專利名稱：物質(zhì)的檢測(cè)方法和檢測(cè)儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)特定物質(zhì)的方法、檢測(cè)特定物質(zhì)的試劑以及檢測(cè)特定物質(zhì)的儀器。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，人和動(dòng)物、植物、菌類以及微生物等的基因信息被解讀，新的基因一個(gè)接一個(gè)地被發(fā)現(xiàn)。然而新基因編碼的蛋白質(zhì)的功能大部分還沒(méi)有被闡明，在這些功能被確認(rèn)之前還需要很長(zhǎng)時(shí)間和大量勞力。有效的蛋白質(zhì)功能解析方法的開發(fā)成了非常迫切的課題。
作為確認(rèn)蛋白質(zhì)功能的方法，是從探索與蛋白質(zhì)有親和性的物質(zhì)開始，然后利用生物，從基因上控制該蛋白質(zhì)的表達(dá)，對(duì)蛋白質(zhì)的作用進(jìn)行推測(cè)而進(jìn)行的，但重要的是待檢測(cè)蛋白質(zhì)和物質(zhì)的親和性。這樣的方法有將純化的蛋白質(zhì)固定于載體上，裝到柱子中，使推測(cè)與該蛋白質(zhì)有不同親和性的物質(zhì)通過(guò)柱子，對(duì)它們通過(guò)還是吸附于柱子上進(jìn)行檢測(cè)的方法。
近年來(lái)作為這樣有效的方法開發(fā)了固定蛋白質(zhì)的芯片[BioEssays，21，781(1999)]。該芯片使用半導(dǎo)體技術(shù)，使特定的蛋白質(zhì)結(jié)合于芯片上的特定部位，然后通過(guò)使樣品接觸該芯片，使物質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)，通過(guò)標(biāo)記檢測(cè)該結(jié)合的方法，使用半導(dǎo)體芯片，往往需要微細(xì)加工，另外要想檢測(cè)固定于芯片上的蛋白質(zhì)是通過(guò)什么彼此結(jié)合時(shí)是不可能的，另外一旦做成芯片，要想很容易地追加其它種類的蛋白質(zhì)也是不可能的，就需要再制造芯片。
另外芯片目前正被用于檢查基因的變異、疾病診斷、藥物的效果以及副作用的抑制。然而由于基因的變異是多種多樣的，需要準(zhǔn)備多種DNA序列，檢測(cè)各自雜交的DNA。使用DNA芯片的目的是解決這些問(wèn)題，但存在著與上述相同的問(wèn)題。
另外至于微珠陣列(ビ一ズァレィ)已知有如下的方法，即使2～3種熒光色素以不同的比例浸漬數(shù)μm大小的微珠(ビ一ズ)，該浸漬微珠發(fā)出的熒光用2個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行解析，將兩個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的比作為各個(gè)微珠的判別裝置，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)、DNA序列等待檢測(cè)物質(zhì)在結(jié)合或雜交后在微小的空穴捕獲顆粒之后，通過(guò)熒光強(qiáng)度進(jìn)行解析的方法[美國(guó)專利第5843767號(hào)，Analytical Chemistry，70(7)，1242(1998)]等。然而由于該方法使用開有微小空穴的特殊裝置，在測(cè)定中需要很高的技術(shù)，由于通過(guò)雙波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比的微妙差別進(jìn)行識(shí)別，所以存在著判別能力低，不能適應(yīng)于各種各樣的蛋白質(zhì)或數(shù)萬(wàn)種之多的DNA，以及在微小檢測(cè)用微孔納入顆粒時(shí)，存在著來(lái)自檢測(cè)樣品的灰塵或周邊環(huán)境掉下的灰塵等混入時(shí)成為噪音等問(wèn)題。就這些方法來(lái)說(shuō)，還存在著借助什么裝置或不借助裝置蛋白質(zhì)之間具有的親和性也不能直接進(jìn)行檢測(cè)的缺點(diǎn)。
因此期待著廉價(jià)且通用性高的特定物質(zhì)的檢測(cè)方法的開發(fā)。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的在于提供廉價(jià)且通用性高的檢測(cè)特定物質(zhì)的方法、檢測(cè)特定物質(zhì)的試劑以及檢測(cè)特定物質(zhì)的儀器。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在微小載體上加上從外部可讀取的信號(hào)A，準(zhǔn)備多種可與載體結(jié)合的具有與蛋白質(zhì)或DNA等待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的物質(zhì)(以下稱之為結(jié)合子)，使它們與載體混合，與檢測(cè)樣品中的物質(zhì)結(jié)合，使新的信號(hào)B形成，通過(guò)比較簡(jiǎn)單的裝置可大致同時(shí)檢測(cè)信號(hào)A和信號(hào)B，通過(guò)對(duì)比進(jìn)行解析，即使不使用蛋白質(zhì)或DNA芯片等價(jià)格高的裝置，也可以檢測(cè)各種蛋白質(zhì)和DNA序列等待檢測(cè)特定物質(zhì)，使得本發(fā)明完成。
就是說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明方法，通過(guò)帶有信號(hào)A的載體和檢測(cè)裝置，即便沒(méi)有高度的蛋白質(zhì)或DNA芯片技術(shù)也可以通過(guò)使具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的物質(zhì)結(jié)合于載體，獲得與蛋白質(zhì)或DNA芯片同樣的結(jié)果。本發(fā)明的特征是即使在對(duì)很多完全不同的物質(zhì)進(jìn)行同樣檢測(cè)的情況下，準(zhǔn)備多個(gè)帶有相當(dāng)于該物質(zhì)種類的信號(hào)的載體簡(jiǎn)單，而且信號(hào)和序列組合可以由實(shí)驗(yàn)者自由地決定。而使用蛋白質(zhì)或DNA芯片時(shí)，當(dāng)檢測(cè)樣品的種類等改變時(shí)，必須要改變蛋白質(zhì)或DNA芯片，要重新制造，所以無(wú)通用性，而本發(fā)明的載體可以利用以往方法使所希望的蛋白質(zhì)或DNA等物質(zhì)結(jié)合于蛋白質(zhì)或DNA等物質(zhì)不能結(jié)合的載體上來(lái)制作，廉價(jià)而且簡(jiǎn)單地對(duì)應(yīng)于很多種物質(zhì)。
本發(fā)明涉及到以下(1)～(36)項(xiàng)。
(1)樣品中待檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征為(1)借助或不借助間隔臂使對(duì)待檢測(cè)物質(zhì)有結(jié)合能力的結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別數(shù)字信號(hào)A的載體與含有待檢測(cè)物質(zhì)的樣品在溶液中混合，其中所述載體的形狀使得，當(dāng)懸浮在溶液中并貫流于信號(hào)檢測(cè)用中空管時(shí)，相對(duì)于所述中空管的橫斷面，兩個(gè)或更多個(gè)所述載體不重復(fù)移動(dòng)；(2)使待檢測(cè)物質(zhì)與該結(jié)合子結(jié)合，使信號(hào)B在載體上形成；(3)使該載體懸浮液在該中空管中貫流；(4)檢測(cè)數(shù)字信號(hào)A和信號(hào)B；(5)將數(shù)字信號(hào)A、信號(hào)B以及待檢測(cè)物質(zhì)聯(lián)系起來(lái)；(6)將與數(shù)字信號(hào)A和待檢測(cè)物質(zhì)聯(lián)系起來(lái)的信號(hào)B的檢測(cè)數(shù)據(jù)作為待檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)數(shù)據(jù)。
(2)上述(1)記載的檢測(cè)方法，其中待檢測(cè)物質(zhì)是具有特定堿基序列的物質(zhì)，結(jié)合子是具有與待檢測(cè)物質(zhì)的堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的物質(zhì)。
(3)上述(2)記載的檢測(cè)方法，其中待檢測(cè)物質(zhì)和結(jié)合子的結(jié)合是通過(guò)互補(bǔ)堿基序列的雜交進(jìn)行的。
(4)上述(3)記載的方法，其中可識(shí)別的信號(hào)A是與結(jié)合子堿基序列有關(guān)的信號(hào)。
(5)上述(3)記載的方法，其中載體是帶有與結(jié)合子的堿基序列有關(guān)的可相互識(shí)別的信號(hào)A，含有相互不同的信號(hào)A的多個(gè)載體的混合物。
(6)上述(2)～(5)任一項(xiàng)記載的方法，其中結(jié)合子是堿基數(shù)為5～500的DNA、RNA或PNA。
(7)上述(3)～(6)任一項(xiàng)記載的方法，其中載體上信號(hào)B的形成是通過(guò)使可識(shí)別結(jié)合子堿基序列與待檢測(cè)物質(zhì)堿基序列雜交的帶有標(biāo)記的化合物結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。
(8)上述(7)記載的方法，其中可識(shí)別雜交的帶有標(biāo)記的化合物是使具有與待檢測(cè)物質(zhì)含有的、與結(jié)合子堿基序列相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列以外的剩余堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的化合物和標(biāo)記化合物結(jié)合的化合物。
(9)上述(8)記載的方法，其中具有與待檢測(cè)物質(zhì)含有的與結(jié)合子堿基序列相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列以外的剩余堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的化合物是堿基數(shù)為5～500的DNA、RNA或PNA。
(10)上述(7)記載的方法，其中可識(shí)別雜交的帶有標(biāo)記的化合物是使識(shí)別該雜交的抗體和標(biāo)記化合物結(jié)合的化合物。
(11)上述(7)記載的方法，其中可識(shí)別雜交的帶有標(biāo)記的化合物是使識(shí)別該雜交的嵌入劑和標(biāo)記化合物結(jié)合的化合物。
(12)上述(11)記載的方法，其中包括將沒(méi)有與載體結(jié)合的帶有標(biāo)記的化合物與載體分離的工序。
(13)上述(7)～(12)任一項(xiàng)記載的方法，其中標(biāo)記化合物是熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、酶或通過(guò)酶發(fā)熒光或發(fā)光的化合物。
(14)上述(13)記載的方法，其中載體是使發(fā)熒光物質(zhì)結(jié)合的載體，標(biāo)記化合物是通過(guò)能量轉(zhuǎn)移發(fā)熒光的化合物。
(15)上述(7)記載的方法，其中可識(shí)別雜交的帶有標(biāo)記的化合物是通過(guò)嵌入生成信號(hào)B的化合物。
(16)上述(1)記載的方法，其中結(jié)合子是具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。
(17)上述(1)～(16)任一項(xiàng)記載的方法，其中可識(shí)別信號(hào)A是數(shù)字信號(hào)。
(18)上述(17)記載的方法，其中數(shù)字信號(hào)A是磁學(xué)或光學(xué)上的信號(hào)。
(19)上述(17)記載的方法，其中數(shù)字信號(hào)A是條形碼。
(20)上述(1)～(19)任一項(xiàng)記載的方法，其中中空管的形狀是圓柱形，而且載體是具有比中空管的內(nèi)徑小的外形的圓柱形，該圓柱形的長(zhǎng)度比中空管的內(nèi)徑大。
(21)上述(1)～(20)任一項(xiàng)記載的方法，其中載體是圓柱形或球形。
(22)上述(21)記載的方法，其中載體內(nèi)部存在磁性粒子。
(23)上述(1)～(22)任一項(xiàng)記載的方法，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長(zhǎng)度為10μm～2cm。
(24)上述(1)～(23)任一項(xiàng)記載的方法，其中載體的比重為0.8～2.0。
(25)上述(1)～(24)任一項(xiàng)記載的方法，其中載體的表面是用樹脂包被的。
(26)一種借助或不借助間隔臂和具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體。
(27)上述(26)記載的載體，其中結(jié)合子是含有與待檢測(cè)堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的物質(zhì)。
(28)上述(26)的載體，其中結(jié)合子是具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。
(29)上述(26)～(28)任一項(xiàng)記載的載體，是內(nèi)部存在磁性粒子的載體。
(30)上述(26)～(29)任一項(xiàng)記載的載體，其中信號(hào)A是數(shù)字信號(hào)。
(31)上述(30)記載的方法，其中數(shù)字信號(hào)A是條形碼。
(32)上述(26)～(31)任一項(xiàng)記載的載體，其中載體是圓柱形或球形的。
(33)上述(26)～(32)任一項(xiàng)記載的載體，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長(zhǎng)度為10μm～2cm。
(34)上述(26)～(33)任一項(xiàng)記載的載體，其中載體的比重為0.8～2.0。
(35)上述(26)～(34)任一項(xiàng)記載的載體，其中載體的表面是用樹脂包被的。
(36)特定物質(zhì)的檢測(cè)裝置，其特征為具有信號(hào)檢測(cè)裝置、數(shù)據(jù)輸入裝置、數(shù)據(jù)處理裝置和數(shù)據(jù)輸出裝置，該信號(hào)檢測(cè)裝置具備信號(hào)檢測(cè)器A和B，這兩個(gè)檢測(cè)器可檢測(cè)處于載體上的至少兩種信號(hào)A和B，該載體借助或不借助間隔臂和具有與待檢測(cè)的堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的結(jié)合子結(jié)合；該信號(hào)檢測(cè)器A和B具有使該載體貫流的中空管，而該載體具有相對(duì)于該中空管的橫斷面不重復(fù)移動(dòng)的結(jié)構(gòu)；該數(shù)據(jù)處理裝置具備以下功能通過(guò)特定與從數(shù)據(jù)輸入裝置輸入的載體上信號(hào)A有關(guān)的待檢測(cè)特定物質(zhì)的數(shù)據(jù)和信號(hào)檢測(cè)裝置檢測(cè)的信號(hào)A和B，使載體上信號(hào)A和該特定物質(zhì)建立聯(lián)系，將該相關(guān)的數(shù)據(jù)輸出到數(shù)據(jù)輸出裝置。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。
在本發(fā)明中作為載體是懸浮于溶液中且貫流于可檢測(cè)信號(hào)A和信號(hào)B的信號(hào)檢測(cè)裝置中形成的信號(hào)檢測(cè)用中空管時(shí)，相對(duì)于中空管的橫斷面沒(méi)有重復(fù)移動(dòng)的形狀的載體，借助或不借助間隔臂與具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的物質(zhì)(結(jié)合子)結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體。
本發(fā)明中使用的載體是不溶于溶液的載體。
作為載體上的信號(hào)A只要是可分別識(shí)別無(wú)論什么信號(hào)都可以，但優(yōu)選數(shù)字信號(hào)。作為數(shù)字信號(hào)只要是數(shù)字化的信號(hào)并沒(méi)有特別限制，如條形碼、微小的點(diǎn)、微細(xì)的線等的某些組合表示的信號(hào)等，優(yōu)選條形碼。
作為使載體帶有信號(hào)A的方法沒(méi)有特別限制，例如使用可以印刷微細(xì)的條形碼、微小的點(diǎn)、微細(xì)的線等的印刷機(jī)器的方法，通過(guò)微細(xì)的激光光線使表面的反射率或折射率改變成線或點(diǎn)形狀的方法，使用聚焦等使由條形碼、或線、點(diǎn)構(gòu)成的圖形縮小到光學(xué)角度上的微細(xì)程度，使光投向的部分表面的性質(zhì)發(fā)生變化，然后通過(guò)化學(xué)處理或使調(diào)色劑吸附等的物理處理加上條形碼的方法，使通過(guò)光固化或分解的光敏感的聚合物含有色素或顏料、石墨等，對(duì)表面進(jìn)行覆蓋，然后用光照射表示信號(hào)的形狀，之后進(jìn)行腐蝕加上信號(hào)的方法；整個(gè)載體用光敏感樹脂做成的方法；使內(nèi)部存在通過(guò)磁記錄法記錄信號(hào)的磁性載體的方法等。
作為載體的形狀只要是附帶的數(shù)字信號(hào)從外部可讀取的形狀，并沒(méi)有特別限制。特別是在貫流中空管時(shí)，相對(duì)于該中空管的橫斷面不是重復(fù)移動(dòng)的形狀者優(yōu)選。從操作性、單位體積的表面積大方面來(lái)說(shuō)微小者優(yōu)選。特別是作為在后敘的使用中空管的檢測(cè)方法中使用的具體載體的形狀，相對(duì)于該中空管的形狀，可以是球形、多棱柱形、圓柱形等，其中圓柱形者優(yōu)選。形狀即使是球形也可以使用，例如通過(guò)將多個(gè)二維條形碼等信號(hào)A加到球表面上，信號(hào)A從哪一個(gè)位置都可以讀取的那樣的場(chǎng)合，或使磁性微粒子存在于載體中檢測(cè)時(shí)，通過(guò)短時(shí)間用磁力阻止載體的移動(dòng)，通過(guò)磁力使球的特定面朝向檢測(cè)方向進(jìn)行檢測(cè)。
作為載體大小，例如圓柱形時(shí)，直徑為1μm～2mm左右優(yōu)選，長(zhǎng)度為10μm～2cm左右優(yōu)選。球狀時(shí)，直徑為1μm～2mm左右優(yōu)選。
另外載體的比重0.8～2優(yōu)選，0.85～1.5更優(yōu)選，0.9～1.1特別優(yōu)選。載體懸浮液和該載體的比重差在0.1以下優(yōu)選，在0.05以下更優(yōu)選，而在0.03以下優(yōu)選。
使該載體成形的方法有在多棱形、圓柱形的模具中模塑高分子的方法，以及用各種方法切斷多棱形、圓柱形纖維狀物的方法。另外通過(guò)使用高分子的單體的懸浮聚合法、乳液聚合法等也可以制造粒子狀載體。在為中空的圓柱形的情況，使遇熱向一個(gè)方向收縮的原料和收縮少的原料的薄膜層疊，加上信號(hào)A后(裁斷或不裁斷)通過(guò)加熱使其只有一個(gè)面收縮可以形成圓柱形。
作為遇熱收縮的原料例如可舉出山登理科(株)的2000年塑料科學(xué)儀器綜合目錄、塑料編中記載的TFE收縮管、TOF收縮管、聚四氟乙烯收縮管、FEP收縮管等細(xì)或纖維狀原料或尼龍收縮管等。
載體或其表面最好是由至少難于吸附蛋白質(zhì)或含有堿基序列化合物等待檢測(cè)物質(zhì)構(gòu)成的物質(zhì)。理想的載體是親水性載體，但即使載體是疏水性的，由于最終對(duì)表面進(jìn)行物理處理或被覆處理之后，也可以使載體表面的吸附減少，所以也可以使用。作為被覆的天然高分子例如有脫乙酰殼多糖、蛋白質(zhì)、透明質(zhì)酸等。
作為載體原料沒(méi)有特別限制，但合成化合物最好，例如聚丙烯酸或其酯類、聚甲基丙烯酸或其酯類、聚醚類、聚碳酸酯、聚酯類、聚酰胺類、聚氨酸酯類、聚酰亞胺類、聚苯乙烯類、聚丁二烯、聚氯丁烯以及它們的共聚物、它們的混合物等。一般來(lái)說(shuō)作為塑料或纖維材料使用的合成高分子價(jià)廉故理想。
作為用于載體的合成高分子化合物，例如側(cè)鏈含有羥基或酯基、羧基、酰胺基、氨基、亞氨基、羥琥珀酸酯基、馬來(lái)酰亞胺基、縮水甘油基等的合成高分子化合物比較理想。作為構(gòu)成這些合成高分子的單體有諸如丙烯酸酐、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯(以上聚合后進(jìn)行水解)、羥苯乙烯、乙二醇(甲基)丙烯酸酯、三乙烯醇(甲基)丙烯酸酯等含有氧化乙烯的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥甲基酯、(甲基)丙烯酸羥丙酯等含有羥基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯等帶有環(huán)氧基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯等(甲基)丙烯酸烷基酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二乙酰丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、乙抱亞胺、丙烯酸羥琥珀酸酯等單乙烯性化合物。
作為該合成高分子化合物如由一種上述單體構(gòu)成的聚合物以及由2種以上上述單體構(gòu)成的共聚物。這些合成高分子化合物只要至少形成載體表面層就可以，內(nèi)部即使是例如聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯(polyvinyl)等疏水性高分子也可以。借助或不借助間隔臂使結(jié)合子結(jié)合的表面被制備成含有官能團(tuán)的表面最好。另外也可以使用通過(guò)反應(yīng)變成親水的高分子化合物。具體來(lái)說(shuō)作為合適的高分子化合物的例子有甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物。
該高分子化合物的合成因單體的種類和高分子化合物的種類不同而不同，但都可以通過(guò)眾所周知的方法合成。
所謂的間隔臂是結(jié)合載體和結(jié)合子的分子。這樣的間隔臂如聚乙二醇二縮水甘油醚鏈、單鏈DNA、單鏈RNA、單鏈肽核酸(peptidenucleic acid、縮寫為PNA)、肽鏈等。聚乙二醇二縮水甘油醚鏈的長(zhǎng)度以1～10個(gè)乙烯單元為優(yōu)選，1～5個(gè)單元更優(yōu)選。而使用單鏈DNA以及單鏈RNA作為間隔臂時(shí)該鏈的堿基序列無(wú)論什么樣都可以，但堿基中優(yōu)選末端含有帶有氨基的腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)的堿基。這些單鏈DNA和單鏈RNA鏈的長(zhǎng)度優(yōu)選為3～40mer，5～20mer長(zhǎng)更優(yōu)選。肽鏈數(shù)優(yōu)選1～50mer，2～30mer更優(yōu)選。
作為結(jié)合子只要具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合的能力的物質(zhì)就可以，并沒(méi)有特別限制，例如具有與樣品中待檢測(cè)物質(zhì)含有的堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的物質(zhì)、具有結(jié)合待檢測(cè)物質(zhì)能力的蛋白質(zhì)、多肽等。
作為待檢測(cè)的堿基序列或其部分序列只要是含有堿基序列，檢測(cè)上并沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選來(lái)自于與各種性狀有關(guān)的基因、與疾病有關(guān)的基因等的堿基序列。例如HCV基因、抑癌基因序列、WT-1。Klotho基因、GyrB基因、抗藥性基因、肥胖基因等都可以。
具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的蛋白質(zhì)可以是各種受體、針對(duì)各種抗原的抗體、凝集素蛋白質(zhì)等?；蛘咦鳛榻Y(jié)合子可以使用與該受體或抗體結(jié)合的配體或抗原。作為受體如VEGF受體、IL-2受體、Fc受體等。作為抗體如抗HCV抗體、抗HBs抗體、抗HBe抗體、抗GAD抗體、抗CRP抗體、抗CEA抗體、抗C肽抗體、抗胰島素抗體、抗BNP抗體、抗肌鈣蛋白T抗體、抗氧化LDL抗體、抗TBGL抗體、抗MPB64抗體、抗端粒末端轉(zhuǎn)移酶抗體等。
結(jié)合子是蛋白質(zhì)時(shí)，可以將從組織提取液、菌體提取液、或從將需要的蛋白質(zhì)基因?qū)刖w或細(xì)胞使其表達(dá)的產(chǎn)物等純化的蛋白質(zhì)直接作為結(jié)合子或?qū)?dǎo)入官能團(tuán)后的蛋白質(zhì)作為結(jié)合子。而當(dāng)結(jié)合子是低分子化合物時(shí)，低分子化合物只要是含有官能團(tuán)的物質(zhì)可以直接作為結(jié)合子，沒(méi)有官能團(tuán)的加上官能團(tuán)后作為結(jié)合子也可以。當(dāng)結(jié)合子是DNA、RNA時(shí)，可以將在末端導(dǎo)入官能團(tuán)后的DNA、RNA等作為結(jié)合子。
具有與樣品中待檢測(cè)堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的物質(zhì)的堿基數(shù)為5～500個(gè)堿基，10～300個(gè)堿基更優(yōu)選，15～200個(gè)堿基特別優(yōu)選，是具有與通常進(jìn)行檢測(cè)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA、RNA或PNA等。
結(jié)合子是具有堿基序列的物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)的堿基序列可以根據(jù)那些眾所周知的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。具有該堿基序列的物質(zhì)如單鏈DNA鏈、單鏈RNA鏈、單鏈PNA等。另外作為本發(fā)明待檢測(cè)物質(zhì)含有的堿基序列如已了解到的使已知序列的內(nèi)部發(fā)生點(diǎn)突變的基因的堿基序列也適用。此時(shí)作為與發(fā)生變異的堿基互補(bǔ)的結(jié)合子中的位點(diǎn)處于結(jié)合子的兩端的3個(gè)堿基以上的內(nèi)側(cè)比較理想，最優(yōu)選處于結(jié)合子中心部位。
具有與樣品中待檢測(cè)物質(zhì)含有的堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的結(jié)合子如果該結(jié)合子是DNA時(shí)，可以通過(guò)使用二氧化硅等載體的固相法使DNA的化學(xué)合成反應(yīng)自動(dòng)化的DNA合成儀等合成。反應(yīng)底物使用堿基的氨基和核糖的5’-OH用保護(hù)基保護(hù)、使核糖的3’-OH結(jié)合二異丙基磷酰胺化物的核苷酸衍生物。作為堿基的氨基的保護(hù)基如苯甲酰基或異丁基，而作為核糖5’-OH的保護(hù)基如二甲氧三苯甲基等。根據(jù)堿基序列以氨基以及5’-OH被保護(hù)的腺嘌呤、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶、鳥嘌呤的任一個(gè)核苷酸通過(guò)3’-OH固定于固相載體上的柱子作為初始材料，用酸除去三苯甲基(形成5’-OH)后，將3’末端帶有磷酰胺基的上述核苷酸衍生物加到四唑等適當(dāng)?shù)目s合劑中。通過(guò)碘和水將兩者的鍵轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的磷酸三酯鍵。反復(fù)進(jìn)行脫三苯甲基和縮合反應(yīng)循環(huán)，最后通過(guò)氨處理脫保護(hù)基和從固相載體上切下來(lái)。通過(guò)以上操作可以合成作為結(jié)合子的DNA。另外間隔臂是單鏈DNA時(shí)，可以進(jìn)一步連續(xù)合成該序列，其長(zhǎng)度優(yōu)選在3個(gè)堿基以上，由此可以合成帶有DNA間隔臂的DNA結(jié)合子。
以下對(duì)借助或不借助間隔臂使結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。
作為使結(jié)合子例如使蛋白質(zhì)結(jié)合在載體表面的方法，希望在載體表面存在側(cè)鏈或末端的羧基或氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、亞氨基、羥基琥珀酸酯基、馬來(lái)酰亞胺基等經(jīng)反應(yīng)后可以化學(xué)結(jié)合的基團(tuán)，當(dāng)不存在這樣的情況時(shí)，也可以使用通過(guò)紫外線、放射線等物理或化學(xué)處理使可以進(jìn)行這些反應(yīng)的基團(tuán)暴露出來(lái)的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，制作官能團(tuán)也是可能的。
作為使蛋白質(zhì)等結(jié)合于該載體的可反應(yīng)基團(tuán)的方法有一般都知道的化學(xué)方法，例如已知的作為使蛋白質(zhì)的氨基或羧基結(jié)合于載體上的官能團(tuán)的方法有通過(guò)碳化二亞胺等縮合和使羰基變成活性酯之后與氨基反應(yīng)的方法，或?qū)€基或馬來(lái)酰亞胺預(yù)先掛到載體上，然后使它與結(jié)合子的馬來(lái)酰亞胺或巰基反應(yīng)的方法以及將異硫氰酸酯基、縮水甘油基、N-羥基琥珀酰亞胺基等預(yù)先掛到載體上，使它與結(jié)合子的氨基反應(yīng)的方法，可以使用上述任一種方法。另外這樣做成的載體為抑制非特異性吸附或反應(yīng)，也可以用BSA等處理之后進(jìn)行封閉。
間隔臂是聚乙二醇二縮水甘油，結(jié)合子是蛋白質(zhì)、載體表面有環(huán)氧基時(shí)，蛋白質(zhì)與載體的結(jié)合可以象以下那樣進(jìn)行。向載體粒子中加入氫氧化銨或己二胺鹽酸鹽，加入的量是環(huán)氧基的10～100倍摩爾量，于60～70℃、pH10～12條件下反應(yīng)0.5～2天，使粒子表面氨基化。反應(yīng)后，通過(guò)離心分離洗凈，根據(jù)需要通過(guò)離子交換水進(jìn)行透析，除去未反應(yīng)的氫氧化銨或己二胺鹽酸鹽。向?qū)肓税被妮d體中加入氨基的50～200倍摩爾量的聚乙二醇二縮水甘油，于pH10～12、溫度20～40℃條件下，反應(yīng)0.5～2天，使間隔臂與載體結(jié)合。間隔臂帶有的環(huán)氧基與蛋白質(zhì)的結(jié)合按照前面方法進(jìn)行。
使DNA等結(jié)合于載體表面而使用的載體可以直接使用在載體表面存在有側(cè)鏈或末端的羧基或氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、酰胺基、羥基琥珀酸酯基、馬來(lái)酰亞胺基等基團(tuán)經(jīng)反應(yīng)后可以化學(xué)結(jié)合的載體，當(dāng)不存在這樣的基團(tuán)時(shí)，也可以使用通過(guò)放射線等物理或化學(xué)處理使可以進(jìn)行這些反應(yīng)的基團(tuán)暴露出來(lái)的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，形成官能團(tuán)也是可能的。
使DNA等結(jié)合于該載體可反應(yīng)基團(tuán)的方法有一般都知道的化學(xué)方法，例如作為使DNA等結(jié)合于載體表面上的氨基或羧基的方法已知有通過(guò)碳化二亞胺等縮合和使羰基變成活性酯之后與氨基反應(yīng)的方法，或?qū)€基或馬來(lái)酰亞胺預(yù)先掛到載體上，然后使帶有馬來(lái)酰亞胺或巰基的載體與DNA等反應(yīng)的方法以及將異硫氰酸酯基、碳化二亞胺基、N-羥基琥珀酰亞胺基預(yù)先掛在載體上，然后使它與氨基反應(yīng)的方法，可以使用上述任一種方法。另外也可以使用已知的DNA合成法使核酸的堿基一個(gè)一個(gè)地聚合在載體表面合成DNA等方法。
具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)間隔臂的種類、載體的種類和結(jié)合子的種類確定載體、間隔臂和結(jié)合子的各結(jié)合方法。例如結(jié)合子是DNA時(shí)一般都是通過(guò)使DNA結(jié)合子末端的堿基帶有的氨基與載體或間隔臂的環(huán)氧基、羰基、醛基、羥基等結(jié)合來(lái)使載體和結(jié)合子結(jié)合。
間隔臂和結(jié)合子是單鏈DNA時(shí)，載體表面帶有環(huán)氧基時(shí)，該DNA結(jié)合子和載體的結(jié)合例如按如下方式進(jìn)行。
按照上述的DNA合成法合成帶有DNA的間隔臂的DNA結(jié)合子以及含有與該結(jié)合子互補(bǔ)序列的單鏈DNA且沒(méi)有間隔臂序列的單鏈DNA。然后使兩者雜交，做成雙鏈，保護(hù)含有待檢測(cè)堿基序列的堿基中的氨基，使游離的間隔臂部分中的堿基中的氨基(根據(jù)需要末端可導(dǎo)入氨基)與載體的環(huán)氧基結(jié)合。與該載體結(jié)合后，使含有與結(jié)合子互補(bǔ)的序列且不含有間隔臂的單鏈DNA解離，可以制備目的載體結(jié)合DNA結(jié)合子。
這樣做成的載體為抑制非特異性吸附或反應(yīng)，所以可以BSA等處理之后進(jìn)行封閉。
雜交根據(jù)需要可以在含有甲酰胺、鹽、蛋白質(zhì)、穩(wěn)定劑、緩沖劑的水溶液中進(jìn)行。以下將該溶液稱為雜交液。甲酰胺濃度為0～60％。鹽可以使用氯化鈉、氯化鉀等無(wú)機(jī)鹽，檸檬酸鈉、草酸鈉等有機(jī)酸鹽，鹽濃度為0～2.0M、優(yōu)選0.15～1.0M。蛋白質(zhì)可以使用血清白蛋白等。穩(wěn)定劑可用フィコ-ル。緩沖劑可用磷酸緩沖液，濃度為1～100mM優(yōu)選。上述互補(bǔ)的2種DNA的雜交是在雜交液中加入分別合成的等摩爾濃度的單鏈DNA，于50～90℃下加熱1分鐘～6小時(shí)后，慢慢冷卻來(lái)進(jìn)行的。
這樣一來(lái)制備出了帶有單鏈多核苷酸間隔臂的部分雙鏈DNA。
與載體結(jié)合的過(guò)程如下用1～100mM磷酸緩沖液洗帶有環(huán)氧基的載體粒子，使粒子平衡后，在與洗凈用緩沖液同樣的溶液中將載體和帶有用上述方法制作的單鏈DNA間隔臂的部分雙鏈DNA混合，于20～50℃下保溫5～50小時(shí)。通過(guò)用含有1～3M氯化鈉等鹽類的水溶液洗，除去未反應(yīng)的DNA后，對(duì)于存在于載體上的未反應(yīng)的環(huán)氧基加Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫50小時(shí)使其開環(huán)。這樣就可制備結(jié)合于載體上的雙鏈DNA。
通過(guò)將該結(jié)合載體雙鏈DNA在雜交用溶液中洗凈，可以制備使沒(méi)有間隔臂的單鏈DNA解離的結(jié)合于載體的單鏈DNA。使用雜交溶液，于50～90℃下，經(jīng)千～10萬(wàn)g的離心分離，反復(fù)數(shù)次進(jìn)行洗凈。
當(dāng)間隔臂是聚乙二醇二縮水甘油醚鏈，結(jié)合子是DNA鏈，載體表面含有環(huán)氧基時(shí)，DNA結(jié)合子和載體的結(jié)合可以與上述的間隔臂和結(jié)合子是單鏈DNA，載體表面含有環(huán)氧基情形一樣進(jìn)行。
除了使用這樣的合成高分子的化學(xué)固定法以外，也可以利用Haun，M和Wasi，S的方法[Anal.Biochem.，191，337(1990)]將鏈霉抗生物素固定于載體上后，利用鏈霉抗生物素和生物素的親和性固定含有生物素的間隔臂、或末端被生物素標(biāo)記的結(jié)合子本身。另外也可以利用在使載體和間隔臂、或載體與結(jié)合子各自分別結(jié)合后，利用兩者的親和性使生物學(xué)上具有親和性的兩類物質(zhì)結(jié)合的方法。
在使結(jié)合子結(jié)合于帶有上述信號(hào)A的載體時(shí)，使特定的結(jié)合子S1結(jié)合于帶有信號(hào)A的A1載體上。同樣可以使其它的結(jié)合子S2結(jié)合于帶有信號(hào)A的A2載體上。例如，可以使特定結(jié)合子S1結(jié)合于分配條形碼號(hào)01的載體上，其它的特定結(jié)合子S2結(jié)合于分配條形碼號(hào)02的載體上。在本發(fā)明中，只要可以對(duì)應(yīng)識(shí)別特定結(jié)合子和信號(hào)A，一次反應(yīng)可檢測(cè)的結(jié)合子的種類的上限就沒(méi)有特別限定。
在本發(fā)明中由于通過(guò)使用多個(gè)借助或不借助間隔臂使含有特定堿基序列的S1、S2、…Sn的結(jié)合子分別與帶有信號(hào)A的A1、A2…An的載體結(jié)合的載體，可以使特定堿基序列與信號(hào)A對(duì)應(yīng)識(shí)別，所以在一次反應(yīng)中可檢測(cè)的堿基序列的種類上限沒(méi)有特別限制。
以下就待檢測(cè)物質(zhì)的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。用于檢測(cè)的生物體樣品可以是直接來(lái)自各種臟器、組織、血液等的未經(jīng)純化的樣品，或是利用低分子化合物、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等核酸分子的提取、純化方法制備的樣品。
以下就含有待檢測(cè)堿基序列的樣品的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。
例如當(dāng)用于檢測(cè)的樣品是DNA或RNA時(shí)，可以通過(guò)眾所周知的DNA或RNA提取方法從各種臟器、組織、血液等制備。分離的DNA或RNA用特定的限制酶進(jìn)行酶切，制備成含有待檢測(cè)特定堿基序列為5～500mer長(zhǎng)的、優(yōu)選是10～300mer長(zhǎng)的單鏈DNA片段或單鏈RNA片段。樣品中的DNA等堿基序列也可以使用通過(guò)PCR、TMA或NASBA法擴(kuò)增的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，在檢測(cè)生物體樣品中的堿基序列時(shí)只要將DNA等做成片段就可以。不只是生物體樣品、含有通過(guò)合成等制造的堿基序列的化合物也可以用作樣品。
樣品中待檢測(cè)物質(zhì)與結(jié)合子的結(jié)合根據(jù)需要可以在含有鹽、蛋白質(zhì)、穩(wěn)定劑、緩沖劑、表面活性劑等的水溶液中進(jìn)行。使用的鹽有氯化鈉、氯化鉀等無(wú)機(jī)鹽，檸檬酸鈉、草酸鈉等有機(jī)酸鹽，鹽濃度為0～2.0M。使用的蛋白質(zhì)有血清白蛋白等。緩沖劑有磷酸緩沖劑等，濃度優(yōu)選為1～100mM。作為結(jié)合的條件可以于10～70℃下加熱1～60分鐘后，根據(jù)需要進(jìn)行冷卻來(lái)進(jìn)行。
以下敘述將借助或不借助間隔臂使結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體與含有待檢測(cè)物質(zhì)的樣品在溶液中混合，使待檢測(cè)物質(zhì)和該載體上的結(jié)合子結(jié)合，通過(guò)結(jié)合使得新的信號(hào)B在載體上形成的方法。
例如結(jié)合子是蛋白質(zhì)時(shí)，可以按以下那樣過(guò)程進(jìn)行。信號(hào)B只要是由待檢測(cè)蛋白質(zhì)等物質(zhì)和該載體上的蛋白質(zhì)等物質(zhì)(無(wú)論哪一方都是蛋白質(zhì))的結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)無(wú)論什么樣的信號(hào)都可以，可以利用與振子等振動(dòng)有關(guān)的共振現(xiàn)象直接測(cè)定重量增加；使標(biāo)記化合物結(jié)合于識(shí)別待檢測(cè)物質(zhì)的抗體等，以該標(biāo)記作為信號(hào)B的方法；以及使標(biāo)記化合物結(jié)合于識(shí)別結(jié)合子的抗體等，待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合結(jié)合子時(shí)，該抗體不與結(jié)合子結(jié)合，將沒(méi)有結(jié)合的抗體的標(biāo)記作為信號(hào)B進(jìn)行檢測(cè)也是有可能的。另外結(jié)合子之間借助于蛋白等待檢測(cè)物質(zhì)連接的那樣情況下，可以將一方含有結(jié)合子的信號(hào)A作為信號(hào)B進(jìn)行檢測(cè)。
作為使待檢測(cè)蛋白和結(jié)合子結(jié)合的條件是在通常水溶液中蛋白不變性的條件下進(jìn)行的。例如在具有pH3-11左右緩沖能力的水溶液(也可以含有表面活性劑或用于維持蛋白的功能的輔助劑)中，溫度為1～90℃，優(yōu)選5～60℃左右。
然后沒(méi)有與結(jié)合子結(jié)合的標(biāo)記化合物和樣品中的殘余物質(zhì)根據(jù)需要可以通過(guò)離心分離操作或過(guò)濾操作等除去。
作為標(biāo)記化合物如熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、酶、或通過(guò)酶產(chǎn)生熒光、發(fā)光的化合物等。作為熒光物質(zhì)如熒光素異硫氰酸酯(鹽)(以下縮寫為FITC)和德克薩斯紅(Texas Red)等。
作為熒光標(biāo)記如吖啶鎓衍生物和釕配位化合物。具體來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利第4918192號(hào)、4946958號(hào)、4950613號(hào)或Clin.Chem.29(8)，1474-1479(1983)報(bào)道的吖啶鎓類優(yōu)選。而釕配位化合物以Clin.Chem.37(9)，1534-1539(1901)報(bào)道的優(yōu)選，該化合物可作為電子供體的同時(shí)，還能進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光。
以通過(guò)酶產(chǎn)生熒光、發(fā)光的化合物作為底物例如作為過(guò)氧化物酶的底物有氨基苯二酰肼化合物、光澤精(ルミゲニン)化合物等。或者作為堿性磷酸酶的底物如3-(2’-金剛烷基)-4-甲氧基-4-(3”磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)鹽、吖啶鎓的磷酸衍生物APS2，APS3，APS5等[以上為L(zhǎng)umigen Inc的發(fā)光化合物，H.Akhavan-Tafti，Z.Arghavani等，John Wiley and Sons，Chichester，497-500(1997)]。
標(biāo)記化合物是熒光物質(zhì)時(shí)，使熒光物質(zhì)也結(jié)合于載體上，遇到光時(shí)，也可以利用通過(guò)來(lái)自一方熒光物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移使結(jié)合的另一方熒光物質(zhì)發(fā)熒光的現(xiàn)象進(jìn)行標(biāo)記。
在檢測(cè)信號(hào)B時(shí)，如果是熒光，將含有載體溶液通過(guò)的微小空管部分置于熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)部位?，F(xiàn)在細(xì)胞分類器中使用的那樣的方法也適用。檢測(cè)熒光時(shí)雖然不需要光源，但如有必要最好加上使發(fā)光開始的試劑或提供能量的裝置。作為發(fā)光的檢測(cè)裝置使用高靈敏度的光子計(jì)數(shù)儀比較合適，當(dāng)發(fā)光強(qiáng)時(shí)熒光檢測(cè)儀的光學(xué)部分也可以使用。
以下就諸如使借助或不借助間隔臂使含有與待檢測(cè)的堿基序列或與其部分序列互補(bǔ)的結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體和含有待檢測(cè)堿基序列的樣品在溶液中混合，使待檢測(cè)堿基序列和該載體上含有的互補(bǔ)堿基序列的堿基序列雜交，由此在載體上形成的新信號(hào)B的方法進(jìn)行敘述。
信號(hào)B只要是通過(guò)待檢測(cè)堿基序列和該載體上含有的互補(bǔ)堿基序列的堿基序列雜交形成的雙鏈產(chǎn)生的信號(hào)無(wú)論什么樣的信號(hào)都可以，可以直接測(cè)定雙鏈的吸收，但使可識(shí)別形成雙鏈的雜交的帶有標(biāo)記的化合物結(jié)合的方法比較理想。作為可識(shí)別該結(jié)合子的堿基序列和樣品的堿基序列雜交的帶有標(biāo)記的化合物有諸如使標(biāo)記化合物和與樣品中特定堿基序列除去對(duì)應(yīng)于結(jié)合子互補(bǔ)序列以外的其余堿基序列互補(bǔ)的堿基序列結(jié)合的化合物(以下縮寫為標(biāo)記結(jié)合子)，使標(biāo)記化合物與識(shí)別結(jié)合子的堿基序列和樣品的堿基序列的雜交的抗體結(jié)合的化合物，以及使標(biāo)記化合物和識(shí)別結(jié)合子的堿基序列和樣品的堿基序列的雜交的嵌入劑結(jié)合的化合物等。
雜交是使用上述的雜交溶液在嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。例如，將DNA結(jié)合子結(jié)合載體和含有DNA片段的樣品添加到該雜交溶液中，于50～90℃，最好是在60～75℃下加熱1分鐘～24小時(shí)，最好是加熱5～15分鐘。
接下來(lái)，根據(jù)需要通過(guò)離心分離或過(guò)濾操作對(duì)以下化合物進(jìn)行分離沒(méi)有雜交的、含有與樣品中結(jié)合子互補(bǔ)的堿基序列的化合物，以及沒(méi)有與帶有信號(hào)A的載體形成復(fù)合物的、與樣品中特定堿基序列除去對(duì)應(yīng)于結(jié)合子互補(bǔ)序列以外的其余堿基序列互補(bǔ)的堿基序列結(jié)合的化合物，使標(biāo)記化合物和識(shí)結(jié)合子堿基序列與樣品堿基序列的雜交的抗體結(jié)合的化合物，以及使標(biāo)記化合物與識(shí)別結(jié)合子堿基序列和樣品堿基序列的雜交的嵌入劑結(jié)合的化合物。
使標(biāo)記化合物和樣品中標(biāo)記結(jié)合子、標(biāo)記化合物與識(shí)別結(jié)合子堿基序列和樣品堿基序列的雜交的抗體結(jié)合的化合物、標(biāo)記化合物與識(shí)別結(jié)合子堿基序列和樣品堿基序列的雜交的嵌入劑結(jié)合的化合物等的檢測(cè)可以根據(jù)該化合物的標(biāo)記種類進(jìn)行。
作為標(biāo)記化合物如上述的熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、或通過(guò)酶產(chǎn)生熒光、發(fā)光的化合物等。
另外由于已雜交的部分變成了雙鏈，如添加嵌入劑，可使其嵌入。此時(shí)如果是通過(guò)嵌入發(fā)熒光的化合物，只有存在已雜交的化合物時(shí)發(fā)熒光，所以互補(bǔ)堿基序列沒(méi)有處于載體表面的堿基序列不顯熒光，由于不必除去剩余嵌入劑或沒(méi)有雜交的物質(zhì)，所以特別理想。
在嵌入劑中有溴化乙錠等化合物或4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽n-水合物(DAPI)SYBR Green 1(Molecular Probe公司生產(chǎn))、Pico Green(Molecular Probe公司生產(chǎn))、2-甲基-4，6-雙-(4-N，N-二甲氨基苯酚)吡啶鎓(MBP佳能公司生產(chǎn))、2-甲基-4，6-雙-(4-N，N-二甲氨基苯基)硫吡啶鎓(佳能公司生產(chǎn))等嵌入劑。另外也適用若未雜交則在堿性條件下不分解發(fā)光的吖啶鎓酯等發(fā)光化合物。
使用標(biāo)記結(jié)合子時(shí)，優(yōu)選另外添加具有與靠近雜交部位附近的部分序列互補(bǔ)序列的DNA標(biāo)記物之后，使它們雜交，然后除去沒(méi)有雜交的標(biāo)記結(jié)合子之后，標(biāo)記結(jié)合子形成只與雜交的部位結(jié)合的狀態(tài)。作為除去沒(méi)有雜交的標(biāo)記結(jié)合子的方法使用離心分離或過(guò)濾的方法比較合適。除了除去沒(méi)有雜交的標(biāo)記結(jié)合子的方法以外，使沒(méi)有雜交的標(biāo)記結(jié)合子鈍化也可以。
標(biāo)記化合物是熒光物質(zhì)時(shí)，使熒光物質(zhì)也結(jié)合于載體上，遇到光時(shí)，也可以利用通過(guò)來(lái)自一方熒光物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移而使雜交的另一方的熒光物質(zhì)發(fā)熒光的現(xiàn)象進(jìn)行標(biāo)記。此時(shí)添加含有與靠近樣品中DNA或RNA雜交部位附近序列互補(bǔ)的DNA序列的熒光物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記物，使其雜交。一遇到光，能量從一方熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一方熒光物質(zhì)，由于只有雜交的產(chǎn)物發(fā)熒光，所以如果互補(bǔ)的DNA序列或RNA沒(méi)有在載體上，則熒光弱或沒(méi)有熒光，而互補(bǔ)的DNA或RNA處于載體上時(shí)熒光強(qiáng)或有熒光。
在檢測(cè)信號(hào)B時(shí)，如果是用熒光，將含有載體溶液通過(guò)的微小空管部分置于熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)部位?，F(xiàn)在細(xì)胞分類器中使用的方法也適用。檢測(cè)熒光時(shí)雖然不需要光源，但如有必要加上引起發(fā)光的試劑或提供能量的裝置也可以。作為發(fā)光的檢測(cè)裝置使用高靈敏度的光子計(jì)數(shù)儀比較好，當(dāng)發(fā)光強(qiáng)時(shí)也可以使用熒光檢測(cè)儀的光學(xué)部分。
中空管為由細(xì)管形成的圓柱形時(shí)，載體能夠每次一個(gè)通過(guò)圓柱長(zhǎng)方向的形狀的中空管最好。而與中空管連接的溶液供給裝置最好是具有逐漸變窄與微小空管連接的中空管。在使載體通過(guò)逐漸變窄的溶液供給裝置的管中，使載體最終與直徑范圍被設(shè)定為一次不能通過(guò)2個(gè)載體的中空管連通的方法最好。由于逐漸變窄，可以防止載體彼此堵塞管子。
反應(yīng)后，可以使與DNA或RNA等雜交后的載體和沒(méi)有雜交的載體通過(guò)中空管，雜交的載體通過(guò)時(shí)，由于產(chǎn)生熒光或產(chǎn)生發(fā)光或者發(fā)光或熒光強(qiáng)度相對(duì)于背景很強(qiáng)時(shí)，與各個(gè)載體信號(hào)同時(shí)或前后對(duì)有無(wú)熒光或發(fā)光，或其強(qiáng)弱進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)的信號(hào)依次輸入計(jì)算機(jī)，將各個(gè)載體的信號(hào)與相應(yīng)的堿基序列聯(lián)系起來(lái)，顯示有無(wú)檢測(cè)對(duì)象DNA或RNA序列。結(jié)果可以檢測(cè)出存在于檢測(cè)樣品中的相當(dāng)于帶有熒光或發(fā)光(或熒光或發(fā)光強(qiáng)度強(qiáng))的載體顯示出信號(hào)的堿基序列。由于檢測(cè)部位小，要使整個(gè)載體通過(guò)需要較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，可使用多個(gè)信號(hào)和熒光或發(fā)光的檢測(cè)部位，將流路并列設(shè)置，將各個(gè)檢測(cè)部位檢測(cè)的信息匯集到數(shù)據(jù)處理裝置，進(jìn)行解析。
使該溶液通過(guò)具有可使上述載體一個(gè)一個(gè)通過(guò)的那樣的微小中空管的管子，通過(guò)時(shí)載體帶有的信號(hào)A和樣品中存在待檢測(cè)堿基序列時(shí)載體上形成的信號(hào)B可大致同時(shí)檢測(cè)出來(lái)，信號(hào)A和信號(hào)B只要是從同一載體發(fā)出的，如果可以判別，也可以分別檢測(cè)。在檢測(cè)數(shù)字信號(hào)時(shí)，近年來(lái)可確切讀出數(shù)字信號(hào)的儀器已經(jīng)開發(fā)了很多，只要具有讀出微小信號(hào)能力的儀器無(wú)論用哪一種都可以。例如作為讀出微小數(shù)字信號(hào)的方法有通過(guò)光學(xué)擴(kuò)大，如通過(guò)條形碼觸摸掃描儀那樣的原理讀出的方法，或通過(guò)CCD照相機(jī)等以影像一旦獲得，通過(guò)放大或直接讀出的方法，或用微小的激光照射到載體上后，通過(guò)反射光或透射光讀出的方法等。在通過(guò)CD等使用的磁光學(xué)記錄的情況下，用與通過(guò)CD等使用一樣的激光進(jìn)行光學(xué)讀出的方法優(yōu)選。
在本發(fā)明中通過(guò)使用預(yù)先已知量的樣品DNA等對(duì)待檢測(cè)物質(zhì)做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以對(duì)樣品中的DNA等待檢測(cè)物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
本發(fā)明有可能有例如以下那樣的應(yīng)用。
以傳染病患者的血清作為檢測(cè)樣品，使各種傳染病病原的適當(dāng)抗原結(jié)合于載體上，使用作為標(biāo)記使熒光標(biāo)記化合物或發(fā)光標(biāo)記化合物結(jié)合于抗人免疫球蛋白抗體，無(wú)論傳染病患者感染什么種類的傳染病通過(guò)一次操作就可判明。
以過(guò)敏患者的血清作為檢測(cè)樣品，使各種過(guò)敏原的適當(dāng)抗原結(jié)合于載體上，使用作為標(biāo)記使熒光標(biāo)記化合物或發(fā)光標(biāo)記化合物結(jié)合于抗人免疫球蛋白抗體，無(wú)論患者感染什么種類的過(guò)敏原通過(guò)一次操作就可判明。
以某一細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物(ラィゼ-ト)作為樣品，使各種蛋白質(zhì)或低分子化合物結(jié)合于載體上，作為標(biāo)記使用在針對(duì)結(jié)合于載體上的各種蛋白質(zhì)或低分子化合物的抗體上結(jié)合了熒光標(biāo)記化合物或發(fā)光標(biāo)記化合物者，如果樣品中存在對(duì)結(jié)合在載體上的各種蛋白質(zhì)或低分子化合物有親和性的物質(zhì)，被標(biāo)記的抗體就不能反應(yīng)，那么樣品中應(yīng)該存在與沒(méi)有結(jié)合熒光標(biāo)記化合物或發(fā)光標(biāo)記化合物的載體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合物有親和性的物質(zhì)，細(xì)胞中該物質(zhì)的探索通過(guò)一次操作就可判明。這種情況下，在載體上結(jié)合DNA的時(shí)候，也有可能檢出與該DNA有親和性的蛋白，例如與DNA啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白質(zhì)。另外在此情況下，當(dāng)樣品中存在使結(jié)合在載體上的蛋白質(zhì)彼此有結(jié)合的物質(zhì)的時(shí)候，2個(gè)載體就會(huì)在有結(jié)合子存在處面對(duì)面接合。在可以判定這種結(jié)合的檢測(cè)之時(shí)，通過(guò)調(diào)整條形碼的方向或檢測(cè)時(shí)間間隔，可以檢測(cè)該物質(zhì)。
另外由于近年來(lái)基因克隆、基因序列解析技術(shù)的進(jìn)步，得到了很多新的基因，其中的很多基因它們具有什么樣的功能還不清楚。本發(fā)明也可以應(yīng)用于那樣功能不清楚的基因序列編碼的蛋白質(zhì)的功能解析中。例如，將該基因片段配置在5’上游之后，在其3’下游連接編碼綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein)(以下稱為GFP)的基因序列，將該基因編碼的蛋白質(zhì)作為與GFP的融合蛋白表達(dá)，通過(guò)將這樣熒光標(biāo)記的功能未知的基因編碼的蛋白質(zhì)固定于載體上后，與帶有固定了各種已知物質(zhì)的條形碼的載體溫育，通過(guò)監(jiān)測(cè)條形碼和熒光信號(hào)，監(jiān)測(cè)與功能未知基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)，對(duì)與該物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行篩選是有可能的。就是說(shuō)，通過(guò)使用本方法，使對(duì)功能未知基因編碼的蛋白質(zhì)的機(jī)能很容易地進(jìn)行解析成為可能。另外如果利用有變異的GFP，由于各種變異基因具有不同的熒光，通過(guò)使具有各種不同熒光的GFP結(jié)合于希望解析的目的基因的3’下游，對(duì)多個(gè)功能未知基因的解析同時(shí)有效地進(jìn)行也是有可能的。
而上述例子中使用的標(biāo)記化合物不一定非得用GFP，只要是有可能通過(guò)基因工程技術(shù)由基因表達(dá)蛋白，其本身帶有任何信號(hào)都可以利用。例如，水母發(fā)光蛋白和蟲熒光素酶那樣的酶也可以用于檢測(cè)系統(tǒng)中。
某一蛋白質(zhì)和與該蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)或低分子物質(zhì)或啟動(dòng)子等作用于蛋白質(zhì)的物質(zhì)在接近生物體內(nèi)條件的溶液中相互作用、結(jié)合。例如將預(yù)先該蛋白質(zhì)掛在載體上，然后添加與它相互作用的物質(zhì)，通過(guò)溫育使載體上的該蛋白質(zhì)和與其相互作用的物質(zhì)生成復(fù)合體。當(dāng)存在有能力使結(jié)合于載體上的蛋白質(zhì)之間結(jié)合的物質(zhì)時(shí)，使兩個(gè)載體進(jìn)行結(jié)合的面面對(duì)面會(huì)合。為了闡明生成的復(fù)合體是什么樣，使結(jié)合于復(fù)合體上其種類已闡明的標(biāo)記化合物進(jìn)一步反應(yīng)，檢測(cè)有無(wú)標(biāo)記。這樣可以判定某一蛋白質(zhì)和與該蛋白質(zhì)其相互作用的物質(zhì)是否存在。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示本發(fā)明裝置的概圖。
圖2表示本發(fā)明裝置的概圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式實(shí)施例1(1)帶有信號(hào)A載體的制作將三菱麗陽(yáng)公司生產(chǎn)的直徑1.5m、長(zhǎng)15cm的聚甲基丙烯酸甲酯纖維于1mol/L的NaOH水溶液中在80℃下溫育2小時(shí)，對(duì)表面進(jìn)行水解，成為羧基Na鹽，洗凈后用0.02鹽酸溶液又可以將它恢復(fù)為羧基。一邊使該纖維轉(zhuǎn)動(dòng)，一邊用激光標(biāo)記CLM-03型印刷機(jī)直接印刷編碼128的條形碼。將印有條形碼部分切下，做成長(zhǎng)15mm的載體。同樣印刷條形碼02，切下，做成同樣的載體。
(2)載體結(jié)合單鏈DNA(載體結(jié)合結(jié)合子)的制備將含有條形碼01的載體50條分散于HEPES緩沖液10ml中，添加1μmol的寡DNA，該寡DNA含有由5’末端帶有氨基的15個(gè)堿基組成的序列號(hào)1堿基序列。然后再添加WSC[水溶性碳化二亞胺Watersoluble carbodiimide，化合物名稱為1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，鹽酸鹽，同仁化學(xué)公司制造]50μmol，將含有序列1堿基序列的寡DNA通過(guò)氨基固定于該載體上。結(jié)合了含有序列1堿基序列的寡DNA的載體在1％BSA溶液中進(jìn)行封閉，用蒸餾水洗凈，制備出帶有結(jié)合了含有序列1堿基序列的寡DNA的條形碼01的載體。序列1堿基序列中的5’末端的AAA是作為間隔臂插入的。
同樣使含有由5’末端帶有氨基的15個(gè)堿基組成的序列號(hào)2堿基序列的寡DNA結(jié)合于含有條形碼02的載體50條上進(jìn)行同樣處理，制備出帶有結(jié)合了含有序列2堿基序列的寡DNA的條形碼02的載體。
(3)結(jié)合熒光的單鏈DNA(結(jié)合熒光的結(jié)合子)的制備使FITC(熒光素異硫氰酸鹽)與含有序列3堿基序列的寡DNA的3’末端反應(yīng)，制備熒光標(biāo)記的寡DNA 2nmol/ml的溶液。
(4)檢測(cè)樣品DNA的制備制備含有與序列1堿基序列和序列3堿基序列互補(bǔ)的序列4堿基序列的寡DNA，溶解于TE緩沖液(10mmol/L Tris、1mmol/L EDTA)制備成濃度為1nmol/l的檢測(cè)溶液。
制備含有與序列1堿基序列和序列3堿基序列不互補(bǔ)的序列5堿基序列的寡DNA，溶解于TE緩沖液制備成濃度為1nmol/ml的檢測(cè)溶液。
(5)雜交向含有分別帶有上述(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加上述(3)制備的結(jié)合熒光的單鏈DNA(結(jié)合熒光的結(jié)合子)100μL和含有上述(4)制備的序列4堿基序列的檢測(cè)樣品DNA、含有序列5堿基序列的檢測(cè)樣品DNA或TE緩沖液100μL，分別于50℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然后用東洋濾紙公司生產(chǎn)的醋酸纖維素的0.8μm濾膜(C080A047A)過(guò)濾，用0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7、含有1mol/LNaCl)洗凈，再將載體分散于10ml同樣的緩沖液中。
(6)檢測(cè)制作圖1所示的檢測(cè)裝置，一邊使上述(5)制備的各個(gè)溶液通過(guò)信號(hào)檢測(cè)裝置中的中空管，一邊進(jìn)行條形碼和熒光的檢測(cè)。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產(chǎn)的Hand Laser Scanner SL-114型。熒光檢測(cè)機(jī)使用日立F-4000型熒光分光光度計(jì)，用激發(fā)波長(zhǎng)495nm、熒光波長(zhǎng)520nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。中空管是石英玻璃管，內(nèi)徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由于條形碼的信號(hào)和熒光的信號(hào)檢測(cè)的時(shí)間差為36秒，按照時(shí)間差使含有特定條形碼的載體上的熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)。
熒光強(qiáng)度考慮到噪音，將檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的最大值作為熒光強(qiáng)度，將堿基序列一樣的5個(gè)條形碼02載體具有的熒光強(qiáng)度的平均值作為1。
表1給出了檢測(cè)結(jié)果。
表1

結(jié)果可以確認(rèn)對(duì)應(yīng)于條形碼01的載體的熒光值明顯高。而在含有與條形碼01的結(jié)合子DNA的堿基序列不互補(bǔ)的序列5堿基序列的DNA檢測(cè)樣品以及只有載體(無(wú)DNA)的樣品中，與帶有任一條形碼信號(hào)載體對(duì)應(yīng)的熒光值都低，由此表明利用本發(fā)明方法可以對(duì)特定序列進(jìn)行特異檢測(cè)。
實(shí)施例2向含有分別帶有實(shí)施例1(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加含有實(shí)施例1(4)制備的堿基序列4堿基序列的檢測(cè)樣品DNA、含有序列5堿基序列的檢測(cè)樣品DNA或TE緩沖液100μL，分別于50℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。然后添加用TE緩沖液稀釋了5000倍的SYBR GreenI溶液10mL，于室溫下緩慢攪拌，加熱30分鐘后，象實(shí)施例1那樣使用圖1的裝置進(jìn)行測(cè)定。而在熒光檢測(cè)中，用激發(fā)波長(zhǎng)254nm、熒光波長(zhǎng)520nm進(jìn)行測(cè)定。
熒光強(qiáng)度與實(shí)施例1一樣將堿基序列一樣的5個(gè)條形碼02的載體具有的熒光強(qiáng)度的平均值作為1。
表2給出了檢測(cè)結(jié)果。
表2

結(jié)果可以確認(rèn)對(duì)應(yīng)于條形碼01的載體的熒光值明顯高。而在含有與條形碼01的結(jié)合子DNA的堿基序列不互補(bǔ)的序列5堿基序列DNA檢測(cè)樣品以及只有載體(無(wú)檢測(cè)樣品)的樣品中，與帶有任一個(gè)條形碼信號(hào)的載體對(duì)應(yīng)的熒光值都低，由此表明利用本發(fā)明方法可以對(duì)特定序列進(jìn)行特異檢測(cè)。另外利用本發(fā)明的方法進(jìn)行雜交操作后，不需要載體和未結(jié)合標(biāo)記的分離操作就可通過(guò)簡(jiǎn)便操作進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例3使吖啶鎓-I(同人化學(xué)公司制造)與在具有序列3堿基序列的寡DNA的5’末端開始的第6位鳥嘌呤導(dǎo)入氨基的寡DNA結(jié)合，制備2nmol/ml的溶液(以下簡(jiǎn)寫為吖啶鎓標(biāo)記結(jié)合子)。
向含有分別帶有實(shí)施例1(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.1mol/L的琥珀酸鋰緩沖液(pH5)、20％月桂基硫酸鋰，0.4mol/LLiCl，20mmol/L EGTA、20mmol/L EDTA 500μl中添加含有實(shí)施例1(4)制備的具有序列4堿基序列的檢測(cè)樣品DNA、含有序列5堿基序列的檢測(cè)樣品DNA或TE緩沖液10μL，再添加上述吖啶鎓標(biāo)記結(jié)合子溶液(終濃度為0.1pmol/L)，分別于60℃下緩慢攪拌，加熱30分鐘進(jìn)行雜交反應(yīng)。然后添加1500μL的0.6mol/L的四硼酸鹽緩沖液(pH8.5)、5％Triton X-100、TETRA溶液，于60℃下加熱20分鐘，對(duì)未反應(yīng)的吖啶鎓標(biāo)記結(jié)合子進(jìn)行水解，將加有樣品的反應(yīng)容器浸入水中3分鐘進(jìn)行急劇冷卻。
檢測(cè)是使用圖2的裝置(由圖1的信號(hào)檢測(cè)裝置改造的)進(jìn)行的。使本反應(yīng)后的樣品流過(guò)管子，用條形碼讀出器檢測(cè)信號(hào)后，再通過(guò)圖2所示的試劑供給裝置導(dǎo)入含有0.03％H2O2的2mol/L NaOH溶液，在管中與該樣品混合，直接利用光計(jì)數(shù)器2500發(fā)光檢測(cè)器(マイクロテツク·ニチオン公司制造)的檢測(cè)部分測(cè)定發(fā)光計(jì)數(shù)，在帶有01條形碼的載體中，只有使含有序列4堿基序列的DNA反應(yīng)的樣品可以檢測(cè)出明顯的化學(xué)發(fā)光計(jì)數(shù)。
實(shí)施例4(1)帶有信號(hào)A的載體的制作象實(shí)施例1(1)那樣制作含有信號(hào)A的載體。
(2)載體結(jié)合蛋白(載體結(jié)合抗體)的制備將含有條形碼01的載體50條分散于HEPES緩沖液10ml中，添加100μmol的羥基琥珀酰亞胺(關(guān)東化學(xué)生產(chǎn))，然后再添加WSC[水溶性碳化二亞胺_Water soluble carbodiimide，化合物名稱為1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，鹽酸鹽，同仁化學(xué)公司制造]100μmol，使羧基琥珀酰亞胺化，然后用相同緩沖液洗凈載體后，立刻添加含有抗人免疫球蛋白γ抗體1μmol/ml的緩沖液10ml，使抗體固定。再于1％BSA溶液中進(jìn)行封閉，用蒸餾水洗凈，制備出帶有結(jié)合了抗人免疫球蛋白γ鏈抗體的條形碼01的載體。
同樣使抗人免疫球蛋白μ鏈抗體結(jié)合于含有條形碼02的載體50條上進(jìn)行同樣處理，制備出帶有結(jié)合了抗人免疫球蛋白μ鏈抗體的條形碼02的載體。
(3)結(jié)合熒光的抗原的制備使FITC(熒光素異硫氰酸鹽)與人IgG反應(yīng)，制備熒光標(biāo)記的2nmol/ml的溶液A。同樣使FITC(熒光素異硫氰酸鹽)與人IgA和IgM反應(yīng)，制備熒光標(biāo)記的2nmol/ml的溶液(分別稱為溶液B、溶液C)。
(4)蛋白的反應(yīng)向含有分別帶有上述(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)10ml中添加上述(3)制備的結(jié)合熒光的抗原溶液A 100μL以及溶液B 100μL，分別于37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然后用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產(chǎn)的C080A047A)過(guò)濾，用0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)洗兩次，再將載體分散于10ml同樣緩沖液中。將該溶液定為檢測(cè)樣品X。
另外向含有分別帶有上述(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)10ml中添加上述(3)制備的結(jié)合熒光的抗原溶液C 100μL以及溶液B 100μL，分別于37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然后用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產(chǎn)的C080A047A)過(guò)濾，用0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)洗兩次，再將載體分散于10ml同樣緩沖液中。將該溶液定為檢測(cè)樣品Y。
(5)檢測(cè)制作圖1、圖2所示的檢測(cè)裝置，一邊使上述(4)制備的X、Y溶液通過(guò)信號(hào)檢測(cè)裝置中的中空管，一邊進(jìn)行條形碼和熒光的檢測(cè)。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產(chǎn)的Hand Laser Scanner SL-114型，熒光檢測(cè)機(jī)使用日立F-4000型熒光分光光度計(jì)，用激發(fā)波長(zhǎng)495nm、熒光波長(zhǎng)520nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。中空管是石英管玻璃管，內(nèi)徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由于條形碼的信號(hào)和熒光的信號(hào)檢測(cè)的時(shí)間差為36秒，按照時(shí)間差使含有特定條形碼的載體上的熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)。
表3給出了檢測(cè)結(jié)果。
表3

熒光強(qiáng)度考慮到噪音，將檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的最大值作為熒光強(qiáng)度，將堿基序列一樣的5個(gè)條形碼02載體具有的熒光強(qiáng)度的平均值作為1。
結(jié)果可以確認(rèn)檢測(cè)樣品為X時(shí)，對(duì)應(yīng)于條形碼01的載體的熒光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗人IgG反應(yīng)的人IgG檢測(cè)樣品X中可檢測(cè)出對(duì)應(yīng)于條形碼01的很強(qiáng)熒光，而檢測(cè)樣品為Y時(shí)，對(duì)應(yīng)于條形碼02的載體的熒光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗人IgM反應(yīng)的人IgM檢測(cè)樣品Y中可檢測(cè)出對(duì)應(yīng)于條形碼02的很強(qiáng)熒光。由于在無(wú)樣品時(shí)熒光值沒(méi)有升高，所以可以利用本發(fā)明方法檢測(cè)對(duì)特定蛋白質(zhì)(抗體)具有特異反應(yīng)的蛋白質(zhì)(抗原)。
實(shí)施例5(1)帶有條形碼標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合載體以及鼠免疫球蛋白結(jié)合載體的制作使用與實(shí)施例1同樣的方法以聚甲基丙烯酸甲酯作為材料，向其表面導(dǎo)入羧基，制作帶有條形碼01、以及條形碼02的長(zhǎng)15mm的載體。與實(shí)施例1一樣，將含有條形碼01的載體50條分散于HEPES緩沖液10ml中，添加100μmol的羥基琥珀酰亞胺，然后再添加WSC 100μmol，使羧基琥珀酰亞胺化，然后用相同緩沖液洗凈載體后，立刻添加含有抗生物素蛋白1μmol/ml的緩沖液10ml，使抗生物素蛋白固定于載體上。再于1％BSA溶液中進(jìn)行封閉，用蒸餾水洗凈，制備出帶有結(jié)合了抗生素蛋白的條形碼01的載體。
同樣使含有條形碼02的載體50條結(jié)合鼠免疫球蛋白G，進(jìn)行同樣處理，制備出帶有結(jié)合了鼠免疫球蛋白G的條形碼02的載體。
(2)檢測(cè)樣品多肽溶液的制備合成由在氨基末端含有具有FITC的抗生物素蛋白結(jié)合特性的肽序列的15個(gè)氨基酸構(gòu)成的序列6氨基酸序列的FITC標(biāo)記多肽，溶解在含有0.1％BSA的PBS中，濃度為2nmol/ml，制備檢測(cè)溶液。
另外合成由在氨基末端不含有具有FITC的抗生素蛋白結(jié)合特性的肽序列的15個(gè)氨基酸構(gòu)成的序列7氨基酸序列的FITC標(biāo)記多肽，溶解在0.1％BSA/PBS中，濃度為2nmol/ml，制備檢測(cè)溶液。
(3)檢測(cè)樣品多肽溶液與載體的反應(yīng)向含有分別帶有上述(2)制備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)10ml中添加上述(2)制備的含有序列6氨基酸序列的檢測(cè)樣品、含有序列7氨基酸序列的檢測(cè)樣品，或不含有多肽的0.1％BSA/PBS 100μL，分別于37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然后用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產(chǎn)的C080A047A)過(guò)濾，用0.05mol/L的HEPES緩沖液(pH7)洗兩次，再將載體分散于10ml同樣緩沖液中。
(4)檢測(cè)制作圖1、圖2所示的檢測(cè)裝置，一邊使上述(3)制備的各個(gè)溶液通過(guò)信號(hào)檢測(cè)裝置中的中空管，一邊進(jìn)行條形碼和熒光的檢測(cè)。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產(chǎn)的Hand Laser Scanner SL-114型。熒光檢測(cè)機(jī)使用日立F-4000型熒光分光光度計(jì)，用激發(fā)波長(zhǎng)495nm、熒光波長(zhǎng)520nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。中空管是石英管玻璃管，內(nèi)徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由于條形碼的信號(hào)和熒光的信號(hào)檢測(cè)的時(shí)間差為36秒，按照時(shí)間差使含有特定條形碼的載體上的熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)。
表4給出了檢測(cè)結(jié)果。
表4

熒光強(qiáng)度考慮到噪音，將檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的最大值作為熒光強(qiáng)度，將堿基序列一樣的5個(gè)條形碼02的載體具有的熒光強(qiáng)度的平均值作為1。
結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)樣品為序列1檢測(cè)樣品時(shí)，可以確認(rèn)對(duì)應(yīng)于條形碼01的載體的熒光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗生物素蛋白反應(yīng)的多肽序列的序列1檢測(cè)樣品中可檢測(cè)出對(duì)應(yīng)于條形碼01的很強(qiáng)熒光，而在序列2檢測(cè)樣品、以及無(wú)檢測(cè)樣品時(shí)，與具有任一個(gè)條形碼信號(hào)的載體相對(duì)應(yīng)的熒光值都沒(méi)有升高，所以利用本發(fā)明方法可以對(duì)特定蛋白質(zhì)(抗生物素蛋白)具有特異反應(yīng)的多肽序列進(jìn)行檢測(cè)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可以提供應(yīng)用方便、適用性高的檢測(cè)特定堿基序列的方法，檢測(cè)特定堿基序列的試劑和檢測(cè)特定堿基序列的儀器。
序列表序列1-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列2-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列3-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列4-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列5-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列6-人工序列的說(shuō)明合成多肽序列7-人工序列的說(shuō)明合成多肽序列表<110>協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社<120>物質(zhì)的檢測(cè)方法<130>11275WO1<140>
<141>
<150>JP 2000-029830<151>2000-02-07<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>15<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成DNA<400>1aaattgagta gttgc 15<210>2<211>15<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成DNA<400>2aaaaacatct ccggg 15<210>3<211>14<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成DNA<400>3ggtcaggaac aaaa 14<210>4<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成DNA<400>4ttgttcctga ccgcaactac tcaa 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成DNA<400>5tacgatatgg ctccttggaa ctcg 24<210>6<211>24<212>peptide<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成多肽<400>6Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp His Pro Gln Phe Ser Ser1 5 10<210>7<211>24<212>peptide
<213>人工合成序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明合成多肽<400>7Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp Thr Ser Pro Phe Ser Ser1 5 10
權(quán)利要求
1.一種借助于或不借助于間隔臂和具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的結(jié)合子結(jié)合的帶有可識(shí)別數(shù)字信號(hào)A的載體。
2.權(quán)利要求1記載的載體，其中結(jié)合子是含有與待檢測(cè)堿基序列或其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的載體，其中結(jié)合子是具有與待檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)記載的載體，是內(nèi)部存在磁性粒子的載體。
5.權(quán)利要求1記載的載體，其中數(shù)字信號(hào)A是條形碼。
6.權(quán)利要求1記載的載體，其中載體是圓柱形或球形的。
7.權(quán)利要求6記載的載體，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長(zhǎng)度為10μm～2cm。
8.權(quán)利要求1記載的載體，其中載體的比重為0.8～2.0。
9.權(quán)利要求1記載的載體，其中載體的表面是用樹脂包被的。
全文摘要
本發(fā)明涉及樣品中待檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征為作為懸浮于溶液且貫流于在可檢測(cè)信號(hào)A和信號(hào)B的信號(hào)檢測(cè)裝置中形成信號(hào)檢測(cè)用中空管時(shí)，相對(duì)于中空管的橫斷面具有不重復(fù)移動(dòng)形狀的載體，借助或不借助間隔臂使對(duì)待檢測(cè)物質(zhì)有結(jié)合能力的物質(zhì)(以下省略為結(jié)合子)結(jié)合的帶有可識(shí)別信號(hào)A的載體與含有待檢測(cè)物質(zhì)的樣品在溶液中混合，使待檢測(cè)物質(zhì)與該結(jié)合子結(jié)合，通過(guò)該結(jié)合使信號(hào)B在載體上形成后，通過(guò)與該中空管連通的溶液供應(yīng)裝置使該載體懸浮液在該中空管中貫流，利用該信號(hào)檢測(cè)裝置檢測(cè)信號(hào)A和信號(hào)B，將信號(hào)A和信號(hào)B聯(lián)系起來(lái)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1696693SQ20051007905
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2001年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月7日
發(fā)明者三池彰, 森秀治 申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社