曲線顯示出不同的寡糖和O-乙酰基分布。這種色譜圖的解釋比MALDI-TOF圖譜簡單得多，后者由于存在不同量的分子量等于乙?；亓恳话氲拟c作為抗衡離子而比較復(fù)雜。
對(duì)莢膜多糖不同長度的水解產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)，也可見到這種DP5標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖(圖18)。
應(yīng)理解，只是以舉例的方式描述了本發(fā)明，可對(duì)本發(fā)明作出修改而仍在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種分析液相色譜柱的洗出液的方法，其特征在于，所述洗出液用電流分析法和光譜法分析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色譜柱是高效陰離子交換色譜(HPAEC)柱。
3.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，采用脈沖電流檢測(PAD)。
4.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，采用紫外(UV)吸收光譜法和/或可見光吸收光譜法。
5.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述洗出液包含細(xì)菌莢膜糖或細(xì)菌莢膜糖的含糖片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌莢膜糖來自腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌。
7.一種檢測樣品中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)將樣品施加到液相色譜柱，以使樣品中的分析物結(jié)合該柱；(b)從該柱洗脫分析物；和(c)如上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述分析洗出液。
8.一種分析樣品的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備包括(i)液相色譜柱，(ii)電流檢測器，和(iii)光譜檢測器，其中的兩個(gè)檢測器用來接收柱洗出液。
9.如權(quán)利要求8所述的設(shè)備，其特征在于，所述液相色譜柱是HPAEC柱。
10.如權(quán)利要求8或9所述的設(shè)備，其特征在于，所述電流檢測器是PAD。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的設(shè)備，其特征在于，所述光譜檢測器是UV檢測器。
12.一種從陰離子交換色譜柱洗脫莢膜糖分析物的方法，其特征在于，所述分析物用含有選自硝酸根離子和氯離子的離子的洗脫液洗脫。
13.一種通過陰離子交換色譜法分析莢膜糖的方法，其特征在于，所述色譜法用容量小于50μeq的柱進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述方法采用氫氧化物選擇性陰離子交換色譜柱。
全文摘要
當(dāng)通過HPAEC分析糖類時(shí)，通常用電流檢測器分析柱洗出液。根據(jù)本發(fā)明，電流檢測與紫外檢測兩種方法結(jié)合用于洗出液。因此，本發(fā)明提供了一種分析液相色譜柱的流出液的方法，其中，洗出液同時(shí)用(a)電流檢測和(b)紫外檢測進(jìn)行分析。用這兩種檢測類型得出的信息優(yōu)于任何一種檢測方法單獨(dú)得出的信息。
文檔編號(hào)G01N30/64GK1973202SQ200580021186
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者D·普羅蒂, A·巴多蒂, S·里奇 申請(qǐng)人:啟龍有限公司