專利名稱：一組適用于肝癌組織學(xué)分級和判斷病人預(yù)后的突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一組LLGL1變異體，適用于肝癌組織學(xué)分級和判斷病人易感性和/或預(yù)后。
背景技術(shù)：
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率居于惡性腫瘤第五位(＞500,000/年)，并且肝癌的死亡率高，是腫瘤死亡的第三大原因(Block，T.M.等，Molecular viral oncology of hepatocellularcarcinoma.Oncogene 22(33)5093-107.2003)。這與肝癌的發(fā)病特點有很大的關(guān)系，肝癌發(fā)病通常比較隱秘，早期診斷率低，臨床治療效果差，確診后五年生存率＜5％。肝癌的發(fā)病目前認(rèn)為與HBV(肝炎B病毒，hepatitis B virus)，HCV(肝炎C病毒，hepatitis C virus)感染等可以導(dǎo)致肝組織炎癥性病變及肝硬化等因素有關(guān)，而對于他的發(fā)病機理還不清楚(Brnix，J等，F(xiàn)ocus on hepatocellular carcinoma.Cancer Cell 5(3)215-9.2004)。而目前對于肝癌的治療方案還主要是基于肝癌的大小，個數(shù)這類影像診斷指標(biāo)，而沒有特異性的分子指標(biāo)指導(dǎo)臨床治療。隨著腫瘤癌基因，抑癌基因及其它相關(guān)基因的研究深入，腫瘤被認(rèn)為是一種多基因異常的疾病，對腫瘤實行個體化，預(yù)見性的治療有利于提高腫瘤患者的無瘤生存期及絕對生存期。因此，確定肝癌相關(guān)基因及其參與肝癌發(fā)病機理，為肝癌個體化和預(yù)見性治療提供基礎(chǔ)，也為新的治療方案提供靶點，從而有利于提高肝癌的治愈率(Thorgeirsson，S.等，Huntingfor tumor suppressor genes in liver cancer.Hepatology 37(4)739-41.2003)。
lgl(果蠅幼蟲巨大致死性基因，lethal giant lavae)，dlg(成蟲盤巨大基因，discslarge，)和scribble(紊亂基因，scrib)三個基因是果蠅的抑癌基因(tumor suppressor)，這三個基因在功能上有協(xié)同作用。其中任何一個基因發(fā)生突變的細胞及生物學(xué)表型相似，表現(xiàn)為果蠅幼蟲的先前視中樞及成蟲盤會發(fā)生惡性腫瘤樣的增生，細胞過度增生失去原有的組織結(jié)構(gòu)(Wodarz，A等，Tumor suppressorslinking cell polarityand growth control.Curr Biol 10(17)R624-6.2000；Bilder，D等，Cell polaritysquaring the circle.Curr Biol 11(4)R132-5，2001)。lgl-/-細胞植入成蟲的體內(nèi)會形成腫瘤并且會發(fā)生轉(zhuǎn)移(Bilder，D等，Epithelial polarity and proliferation controllinksfrom the Drosophila neoplastic tumor suppressors.Genes Dev 18(16)1909-25.2004)。另外還有證據(jù)顯示這些基因的失活可能會促進腫瘤的轉(zhuǎn)移(Pagliarini，R等，Agenetic screen in Drosophila for metastatic behavior.Science 302(5648)1227-31.2003)。人果蠅同源性致死性巨大基因(lethal giant larvae homolog 1，LLGL1)是人與果蠅lgl同源的基因，同源性達到27％。lgl在果蠅中起著抑癌基因的作用，如果lgl發(fā)生突變，功能失活，原有的組織形態(tài)消失，并且這種增生的組織接種到成蟲體內(nèi)會不停的增生并發(fā)生廣泛的轉(zhuǎn)移”(Watson，K.L.Drosophila in cancer researchthefirst fifty tumor suppressor genes.J Cell Sci Suppl 1819-33.1994)。許多研究證明lgl在進化上很保守(Baek，K.H.等，Structural and functional conservation of the lglrecessive oncogenes(Review).Int J Oncol 24(5)1257-61.2004)。例如在線蟲，果蠅，哺乳動物及人中都存在同源基因，并且在結(jié)構(gòu)上都包含有多個WD40區(qū)及保守的絲氨酸序列；在功能上，來自各個種屬的lgl之間可以進行功能替代(Kim，Y.S.等，F(xiàn)unctional and expression analyses of mgl-1，a mouse orthologue of lethal giantlarvae recessive oncogene.Int J Oncol 23(6)1515-9.2003；Kim，Y.K.等，Complementation of temperature tolerance by rat Rgl-1 recessive oncogene in theabsence of Saccharomyces cerevisiae Sop genes.Oncol Rep 12(5)1105-8.2004)。
LLGL1位于人的17號染色體近著絲點區(qū)，17p11.2-12，近來的分子學(xué)研究顯示這一區(qū)域可能存在與神經(jīng)外胚層腫瘤相關(guān)基因。目前已有報道顯示LLGL1在63％的肺癌，76％的乳腺癌，50％的卵巢癌，53％的前列腺癌及40％的黑色素瘤中表達下降或不表達，支持LLGL1有可能也是一個抑癌基因(Grifoni，D.等，Thehuman protein Hugl-1 substitutes for Drosophila lethal giant larvae tumour suppressorfunction in vivo.Oncogene 23(53)8688-94.2004)。近來Schimanski等人的研究顯示LLGL1在結(jié)腸癌的低表達與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在293細胞過表達LLGL1會抑制細胞的遷移(Schimanski，C.C.等，Reduced expression of Hugl-1，the humanhomologue of Drosophila tumour suppressor gene lgl，contributes to progression ofcolorectal cancer.Oncogene.2005)。
由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關(guān)注腫瘤的早期診斷和預(yù)后，而目前本領(lǐng)域?qū)τ贚LGL1是否是在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用還不清楚。因此，現(xiàn)有技術(shù)迫切需要將LLGL1抑癌基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，從而為肝癌的診斷和預(yù)后提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供體外檢測LLGL1的基因和轉(zhuǎn)錄本是否存在變異的方法。
本發(fā)明的目的之二是提供一組分離的LLGL1突變體核苷酸和氨基酸序列，用以通過細胞生物學(xué)實驗分析LLGL1的突變體對細胞生物學(xué)特征的影響，從而進一步驗證LLGL1出現(xiàn)的改變對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。
本發(fā)明的目的之三是提供一種腫瘤易感性和/或預(yù)后檢測的試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測LLGL1的基因和轉(zhuǎn)錄本是否存在變異的方法，它包括步驟檢測所述的LLGL1基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的LLGL1基因、轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列相比較，存在選自下組的差異就表明LLGL1的基因和轉(zhuǎn)錄本存在變異1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，(即A128T-D)2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，(即L34T)3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，(即F172T-D)4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，(即F185T)5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，(即F171T)6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，(即L27T)7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，(即F172T-M)8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，(即F45T)9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，(即F182T)10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，(即F109T)11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，(即7721)12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，(即L37T、F104TM、F105T和F126T)13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，(即A128T-M)14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，(即F60T)15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，(即F99T)16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，(即F135T)17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，(即A91T)18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，(即A138T或A92T)19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，(即F104TM)20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，(即F145、F187和Z11)21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，(即A83T、A104T和A179T)22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，(即L34T)23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，(即L38T)24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，(即F126T)27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，(即F126T)28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，(即A104T)29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的差異選自下組a)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種體外檢測LLGL1蛋白是否存在氨基酸改變的方法，它包括步驟檢測所述的LLGL1蛋白，存在選自下組的氨基酸序列就表明LLGL1蛋白存在氨基酸改變a)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，b)具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，c)具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，d)SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種腫瘤易感性和/或預(yù)后檢測的試劑盒，它包括特異性擴增LLGL1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，并且用所述引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有選自下組的變異部位1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有與所述的變異部位特異性結(jié)合的探針。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的突變選自下組a)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一組分離的核酸，所述的核酸由SEQ ID NO1中20-4500個連續(xù)核苷酸構(gòu)成，并且還含有選自下組的突變1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，
28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一組分離的蛋白，由上面所述的任一核酸編碼而成。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的分離的蛋白的編碼序列選自a)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，在本發(fā)明的第六方面，提供了一種基因芯片，所述的基因芯片包括基片和位于所述基片上的核酸探針陣列，所述的核酸探針對應(yīng)于選自下組的LLGL1基因突變1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸探針對應(yīng)于至少10種所述突變。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1.RT-PCR分析LLGL1在肝癌中發(fā)生突變。其中，A表示引物設(shè)計示意圖，P1和P2擴增5′段1990bp，對應(yīng)的蛋白序列包括了所有LLGL1的功能保守序列，P3和P4擴增3′段1355bp。B顯示了部分肝癌病人中LLGL1基因的表達。通過RT-PCR擴增發(fā)現(xiàn)在肝癌中LLGL1存在1到2個分子量較小的異常轉(zhuǎn)錄本。
圖2.21種異常轉(zhuǎn)錄本序列與正常LLGL1的比較分析，肝癌組織的非正常轉(zhuǎn)錄本的序列特征示意圖。
圖3.21種突變體cDNA序列的比較的共同特征，在正常的LLGL1序列中有3～10個堿基的正向重復(fù)序列，而非正常轉(zhuǎn)錄本在這兩個重復(fù)序列中間發(fā)生缺失，只保留了一個拷貝得正向重復(fù)序列。
圖4.野生型及突變型LLGL1的表達。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，將LLGL1的突變與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，并且分析了LLGL1突變體對細胞生物學(xué)功能的影響，總結(jié)出了影響肝癌發(fā)生發(fā)展的多個LLGL1關(guān)鍵突變體，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明人選取78個肝癌的組織樣本及相對應(yīng)的癌旁正常組織和五株肝癌細胞株，提取RNA和基因組DNA，通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)，ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction)，直接測序的方法在mRNA水平上檢測LLGL1的突變情況(檢測突變時，將檢測樣品的LLGL1序列與野生型LLGL1序列(GenBank號NM 004140，SEQ ID NO1)作對比，基于此來確定是否發(fā)生突變)，發(fā)現(xiàn)在LLGL1在24例(30.77％)病人肝癌組織，1例(20％)癌細胞株中出現(xiàn)不正常的轉(zhuǎn)錄本，這些不正常轉(zhuǎn)錄本的剪切位點都是非正常的位點。而在相對應(yīng)的癌旁組織樣本沒有檢測到LLGL1的不正常轉(zhuǎn)錄本。另外，LLGL1在6個(7.69％)病人的肝癌組織中出現(xiàn)點突變而對應(yīng)的癌旁組織中沒有突變。通過統(tǒng)計相關(guān)性分析本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些突變體的存在和肝癌的病理組織學(xué)分級有關(guān)。
選擇美國德克薩斯大學(xué)M.D.Anderson腫瘤中心的Jeffrey D.Wayne博士多中心數(shù)據(jù)庫，選擇了接受治療性小HCC切除術(shù)的249例患者(69例女性，平均年齡62歲)進行研究，主要評估了6項臨床指標(biāo)(年齡、性別、術(shù)前甲胎蛋白水平、肝炎血清學(xué)表現(xiàn)、腫瘤數(shù)量[單發(fā)或多發(fā)]、Child-Pugh評分)和3項病理學(xué)指標(biāo)(肝炎活性評分、纖維化評分、Edmondson-Steiner腫瘤分級)。多變量Cox分析顯示，纖維化評分、Edmondson-Steiner分級、Child-Pugh評分同時為切除術(shù)后存活率的顯著預(yù)測指標(biāo)。(Preoperative predictors of survival after resection of small hepatocellularcarcinomas.Ann Surg.235(5)722-30；discussion 730-1，2002)。肝癌的組織學(xué)分化還可以作為肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)顯著預(yù)測指標(biāo)(What patients can survive disease free aftercomplete resection for hepatocellular carcinoma？A multivariate analysis.Jpn J ClinOncol，30(2)75-81.2000；Risk factors for tumor recurrence and prognosis after curativeresection of hepatocellular carcinoma.Cancer.71(1)19-25.1993)。
更具體的，本發(fā)明人首先選取30個肝癌的組織樣本及相對應(yīng)的癌旁正常組織和5株肝癌細胞株，提取RNA和基因組DNA，用兩對引物((P1/P2，P3/P4)通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)，如圖1A)，直接測序的方法在mRNA水平上檢測LLGL1全長cDNA的突變情況，發(fā)現(xiàn)兩個病人的肝癌組織中的LLGL1有點突變，兩個病人的肝癌組織和一個肝癌細胞株中LLGL1出現(xiàn)非正常轉(zhuǎn)錄本。其中三種是移碼突變，并且都集中在LLGL1的5′端1990bp的序列。
為了更進一步研究LLGL1在肝癌中的這些改變是否與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，本發(fā)明人再對48例病人的肝癌組織及癌旁組織進行分析，用引物P1/P2通過RT-PCR，直接測序的方法在mRNA水平上檢測LLGL15′端1990bp的序列。結(jié)合前面20個病例，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)26例(33.33％)病人肝癌組織，1個(20％)肝癌細胞株中出現(xiàn)突變，即LLGL1在肝癌中有很高比例突變發(fā)生。其中，發(fā)現(xiàn)78例中LLGL1僅6例(7.5％)病人的肝癌組織中出現(xiàn)點突變而對應(yīng)的癌旁組織中沒有發(fā)現(xiàn)突變，而其中僅2例僅發(fā)生點突變，而LLGL1在24例(30.76％)病人肝癌組織，1個(20％)肝癌細胞株中出現(xiàn)不正常的轉(zhuǎn)錄本，這些不正常轉(zhuǎn)錄本的剪切位點都是非正常的位點。而在相對應(yīng)的癌旁組織樣本沒有檢測出了這種不正常轉(zhuǎn)錄本(部分結(jié)果如圖1B所示)，其中，14個病人肝癌組織和肝癌細胞株中所檢測到的LLGL1的突變體有移碼，10個移碼突變會導(dǎo)致翻譯的終止(如表1和表2)。
大部分異常轉(zhuǎn)錄本有這樣的共同特征，即異常剪切位點的前后序列有3～10個堿基的同方向的重復(fù)序列，在異常剪切序列中只保留了一個拷貝的這種3～10個堿基序列。原癌基因mdm2在侵潤性乳腺癌中特異性表達的轉(zhuǎn)錄本也有這種特征(Lukas，J.，Alternative and aberrant messenger RNA splicing of the mdm2 oncogene ininvasive breast cancer.Cancer Res 61(7)3212-9.2001)，但在基因組上并沒有找到對應(yīng)的缺失，著名的抑癌基因(RB)在腫瘤中基因組水平發(fā)生多種多樣的缺失性改變，在缺失序列的前后也有這種直向重復(fù)序列(Canning，S.等，Short，directrepeats at thebreakpoints of deletions of the retinoblastoma gene.Proc Natl Acad Sci U S A 86(13)5044-8.1989)。因此，本發(fā)明人從這里推斷這些非正常的LLGL1可能是發(fā)生在基因組中有相對應(yīng)的缺失，或者是LLGL1在轉(zhuǎn)錄的過程中發(fā)生了缺失。為了研究這些不正常剪切體產(chǎn)生的原因，本發(fā)明人設(shè)計引物擴增這些出現(xiàn)不正常剪切產(chǎn)物所對應(yīng)的基因組DNA，對不正常剪切位點的前后500bp進行測序，但并沒有檢測到相關(guān)的突變。表明這些異常的轉(zhuǎn)錄本的出現(xiàn)可能是因為轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生了錯誤。
為了進一步的研究這些突變體可能有的生物學(xué)功能，本發(fā)明人收集整理了其中58個病人的臨床及病理診斷資料，對這些病人的病歷的臨床及病理特征進行了分析，通過統(tǒng)計相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)分化越好的肝癌組織中，LLGL1突變體的比率越低(Edmendson組織學(xué)分級的肝癌組織LLGL1突變率為0/9)，分化越差的肝癌組織LLGL1的突變率越高(Edmendson組織學(xué)分級的肝癌組織LLGL1突變率為17/37)，這些差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.017＜0.05)，而LLGL1突變體的存在和腫瘤的TNM分期(P＝0.373＞0.05)，腫瘤的大小(P＝0.256＞0.05)沒有相關(guān)性，和病人的年齡(P＝0.39＞0.05)，性別(P＝0.697＞0.05)，是否有HBV感染(P＝0.752＞0.05)之間也無相關(guān)性，如表3。
這些結(jié)果表明，LLGL1基因突變體的存在與分化差的肝癌的發(fā)生或發(fā)展有著密切的關(guān)系。lgl通過C端與細胞骨架蛋白結(jié)合，N端并不參與這種結(jié)合。但lgl被aPKC磷酸化后lgl N端會和C端結(jié)合使lgl從細胞骨架解離(Betschinger，J.等，Phosphorylation-induced autoinhibition regulates the cytoskeletal protein Lethal(2)giantlarvae.″Curr Biol 15(3)276-82.2005)。并且，Lgl在脯乳動物的另一個同源蛋白Lgl2的C端對Lgl的功能由優(yōu)勢顯性失活(dominant negative)作用(Yasumi，M.，等，Directbinding of Lgl2 to LGN during mitosis and its requirement for normal cell division.″JBiol Chem 280(8)6761-5.2005)。在本發(fā)明人所找到的突變體里128k的N端保守序列基本缺失，可能會起一個顯性失活作用，37K有兩處的移碼使中間一段的氨基酸序列發(fā)生改變，可能會改變LLGL1的功能，并且這種突變體出現(xiàn)的頻率相對較高。7721是細胞株中發(fā)現(xiàn)的突變體，有利于研究。所以為了進一步研究這些突變體的產(chǎn)生與肝癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，本發(fā)明人克隆并表達其中的比較有代表性的3種突變體—L37k，A128k，7721并制備這三個突變體的穩(wěn)定細胞株，用于進一步觀察它們對腫瘤的生物學(xué)特征的影響，如圖4。
檢測LLGL1基因的突變可用于診斷LLGL1蛋白相關(guān)的疾病。LLGL1蛋白突變的形式包括與正常野生型LLGL1 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。一種優(yōu)選的在核酸水平檢測LLGL1基因突變的方法是檢測SNP的存在與否。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測含有LLGL1基因變異的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴增LLGL1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，并且用所述引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明所鑒別出的變異部位，和/或還包括使用說明。
在本發(fā)明中，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與前文所述的一組分離的LLGL1突變體多核苷酸所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。在本發(fā)明中，“簡并的變異體″是指編碼具有前文所述的一組分離的LLGL1突變體多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，但與這些序列所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明的編碼三株LLGL1突變體，該多核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明的一組LLGL1突變體蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼LLGL1突變體DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lae或t印啟動子；入噬菌體PI，啟動子真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
本發(fā)明還基因芯片的用途，基因芯片制備可采用生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后后點樣儀將其點在修飾玻片或硅片，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolicand genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000,1-130。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例ILLGL1在肝癌中發(fā)生突變的檢測用總RNA的抽提試劑Trizol(Invitrogen公司)按操作說明，提取78對病人的肝癌及癌旁組織及5株肝癌細胞株(hepG2，huh7，SKhepl，SMMC-7721，BEL-7404，從中國科學(xué)院細胞庫購買)總RNA，依據(jù)總RNA用RT反應(yīng)25℃5分鐘，42℃，60分鐘，70℃15分鐘，分別對mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用四個引物(P15’-GGAATTCCGCAAGATGATGAAGTTTCG-3’(SEQ ID NO13)和P25’-GACTGGCGCAGTGACTTCTTG-3’(SEQ ID NO14)；P3 5’-ACTCTTCACCCCAATGACT-3’(SEQ ID NO15)和P4 5’-GCTCTAGAGATGCAACAGGCGTGGGCCT-3’(SEQ IDNO16))(如圖1A所示)分兩段PCR擴增LLGL1，反應(yīng)獲得這些樣本的cDNA，通過1％的瓊脂糖凝膠來檢測擴增的PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物測序分析(博亞公司)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)兩例病人的肝癌組織中的LLGL1有點突變，兩例病人的肝癌組織和一個肝癌細胞株中LLGL1出現(xiàn)非正常轉(zhuǎn)錄本。其中三種是移碼突變，并且都集中在LLGL1的5′端1990bp的序列。
用引物P1/P2通過RT-PCR反應(yīng)獲得另48例病人的肝癌組織及癌旁組織LLGL1 5′端1990bp的cDNA序列，通過1％的瓊脂糖凝膠來檢測擴增的PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物測序分析(博亞公司)。結(jié)果78例中LLGL1僅6(7.5％)例病人的肝癌組織中出現(xiàn)點突變而對應(yīng)的癌旁組織中沒有發(fā)現(xiàn)突變，結(jié)果如表2(78個肝癌組織及5個細胞株中LLGL1正常轉(zhuǎn)錄本中點突變的情況)，而其中僅2例僅發(fā)生點突變，而LLGL1在24(30.76％)例病人肝癌組織，1個(20％)肝癌細胞株中出現(xiàn)不正常的轉(zhuǎn)錄本，這些不正常轉(zhuǎn)錄本的剪切位點都是非正常的位點。而在相對應(yīng)的癌旁組織樣本沒有檢測出這種不正常轉(zhuǎn)錄本(部分結(jié)果如圖1B所示)，78例病人組織及5株肝癌細胞株中總共發(fā)生27例突變，變異情況總結(jié)至如表1(78個肝癌組織及5個細胞株中所找到的LLGL1突變及異常轉(zhuǎn)錄本，在表1“PT-PCR”一欄中，N指正常大小轉(zhuǎn)錄本，A指非正常轉(zhuǎn)錄本)。經(jīng)分析總結(jié)，其中共有21種不正常的轉(zhuǎn)錄本，如圖2和3所示。
收集整理了其中58個病人的臨床及病理診斷資料，對這些病人的病歷的臨床及病理特征進行了分析，通過統(tǒng)計相關(guān)性分析，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)分化越好的肝癌組織中，LLGL1突變體的比率越低(Edmendson級的肝癌組織LLGL1突變率為0/9)，分化越差的肝癌組織LLGL1的突變率越高(Edmendson組織學(xué)分級的肝癌組織LLGL1突變率為17/37)，這些差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.017＜0.05)，而LLGL1突變體的存在和腫瘤的TNM分期(P＝0.373＞0.05)，腫瘤的大小(P＝0.256＞0.05)沒有相關(guān)性，和病人的年齡(P＝0.39＞0.05)，性別(P＝0.697＞0.05)，是否有HBV感染(P＝0.752＞0.05)之間也無相關(guān)性，LLGL1異常與肝癌的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系分析如表3。
表1

表2

表3

*HCC組織學(xué)分級應(yīng)用的是Edmondson’分級標(biāo)準(zhǔn)。**TNM分期應(yīng)用是由國際抗癌聯(lián)合會和美國癌癥聯(lián)合委員會所提議的標(biāo)準(zhǔn)。
注58例病人中組織學(xué)分級I級9個，II級11個，III級37個，IV級1個，LLGL1異常的病人數(shù)為I級0/9，II級4/11，III級17/37，IV級1/1。其中II級及IV級的病人之間及與I級，III級病人之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
實施例2三株LLGL1突變體的制備用引物5’-CGGAATTCCAAGATGATGAAGTTTCGGTTC-3’(SEQ ID NO7)和5’-GCTCTAGAT GATGGCCACGCTGACCGCC-3’(SEQ ID NO8)，PCR擴增7721細胞cDNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)EcorI酶和XbaI酶雙酶切后，克隆于質(zhì)粒pEGFP-C1(購自invitrogene公司)上，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-C1-7721(圖4中的LLGL1-7721-EGFP)。分別用兩對引物P15’-GGAATTCCGCAA GATGATGAAGTTTCG-3，(SEQID NO9)和P25’-GACTGGCGCAGTGACTTCTTG-3’(SEQ ID NO10)；P3 5’-ACTCTTCACC CCAATGACT-3’(SEQ ID NO11)和P4 5’-GCTCTAGAGATGCAACAGGCG TGGGCCT-3’(SEQ ID NO12)，PCR分別擴增37k，128k兩種病人標(biāo)本中的異常轉(zhuǎn)錄本，擴增產(chǎn)物經(jīng)EcorI酶和SmaI酶雙酶切5’(P1/2擴增產(chǎn)物)端及SmaI酶和XbalI酶雙酶切3’(P3/P4擴增產(chǎn)物)端后，與同樣經(jīng)EcorI酶和XbalI酶雙酶切后并去除DNA5′端的磷酸基團載體EGFP進行三段連接，構(gòu)成pEGFP-C1-37K，pEGFP-C1-128K表達質(zhì)粒(圖4中的LLGL1-37K-EGFP，LLGL1-128K-EGFPE)。以上質(zhì)粒分別用熱擊法轉(zhuǎn)染DH5α菌，于SOB涂板，放置于37℃烘箱培養(yǎng)過夜，挑單克隆至2ml LB的培養(yǎng)瓶(氨卞抗性)中，37℃搖過夜，收集細菌，裂解，質(zhì)粒小抽獲得表達質(zhì)粒，酶切鑒定，測序鑒定。挑一陽性單菌落于含250ml LB的培養(yǎng)瓶中，37℃搖過夜離心，質(zhì)粒大抽，獲得待轉(zhuǎn)染的陽性質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒用CaCl2轉(zhuǎn)方法瞬時轉(zhuǎn)染細胞(于10％胎牛血清DMEN培養(yǎng))。細胞裂解液裂解轉(zhuǎn)染細胞，裂解產(chǎn)物RunPAGEGel，下層分離膠10％，單面膠電流15mA，雙面膠加倍，時間約1.5～2.5h。膠轉(zhuǎn)膜，去掉濃縮膠，硝酸纖維膜，上下各兩層濾紙，均用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡過，0.8mA/cm，2.5小時。麗春紅染色1～2分鐘，去離子水脫色后，標(biāo)記Marker各帶的位置。1×NET洗膜3次，10分鐘/次，80～100轉(zhuǎn)；1×Net-Gelatine block室溫30分鐘，80～100轉(zhuǎn)。倒掉Block solution，直接倒入用Block solution稀釋的一抗anti-EGFP(Santa Cruz公司購買)室溫一小時，80～100轉(zhuǎn)緩緩搖動。1×Net洗膜3次，每次10分鐘；羊抗鼠二抗室溫一小時，80～100轉(zhuǎn)。1×Net洗膜3×10min80～100轉(zhuǎn)；按操作說明用ECL(Pierce公司)化學(xué)發(fā)光劑檢測，野生型及突變型LLGL1的表達狀況如圖4。
LLGL1-128K-EGFP、LLGL1-37K-EGFP、LLGL1-7721-EGFP質(zhì)粒表達獲得的蛋白進行測序，其序列分別如SEQ ID NO4(LLGL1-128K-EGFPE)、SEQ IDNO5(LLGL1-37K-EGFP)、SEQ ID NO6(LLGL1-7721-EGFP)所示。
實施例3 檢測試劑盒制備一種肝癌預(yù)后檢測試劑盒，其中，含有下列可擴增出SEQ ID NO1第92位至1627位堿基被刪除的核苷酸的引物對5’-ACTCTTCACCCCAATGACT-3’(SEQ ID NO11)；5’-GCTCTAGAGATGCAACAGGCG TGGGCCT-3’(SEQ ID NO12)。
采用上述引物對待測樣品進行擴增，然后對擴增產(chǎn)物進行檢測，該試劑盒可輕易地檢測出SEQ ID NO1的第92位至1627位堿基被刪除的變異。
采用上述試劑盒，對200個肝癌或疑似受試者進行了檢測，發(fā)現(xiàn)1個病人帶有所述變異。
對于其他突變形式，也可以采用類似的檢測方法來進行檢測?；蛘卟捎脦в兴鐾蛔兲卣餍畔⒌男酒M行篩查。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一組適用于肝癌組織學(xué)分級和判斷病人預(yù)后的突變體<130>058513<160>16<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4225<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ggccgcgcgg cgcatcctgc gggcggcggc ggcgggcgag gcgcctgcag ccgggcgcaa 60gatgatgaag tttcggttcc ggcggcaggg cgccgacccg cagcgcgaga agctcaagca120ggagcttttc gccttcaaca agactgtgga gcatggcttc cccaatcagc ccagcgccct180ggccttcgac ccggaacttc gcatcatggc catcggcacc aggtctgggg ctgtcaagat240ctatggtgca cctggcgtgg agttcacagg cctgcaccgg gatgcagcca ctgtcacaca300gatgcacttc ttgaccggcc agggccgcct cctgtccctg cttgatgaca gcagtctgca360tctctgggag attgtccacc ataatggctg tgcccacctg gaagaagcac tcagtttcca420gctgcccagc cggcccggct ttgatggtgc cagtgctccg ctcagcctta cccgagtcac480agtggtcctg ctggtggctg ccggcgacat agcagccctg ggcactgagg gcagcagtgt540cttcttcctg gatgttacca ccctgaccct gctcgagggg cagacgcttg ccccaggcga600ggttctgcgc agcgtgccag acgactaccg ctgtgggaag gcactgggcc ccgtggagtc660actccaggga cacctgcggg accccacaaa gattctcatt ggctacagcc ggggcctgct720ggtcatctgg aaccaggcct cgcagtgtgt ggaccacatc ttcctgggga accagcagct780ggagagccta tgctgggggc gtgatagcag cactgtggtc agctcacaca gcgatggcag840ctatgctgtc tggtctgtgg atgccggcag cttcccaacg ctgcagccca cggtagccac900cacaccttac ggcccctttc cctgcaaggc cattaacaag attctgtggc ggaactgtga960atctgggggc cactttatca tcttcagcgg tggcatgccc cgtgccagct atggtgaccg 1020ccactgtgta agtgtgcttc gagccgagac attggtgacg ctggacttca cttcccgcat 1080catcgacttc ttcacagtgc acagcacacg gcccgaggat gaatttgatg acccccaggc 1140cctggctgtg ctgctggaag aggagctggt ggtgctggac ctgcagactc ctggctggcc 1200agctgtgcct gccccatacc tggccccgct gcactcctct gcaatcactt gctcggccca 1260cgtggccagt gtccccgcca agctgtgggc ccgcattgtg agcgctggcg agcagcagag 1320cccccagcct gtctccagtg ccttgagctg gcccatcact gggggccgaa acctggccca 1380ggagccgtca cagcgagggc tgctgctgac gggccatgag gacggcaccg tgaggttctg 1440ggatgcctcg ggtgtggcgc tgcggccgct ctataagctg agcacagctg gcctcttcca 1500gacagactgt gagcacgctg acagcctggc ccaggctgcc gaggacgact ggccaccctt 1560ccgcaaggtg ggctgcttcg atccctacag tgacgatccc cggcttggcg tgcagaaggt 1620tgctctctgc aagtatacag cccagatggt ggtggctggc actgcaggcc aggtgctggt 1680actggagctt agtgatgtgc cggtggagca ggcggtcagc gtggccatca tagacctcct 1740ccaggaccgc gagggcttca catggaaggg ccacgagcgg ctgagcccac gcacggggcc 1800gctgccctgg cctgctggct tccagccccg tgtcctggtg cagtgcctgc cgccagctgc 1860tgtaaccgct gtcacactcc acaccgagtg gagcctcgtg gcttttggca ccagtcatgg 1920ctttggcctc ttcgactacc agcgcaagag ccctgtgctg gccaggtgca ctcttcaccc 1980caatgactcc ctggccatgg agggtccgct ctcccgggtg aagtctctca agaagtcact 2040gcgccagtct ttccggcgca ttcgcaagag tcgtgtctct ggcaagaagc gggctgctaa 2100tgccagcagc aagttgcagg aagccaatgc acagctggct gagcaggcct gcccccacga 2160cgtggagatg acgcccgtgc agcgccgcat tgagccccgc tctgccgatg actccttgtc 2220gggtgtcgtg cgttgcctat actttgccga cacattcctt cgagatgggg cccaccacgg 2280gcccaccatg tgggctggca ccaactcagg ctctgtgttc gcctatgcac tggaggtgcc 2340ggcagcagca gtgggtggtg agaagcggcc tgagcaagcg gtggaggccg tgctgggcaa 2400ggaggtgcag ctgatgcacc gggcgcctgt ggtggccatt gccgtgttgg acgggcgtgg 2460
ccgcccactg cccgagccct acgaggcctc acgggacctg gcgcaggcac ctgacatgca2520gggtggtcac gctgtgctca tcgcatctga ggagcagttc aaggtgttca cactgcccaa2580ggtgagcgcg aagaccaagt tcaagctgac ggcccatgag ggctgtcgtg tgcgcaaggt2640ggcactggcc acgtttgcca gtgtggcctg cgaggactat gctgagacct gcctggcctg2700cctcaccaac ctgggtgacg tccacgtctt ctcggtgcct ggcctgcggc cccaggtgca2760ctattcctgc atccggaagg aggacatcag cggcatcgct tcgtgcgtct ttacgcgcca2820tggccagggc ttttacctga tatccccatc agaatttgaa cgcttctccc taagtgcccg2880gaacatcaca gagccgctct gctctctgga cattaactgg ccccgcgatg ccacccaggc2940cagttacagg atccgagagt cacccaagct gagccaggct aacgggaccc caagcatcct3000gctggcccca cagagccttg atggaagccc tgatccagcc cacagcatgg gacctgacac3060cccggagcca cccgaggctg cactctcacc catgtccatc gactcagcca ccagtgctga3120caccacgctg gacacgacag gggacgtcac agtggaagat gtgaaggatt tcctgggctc3180ctctgaggag tcagagaaga acctgaggaa cctggcagaa gacgaggccc acgcctgtgc3240catcctgatc aaatgaggaa ggccagaact atcccgacct ccacctgccc tgctcggagc3300tggagtgctg gatccctggc acctgcctgg ccccttaaca tagaaccacg cctgctaacc3360tgtaggctcc actgggacct gctgtcctgt cccgcctgac cctgggccct ggagcagcac3420cagccccagg gtgtgggcct gggacctggg ccagaactga gccctcctgc aggcatttgg3480ctgccctggg ggcccactgc ctagggaaga ggacaggtgg ggcccagcac ctgtgccacc3540tccccccctc cacacaccat ccttccccct cactttgcag agtatttttc cttttttttt3600tttttcttaa agacggagtc ttgctctgtc gcccaggctg gagtgcagtg gccccatctc3660tgctcactgc aagccccgcc ttctgggttc ccgccattct tctgcctcag cctcccaagt3720agctgggact acaggcgccc accaccacgc ccagctaatt ttttctgtat ttttagtaga3780gatggggttt caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgacctcgt gatccaccca3840cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccatgcccag ccctgcaaag3900agtatttttc tagcgcctgg gctggacagt tgtttctaaa actaaactat tttggtacct3960gcttctgggc cagtccccag cctgtcatga gtgtgtgtgt gcgggcatgg atgtgactgg4020gagctctgct gggcacccac atctggggcc tagtcaggtg tgtgtgtccg gcgggggggg4080ggggcagggg ggggggtcaa gatgagtttc cctgtagatt gtaccttggg gtttttttct4140gtcgttttgt taaaattagc gccattttaa tattaaaaat actgattttt aatattgaaa4200ataaaagcat ttaatatctc ttaaa 4225<210>2<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2gttaaatggg aggtttgggt tgagtccgac gtgagcag38<210>3<211>67<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3aggccagcag gagtgtggtg gctgccccag gaggctgctc tatagcacga ctggaccctg60tcttccc 67<210>4<211>546<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Arg Lys Met Met Lys Phe Arg Phe Arg Arg Gln Gly Ala Asp Pro Gln1 5 10 15
Arg Glu Lys Leu Lys Gln Glu Leu Phe Ala Phe Asn Lys Thr Val Glu20 25 30Leu Ser Asp Val Pro Val Glu Gln Ala Val Ser Val Ala Ile Ile Asp35 40 45Leu Leu Gln Asp Arg Glu Gly Phe Thr Trp Lys Gly His Glu Arg Leu50 55 60Ser Pro Arg Thr Gly Pro Leu Pro Trp Pro Ala Gly Phe Gln Pro Arg65 70 75 80Val Leu Val Gln Cys Leu Pro Pro Ala Ala Val Thr Ala Val Thr Leu85 90 95His Thr Glu Trp Ser Leu Val Ala Phe Gly Thr Ser His Gly Phe Gly100 105 110Leu Leu Ser Pro Val Leu Ala Arg Cys Thr Leu His Pro Asn Asp Ser115 120 125Leu Ala Mer Glu Gly Pro Leu Ser Arg Val Lys Ser Leu Lys Lys Ser130 135 140Leu Arg Gln Ser Phe Arg Arg Ile Arg Lys Ser Arg Val Ser Gly Lys145 150 155 160Lys Arg Ala Ala Asn Ala Ser Ser Lys Leu Gln Glu Ala Asn Ala Gln165 170 175Leu Ala Glu Gln Ala Cys Pro His Asp Val Glu Met Thr Pro Val Gln180 185 190Arg Arg Ile Glu Pro Arg Ser Ala Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val195 200 205Arg Cys Leu Tyr Phe Ala Asp Thr Phe Leu Arg Asp Gly Ala His His210 215 220Gly Pro Thr Met Trp Ala Gly Thr Asn Ser Gly Ser Val Phe Ala Tyr225 230 235 240Ala Leu Glu Val Pro Ala Ala Ala Val Gly Gly Glu Lys Arg Pro Glu245 250 255Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Gly Lys Glu Val Gln Leu Met His Arg260 265 270Ala Pro Val Val Ala Ile Ala Val Leu Asp Gly Arg Gly Arg Pro Leu275 280 285Pro Glu Pro Tyr Glu Ala Ser Arg Asp Leu Ala Gln Ala Pro Asp Met290 295 300Gln Gly Gly His Ala Val Leu Ile Ala Ser Glu Glu Gln Phe Lys Val305 310 315 320Phe Thr Leu Pro Lys Val Ser Ala Lys Thr Lys Phe Lys Leu Thr Ala325 330 335His Glu Gly Cys Arg Val Arg Lys Val Ala Leu Ala Thr Phe Ala Ser340 345 350Val Ala Cys Glu Asp Tyr Ala Glu Thr Cys Leu Ala Cys Leu Thr Asn355 360 365Leu Gly Asp Val His Val Phe Ser Val Pro Gly Leu Arg Pro Gln Val370 375 380His Tyr Ser Cys Ile Arg Lys Glu Asp Ile Ser Gly Ile Ala Ser Cys385 390 395 400Val Phe Thr Arg His Gly Gln Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Pro Ser Glu405 410 415Phe Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ala Arg Ash Ile Thr Glu Pro Leu Cys420 425 430Ser Leu Asp Ile Asn Trp Pro Arg Asp Ala Thr Gln Ala Ser Tyr Arg435 440 445Ile Arg Glu Ser Pro Lys Leu Ser Gln Ala Asn Gly Thr Pro Ser Ile450 455 460Leu Leu Ala Pro Gln Ser Leu Asp Gly Ser Pro Asp Pro Ala His Ser465 470 475 480
Met Gly Pro Asp Thr Pro Glu Pro Pro Glu Ala Ala Leu Ser Pro Met485 490 495Ser Ile Asp Ser Ala Thr Ser Ala Asp Thr Thr Leu Asp Thr Thr Gly500 505 510Asp Val Thr Val Glu Asp Val Lys Asp Phe Leu Gly Ser Ser Glu Glu515 520 525Ser Glu Lys Asn Leu Arg Asn Leu Ala Glu Asp Glu Ala His Ala Cys530 535 540Cys Ile545<210>5<211>914<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Arg Lys Met Met Lys Phe Arg Phe Arg Arg Gln Gly Ala Asp Pro Gln1 5 10 15Arg Glu Lys Leu Lys Gln Glu Leu Phe Ala Phe Asn Lys Thr Val Glu20 25 30His Gly Phe Pro Asn Gln Pro Ser Ala Leu Ala Phe Asp Pro Glu Leu35 40 45Arg Ile Met Ala Ile Gly Thr Arg Ser Gly Ala Val Lys Ile Tyr Gly50 55 60Ala Pro Gly Val Glu Phe Thr Gly Leu His Arg Asp Ala Ala Thr Val65 70 75 80Thr Gln Met His Phe Leu Thr Gly Gln Gly Arg Leu Leu Ser Leu Leu85 90 95Asp Asp Ser Ser Leu His Leu Trp Glu Ile Val His His Asn Gly Cys100 105 110Ala His Leu Glu Glu Ala Leu Ser Phe Gln Leu Pro Ser Arg Pro Gly115 120 125Phe Asp Gly Ala Ser Ala Pro Leu Ser Leu Thr Arg Val Thr Val Val130 135 140Leu Leu Val Ala Ala Ser Asp Ile Ala Ala Leu Gly Thr Glu Gly Ser145 150 155 160Ser Val Phe Phe Leu Asp Val Thr Thr Leu Thr Leu Leu Glu Gly Gln165 170 175Thr Leu Ala Pro Gly Glu Val Leu Arg Ser Val Pro Asp Asp Tyr Argl80 185 190Cys Gly Lys Ala Leu Gly Pro Val Glu Ser Leu Gln Gly His Leu Arg195 200 205Asp Pro Thr Lys Ile Leu Ile Gly Tyr Ser Arg Gly Leu Leu Val Ile210 215 220Trp Asn Gln Ala Ser Gln Cys Val Asp His Ile Phe Leu Gly Asn Gln225 230 235 240Gln Leu Glu Ser Leu Cys Trp Gly Arg Asp Ser Ser Thr Val Val Ser245 250 255Ser His Ser Asp Gly Ser Tyr Ala Val Trp Ser Val Asp Ala Gly Ser260 265 270Phe Pro Thr Leu Gln Pro Thr Val Ala Thr Thr Pro Tyr Gly Pro Phe275 280 285Pro Cys Lys Ala Ile Asn Lys Ile Leu Trp Arg Asn Cys Glu Ser Gly290 295 300Gly His Phe Ile Ile Phe Ser Gly Gly Met Pro Arg Ala Ser Tyr Gly305 310 315 320Asp Arg His Cys Val Ser Val Leu Arg Ala Glu Thr Leu Val Thr Leu325 330 335
Asp Phe Thr Ser Arg Ile Ile Asp Phe Phe Thr Val His Ser Thr Arg340 345 350Pro Glu Asp Glu Phe Asp Asp Pro Gln Ala Leu Ala Val Leu Leu Glu355 360 365Glu Glu Leu Val Val Leu Asp Leu Gln Thr Pro Gly Trp Pro Ala Val370 375 380Pro Ala Pro Tyr Leu Ala Pro Leu His Ser Ser Ala Ile Thr Cys Ser385 390 395 400Ala His Val Ala Ser Val Pro Ala Lys Leu Trp Ala Arg Ile Val Ser405 410 415Ala Gly Glu Gln Gln Ser Pro Gln Pro Val Ser Ser Ala Leu Ser Trp420 425 430Pro Ile Thr Gly Gly Arg Asn Leu Ala Gln Glu Pro Ser Gln Arg Gly435 440 445Leu Leu Leu Thr Gly Trp Ala Ala Ser Ile Pro Thr Val Thr Ile Pro450 455 460Gly Leu Ala Cys Arg Arg Leu Leu Ser Ala Ser Ile Gln Pro Arg Trp465 470 475 480Trp Trp Leu Ala Leu Gln Ala Arg Cys Thr Leu His Pro Asn Asp Ser485 490 495Leu Ala Met Glu Gly Pro Leu Ser Arg Val Lys Ser Leu Lys Lys Ser500 505 510Leu Arg Gln Ser Phe Arg Arg Ile Arg Lys Ser Arg Val Ser Gly Lys515 520 525Lys Arg Ala Ala Ash Ala Ser Ser Lys Leu Gln Glu Ala Asn Ala Gln530 535 540Leu Ala Glu Gln Ala Cys Pro His Asp Val Glu Met Thr Pro Val Gln545 550 555 560Arg Arg Ile Glu Pro Arg Ser Ala Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val565 570 575Arg Cys Leu Tyr Phe Ala Asp Thr Phe Leu Arg Asp Gly Ala His His580 585 590Gly Pro Thr Met Trp Ala Gly Thr Asn Ser Gly Ser Val Phe Ala Tyr595 600 605Ala Leu Glu Val Pro Ala Ala Ala Val Gly Gly Glu Lys Arg Pro Glu610 615 620Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Gly Lys Glu Val Gln Leu Met His Arg625 630 635 640Ala Pro Val Val Ala Ile Ala Val Leu Asp Gly Arg Gly Arg Pro Leu645 650 655Pro Glu Pro Tyr Glu Ala Ser Arg Asp Leu Ala Gln Ala Pro Asp Met660 665 670Gln Gly Gly His Ala Val Leu Ile Ala Ser Glu Glu Gln Phe Lys Val675 680 685Phe Thr Leu Pro Lys Val Ser Ala Lys Thr Lys Phe Lys Leu Thr Ala690 695 700His Glu Gly Cys Arg Val Arg Lys Val Ala Leu Ala Thr Phe Ala Ser705 710 715 720Val Ala Cys Glu Asp Tyr Ala Glu Thr Cys Leu Ala Cys Leu Thr Asn725 730 735Leu Gly Asp Val His Val Phe Ser Val Pro Gly Leu Arg Pro Gln Val740 745 750His Tyr Ser Cys Ile Arg Lys Glu Asp Ile Ser Gly Ile Ala Ser Cys755 760 765Val Phe Thr Arg His Gly Gln Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Pro Ser Glu770 775 780Phe Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ala Arg Asn Ile Thr Glu Pro Leu Cys785 790 795 800Ser Leu Asp Ile Asn Trp Pro Arg Asp Ala Thr Gln Ala Ser Tyr Arg
805 810 815Ile Arg Glu Ser Pro Lys Leu Ser Gln Ala Asn Gly Thr Pro Ser Ile820 825 830Leu Leu Ala Pro Gln Ser Leu Asp Gly Ser Pro Asp Pro Ala His Ser835 840 845Met Gly Pro Asp Thr Pro Glu Pro Pro Glu Ala Ala Leu Ser Pro Met850 855 860Ser Ile Asp Ser Ala Thr Ser Ala Asp Thr Thr Leu Asp Thr Thr Gly865 870 875 880Asp Val Thr Val Glu Asp Val Lys Asp Phe Leu Gly Ser Ser Glu Glu885 890 895Ser Glu Lys Asn Leu Arg Asn Leu Ala Glu Asp Glu Ala His Ala Cys900 905 910Cys Ile<210>6<211>452<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Arg Lys Met Met Lys Phe Arg Phe Arg Arg Gln Gly Ala Asp Pro Gln1 5 10 15Arg Glu Lys Leu Lys Gln Glu Leu Phe Ala Phe Asn Lys Thr Val Glu20 25 30His Gly Phe Pro Asn Gln Pro Ser Ala Leu Ala Phe Asp Pro Glu Leu35 40 45Arg Ile Met Ala Ile Gly Thr Arg Ser Gly Ala Val Lys Ile Tyr Gly50 55 60Ala Pro Gly Val Glu Phe Thr Gly Leu His Arg Asp Ala Ala Thr Val65 70 75 80Thr Gln Met His Phe Leu Thr Gly Gln Gly Arg Leu Leu Ser Leu Leu85 90 95Asp Asp Ser Ser Leu His Leu Trp Glu Ile Val His His Asn Gly Cysl00 105 110Ala His Leu Glu Glu Ala Leu Ser Phe Gln Leu Pro Ser Arg Pro Gly115 120 125Phe Asp Gly Ala Ser Ala Pro Leu Ser Leu Thr Arg Val Thr Val Val130 135 140Leu Leu Val Ala Ala Ser Asp Ile Ala Ala Leu Gly Thr Glu Gly Ser145 150 155 160Ser Val Phe Phe Leu Asp Val Thr Thr Leu Thr Leu Leu Glu Gly Gln165 170 175Thr Leu Ala Pro Gly Glu Val Leu Arg Ser Val Pro Asp Asp Tyr Arg180 185 190Cys Gly Lys Ala Leu Gly Pro Val Glu Ser Leu Gln Gly His Leu Arg195 200 205Asp Pro Thr Lys Ile Leu Ile Gly Tyr Ser Arg Gly Leu Leu Val Ile210 215 220Trp Asn Gln Ala Ser Gln Cys Val Asp His Ile Phe Leu Gly Asn Gln225 230 235 240Gln Leu Glu Ser Leu Cys Trp Gly Arg Asp Ser Ser Thr Val Val Ser245 250 255Ser His Ser Asp Gly Ser Tyr Ala Val Trp Ser Val Asp Ala Gly Ser260 265 270Phe Pro Thr Leu Gln Pro Thr Val Ala Thr Thr Pro Tyr Gly Pro Phe275 280 285
Pro Cys Lys Ala Ile Asn Lys Ile Leu Trp Arg Asn Cys Glu Ser Gly290 295 300Gly His Phe Ile Ile Phe Ser Gly Gly Met Pro Arg Ala Ser Tyr Gly305 310 315 320Asp Arg His Cys Val Ser Val Leu Arg Ala Glu Thr Leu Val Thr Leu325 330 335Asp Phe Thr Ser Arg Ile Ile Asp Phe Phe Thr Val His Ser Thr Arg340 345 350Pro Glu Asp Glu Phe Asp Asp Pro Gln Ala Leu Ala Val Leu Leu Glu355 360 365Glu Glu Leu Val Val Leu Asp Leu Gln Thr Val Ser Thr Leu Thr Ala370 375 380Trp Pro Arg Leu Pro Arg Thr Thr Gly His Pro Ser Ala Arg Trp Ala385 390 395 400Ala Ser Ile Pro Thr Val Thr Ile Pro Gly Leu Ala Cys Arg Arg Leu405 410 415Leu Ser Ala Ser Ile Gln Pro Arg Trp Trp Trp Leu Ala Leu Gln Ala420 425 430Arg Cys Trp Tyr Trp Ser Leu Val Met Cys Arg Trp Ser Arg Arg Ser435 440 445Ala Trp Pro Ser450<210>7<211>30<212>DNA<213>引物<400>7cggaattcca agatgatgaa gtttcggttc 30<210>8<211>28<212>DNA<213>引物<400>8gctctagatg atggccacgc tgaccgcc 28<210>9<211>27<212>DNA<213>引物<400>9ggaattccgc aagatgatga agtttcg 27<210>10<211>21<212>DNA<213>引物<400>10gactggcgca gtgacttctt g21<210>11<211>19<212>DNA<213>引物
<400>11actcttcacc ccaatgact 19<210>12<211>28<212>DNA<213>引物<400>12gctctagaga tgcaacaggc gtgggcct 28<210>13<211>27<212>DNA<213>引物<400>13ggaattccgc aagatgatga agtttcg 27<210>14<211>21<212>DNA<213>引物<400>14gactggcgca gtgacttctt g21<210>15<211>19<212>DNA<213>引物<400>15actcttcacc ccaatgact 19<210>16<211>28<212>DNA<213>引物<400>16gctctagaga tgcaacaggc gtgggcct 28
權(quán)利要求
1.一種體外檢測LLGL1的基因和轉(zhuǎn)錄本是否存在變異的方法，其特征在于，它包括步驟檢測所述的LLGL1基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的LLGL1基因、轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列相比較，存在選自下組的差異就表明LLGL1的基因和轉(zhuǎn)錄本存在變異1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異選自下組a)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除。
3.一種體外檢測LLGL1蛋白是否存在氨基酸改變的方法，其特征在于，它包括步驟檢測所述的LLGL1蛋白，存在選自下組的氨基酸序列就表明LLGL1蛋白存在氨基酸改變a)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，b)具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，c)具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，d)SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
4.一種腫瘤易感性和/或預(yù)后檢測的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增LLGL1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，并且用所述引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有選自下組的變異部位1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有與所述的變異部位特異性結(jié)合的探針。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自下組a)SEQ ID NO1第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1第92位至1627位堿基被刪除。
7.一組分離的核酸，其特征在于，所述的核酸由SEQ ID NO1中20-4500個連續(xù)核苷酸構(gòu)成，并且還含有選自下組的突變1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
8.一組分離的蛋白，其特征在于，由權(quán)利要求7所述的任一核酸編碼而成。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的蛋白，其特征在于，其編碼序列選自a) SEQ ID NO1第1129位至1447位堿基被刪除，b)SEQ ID NO1第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，c)SEQ ID NO1第92位至1627位堿基被刪除，
10.一種基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包括基片和位于所述基片上的核酸探針陣列，所述的核酸探針對應(yīng)于選自下組的LLGL1基因突變1)SEQ ID NO1，其中第115位至1796位堿基被刪除，2)SEQ ID NO1，其中第158位堿基被刪除，3)SEQ ID NO1，其中第282位至1759位堿基被刪除，4)SEQ ID NO1，其中第347位至1557位堿基被刪除，5)SEQ ID NO1，其中第365位至1515位堿基被刪除，6)SEQ ID NO1，其中第392位和393位堿基中插入序列SEQ ID NO2的38個堿基，7)SEQ ID NO1，其中第416位至1692位堿基被刪除，8)SEQ ID NO1，其中第715位至1284位堿基、第1353位至1 506位堿基和第1616位至1908位堿基被刪除，9)SEQ ID NO1，其中第831位至1885位堿基被刪除且于此處插入序列SEQ IDNO3的67個堿基，10)SEQ ID NO1，其中第998位至1634位堿基被刪除，11)SEQ ID NO1，其中第1129位至1447位堿基被刪除，12)SEQ ID NO1，其中第1353位至1506位堿基和第1616位至1808位堿基被刪除，13)SEQ ID NO1，其中第92位至1627位堿基被刪除，14)SEQ ID NO1，其中第308位至1381位堿基被刪除，15)SEQ ID NO1，其中第435位至1619位堿基被刪除，16)SEQ ID NO1，其中第644位至1759位堿基被刪除，17)SEQ ID NO1，其中第715位至867位堿基被刪除，18)SEQ ID NO1，其中第969位至1286位堿基被刪除的SEQ ID NO1或第966位至1284位堿基被刪除，19)SEQ ID NO1，其中第716位至1267位堿基被刪除，20)SEQ ID NO1，其中第1135位至1431位堿基被刪除，21)SEQ ID NO1，其中第712位至714位堿基被刪除且第620位堿基為T且第621位堿基為T，22)SEQ ID NO1，其中第437位堿基為C，23)SEQ ID NO1，其中第319位堿基為T，24)SEQ ID NO1，其中第620位堿基為T，25)SEQ ID NO1，其中第621位堿基為T，26)SEQ ID NO1，其中第299位堿基為T，27)SEQ ID NO1，其中第300位堿基為A，28)SEQ ID NO1，其中第1375位堿基為G，29)與上述28種序列所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的差異。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對個體的腫瘤(如肝癌)的易感性和/或預(yù)后進行診斷的方法它包括步驟檢測該個體的LLGL1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的LLGL1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患腫瘤的可能性高于正常人群和/或已經(jīng)患有腫瘤。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1962877SQ20051011007
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者陳正軍, 蘆雪峰 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院