專利名稱：將生物分子非共價固定到固體基質上的方法和微陣列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將生物分子固定到固體基質上的方法，更特別地涉及將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法。
相關技術的說明術語“微陣列(microarray)”指一種基質，其將特異的生物分子密集地固定在預定區(qū)域中。微陣列的實例包括，例如，多核苷酸微陣列和蛋白質微陣列。術語“多核苷酸微陣列”指將多核苷酸密集地固定在其上的每個預定區(qū)域中的基質。微陣列是本領域眾所周知的，例如，美國專利號5,445,934和5,744,305。
通過在基質上直接合成多核苷酸，或通過將預先合成的多核苷酸固定到基質上的預定位置(定點法(spotting method))來將多核苷酸固定到固體基質上。多核苷酸微陣列及其產生方法在美國專利號5,744,305，5,143,854和5,424,186中有描述，其所公開的內容在此全部引入作為參考。定點法廣泛用于將生物分子共價地固定到固體基質上。例如，通常通過用氨基等親核官能團活化固體基質的表面，在所述該官能團上偶聯(lián)已被優(yōu)良的離去基團(leavinggroup)活化的生物分子，例如多核苷酸，然后從所述基質除去未反應的反應物，從而將生物分子固定到所述基質上。將生物分子非共價地固定到基質上的方法還不是本領域已知的。
已經(jīng)將親水化合物聚乙二醇用于微陣列。聚乙二醇通過共價鍵附著于DNA鏈的兩個末端，并且將DNA鏈固定到基質上以獲得微陣列[實驗血液學雜志(Journal of Experimental hematology)200311(4)393-397]。US-2003-0108917-A1描述了通過將探針多核苷酸固定到水凝膠上來產生微陣列的方法，所述水凝膠由末端具有環(huán)氧基的星狀聚乙二醇衍生物組成。
然而，在這些方法中，生物分子被共價固定到基質上。即，基質或生物分子應具有附著于其上的反應官能團。此外，共價鍵可在嚴格的反應條件下形成。進一步的，很難控制反應條件并且操作很復雜。此外，在反應完成后必須除去未反應的反應物質。
本發(fā)明人進行了研究并且發(fā)現(xiàn)了將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法，該方法提供可有效用于靶分子分析的高品質微陣列。
發(fā)明概述本發(fā)明提供將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法。
本發(fā)明也提供根據(jù)上述方法產生的微陣列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法，包括提供附著有第一官能團(first functional group)的固體基質，該第一官能團具有氫鍵供給能力；以及使具有氫鍵接受能力的化合物和用第二官能團進行功能化(functionalize)的生物分子的混合物，與基質的表面進行反應，該第二官能團具有氫鍵供給能力，以便于將生物分子非共價地固定到基質上。
附圖簡述通過詳細描述其例證性的實施方案，并參考下列附圖，上述的和本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將更為明顯，其中

圖1至3是說明分別利用濃度為0.4mM和0.6mM的聚乙二醇(PEG)所產生的微陣列的熒光測量結果的圖像；以及圖4是說明根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法所產生的在硅晶片(silicon wafer)上固定有探針多核苷酸的微陣列和對照微陣列的熒光強度的圖表。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法，包括提供附著有第一官能團的固體基質，該第一官能團具有氫鍵供給能力；以及使具有氫鍵接受能力的化合物和用第二官能團進行功能化的生物分子的混合物，與基質的表面進行反應，該第二官能團具有氫鍵供給能力，以便于將生物分子非共價地固定到基質上。
具有氫鍵供給能力的第一官能團與具有氫鍵供給能力的第二官能團可以是不同或相同的。具有氫鍵供給能力的第一官能團和具有氫鍵供給能力的第二官能團可分別選自氨基(amino group)、硫醇基(thiol group)和羥基(hydroxyl group)，但不限于此。具有氨基的化合物的具體實例包括，但不限于γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，GAPS)、γ-氨基丙基二乙氧基硅烷(aminopropyltdiethoxysilane，GAPDES)、以及氨基己基(aminohexyl group)?？梢酝ㄟ^將第一官能團，例如氨基、硫醇基和羥基導入到例如乙酰氯硅烷(acetylchloride silane)、無水硅烷(anhydrous silane)、磺酰氯硅烷(sulfonylchloride silane)和異硫氰酸硅烷(isothiocyanate silane)等涂覆材料中而得到具有第一官能團的化合物。這種導入方法是本領域公知的，并且本領域的普通技術人員可容易地進行這種方法。
在本發(fā)明的實施方案中，具有氫鍵接受能力的化合物指包含高負電性(high electronegativity)原子，例如氮原子、氧原子和硫原子的分子，因此其可供給形成氫鍵所必需的電子。所述化合物的實例包括聚乙二醇(PEG)或其衍生物以及聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)或其衍生物。此外，PEG或其衍生物，或聚乙烯亞胺或其衍生物各自的使用濃度可為0.4至6.0mM，并且分子量可以是200至1,000,000Da，優(yōu)選為200至100,000Da，更優(yōu)選為200至10,000Da。在本發(fā)明例證性的實施方案中，PEG的使用濃度為6.0mM并且分子量為10,000Da。
在本發(fā)明的實施方案中，不特異地限定固體基質，并且其可以是能提供表面的任何固體基質。固體基質可由塑膠材料形成，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯(polystyrene)和聚氨脂(polyurethane)、玻璃、硅晶片，及其修飾物。固體基質可本身具有或通過化學或物理處理(例如涂覆)而具有第一官能團。
生物分子是來源于生物體的化合物或其合成化合物。生物分子可選自核酸、蛋白質、多糖，及其組合。優(yōu)選地，生物分子是核酸。核酸的實例可包括DNA和RNA。通常，待固定于固體基質上的生物分子特異地與待分析的靶分子起反應。例如，核酸可通過雜交反應特異地與具有互補核苷酸序列的靶核酸起反應。蛋白質可通過抗原-抗體反應、配體和受體之間的相互作用或酶和底物之間的相互作用而特異地與靶分子起反應。多糖可特異地被能夠識別多糖的抗體或蛋白質(例如凝集素)所識別。利用可檢測生物分子和靶分子之間特異的相互作用的檢測系統(tǒng)，根據(jù)本發(fā)明方法產生的微陣列可用于各種分析。
用于固定作用的生物分子的濃度可根據(jù)反應條件和所獲得數(shù)據(jù)的類型而不同。即，不特別地限定生物分子的濃度。在本發(fā)明例證性的實施方案中，DNA的濃度范圍為20至100μM，但不限于此。
根據(jù)本發(fā)明實施方案的固定化方法可用于產生DNA或蛋白質微陣列的傳統(tǒng)方法。一個傳統(tǒng)方法是利用光刻法(photolithography)產生微陣列的方法。這種光刻法包括用以可除去的保護基團保護的單體涂覆基質表面，將該表面的預定區(qū)域暴露于能量源以除去保護基團，以及將用可除去的保護基團保護的第二單體偶聯(lián)到第一單體上，并重復上述暴露和偶聯(lián)，從而產生出多核苷酸微陣列(光刻法)。在該方法中，通過一個接一個地延伸單體來合成多核苷酸，從而實現(xiàn)多核苷酸的固定。在通過定點法產生微陣列的方法中，將預先合成的多核苷酸固定到基質上的預定區(qū)域中。這些產生微陣列的方法在例如，美國專利號5,744,305，5,143,854和5,424,186中有描述。這些專利所公開的內容在此全部引入作為參考，其中描述了多核苷酸微陣列及其產生方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供根據(jù)上述方法產生的微陣列。
通過提供的實施例來更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例只為例證說明的目的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1通過使聚乙二醇和用氨基在其5’端進行功能化的DNA的混合物與用氨基涂覆的玻璃基質的表面起反應來產生DNA微陣列。
在該實施例中，使PEG和用氨基在其5’端進行功能化的DNA的混合物與用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)涂覆的玻璃基質的表面起反應，以產生具有以點(spot)排列的DNAs的DNA微陣列。
首先，使用可購自Dow Coring(www.corning.com)的Cat no.40004作為用GAPS涂覆的玻璃基質。將用氨基己基在其5’端進行功能化的探針核苷酸(SEQ ID Nos.1至10)分別以20μM的濃度溶于在含有50％DMSO的0.1MNaHCO3(pH9)中的6mM PEG(購自Aldrich，Mw10,000)溶液中。待固定的探針多核苷酸由完全匹配的序列(野生型探針)和錯配序列(突變型探針)組成，其中完全匹配的序列與年輕人的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of theyoung)基因MODY1的外顯子7至10的特定區(qū)域互補，而錯配序列除了一個核苷酸之外與野生型探針的序列互補。
表1.探針多核苷酸的名稱和序列號(SEQ ID No)

利用Pix5500spotterTM點樣儀(購自Cartesian)，將所獲得的探針多核苷酸溶液分別以每點500pl點樣(spot)到玻璃基質上。然后，在恒定溫度和濕度的室中，以70℃和30％的濕度，進行固定反應1個小時。反應完成后，用蒸餾水洗滌玻璃基質，并且用無水丁二酸(封閉劑)保護基質上殘留的氨基。然后用乙醇洗滌玻璃基質，并且旋轉干燥以獲得具有被固定的探針多核苷酸的微陣列。所獲得的微陣列分別具有相互之間以300μm間隔排列的60個點。
實施例2利用根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法所產生的微陣列來分析靶核酸。
在該實施例中，利用在實施例1中所產生的探針多核苷酸微陣列進行探針多核苷酸和靶核酸之間的雜交反應，然后根據(jù)雜交的結果，評估根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法所產生的微陣列的品質。
首先，擴增靶DNAs。利用分別具有SEQ ID Nos.11至24的14個寡核苷酸作為引物，并利用分離自人血液的gDNA作為模板進行PCR，以獲得包含MODY1的外顯子7至10的多核苷酸。
PCR的條件如下將0.2μl野生型基因組DNA，各200μM的dATP、dGTP、dCTP，40μM dTTP，160μM Cy3-標記的dUTP(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)，和200nM的相應于外顯子和啟動子的10個區(qū)域的10個多重PCR組(multiple PCR sets)混合在一起。然后，進行40個循環(huán)的PCR，每個循環(huán)包括在95℃變性30秒，在64℃退火10秒，以及在72℃延伸3分鐘。利用Qiagen試劑盒純化所得到的PCR產物，然后選擇A260/A550比率為1.0至3.5的PCR產物用于后續(xù)的步驟。
用0.5U的DNase I(Boehringer Mannheim，曼海姆，德國)在37℃將純化的PCR產物切成片段，反應進行10分鐘。然后，向產物加入終止混合物(20mM EDTA，pH8.0-1％SDS-0.2M NaCl)以終止DNase I的消化反應。接著，調節(jié)切成片段的產物至濃度為150至187.5nM，在94℃變性5分鐘，并在冰上放置2分鐘進行冷卻。將產物分別與相同量的雜交緩沖液(6×SSPE-0.1％Triton X-100)混合，然后應用于從實施例1獲得的微陣列。分別將微陣列在32℃孵育12至16小時，然后用洗滌緩沖液I(6×SSPE-Triton X-1000.005％)洗滌5分鐘，再用洗滌緩沖液II(3×SSPE-Triton X-100 0.005％)洗滌5分鐘。隨后，微陣列在室溫干燥15分鐘，利用GenePix 4000B scannerTM掃描儀(AxonInstruments)在532nm處成像。利用GenePix Pro softwareTM軟件(AxonInstruments，Union City，CA)分析所獲得的圖像。
分析結果如圖1和表2所示。對5個微陣列進行實驗，每個微陣列上固定有如表1所列出的野生型和突變型探針(每種探針3個點)。所獲得的圖像和熒光強度數(shù)據(jù)如圖1和表2所示。圖1表明，固定有探針多核苷酸的5個微陣列S1到S5(在實施例1中獲得)在與靶核酸雜交后，掃描獲得的熒光圖像，其中在圖1的上部分別指出序列號。在圖1中，每個微陣列的上一排點和下一排點分別相應于PEG濃度0.4mM和6.0mM。表2顯示在532nm處測量的圖1中點的熒光強度。利用濃度低至0.4mM的PEG所獲得點用作對照，因為很難獲得與利用PEG濃度6.0mM所獲得的點具有相似的固定探針多核苷酸密度的點。
表2.基于探針固定中所使用的PEG濃度的熒光強度比較

如表2所示，利用PEG濃度6.0mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度是6774，而利用PEG濃度0.4mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度是2683。此外，利用PEG濃度6.0mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度與利用PEG濃度0.4mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度的比率是2.87。因此，當根據(jù)本發(fā)明的實施方案產生微陣列時，熒光強度是與所使用的PEG濃度直接成比例的。就是說，利用濃度為6.0mM的PEG的情況，可獲得比利用濃度為0.4mM的PEG的情況高大約3倍的熒光強度。因此，證實可通過用PEG固定探針來增加熒光強度的靈敏性。PEG濃度和熒光強度之間的比例關系可以維持到PEG濃度8mM，高于此濃度時，在點樣期間針孔被堵塞，從而阻礙了實際應用(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了證實在利用根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法所產生的微陣列對靶核酸進行的分析中，探針可特異地與靶核酸起反應，獲得野生型探針(wp)的熒光強度與突變型探針(mp)的熒光強度的比率。結果顯示在表3中。
表3.野生型探針(wp)的熒光強度與突變型探針(mp)的熒光強度的比率

野生型探針(wp)的熒光強度與突變型探針(mp)的熒光強度的比率，即wp/mp，對于利用PEG濃度0.4mM的點是8.05，而對于利用PEG濃度6.0mM的點是11.15，這比前者的比率8.05高出大約1.31倍。這證明當用于固定探針核苷酸的PEG的濃度變高時，可以以增加的特異性檢測靶核酸。
根據(jù)實施例1和2中，利用將探針核苷酸以簡單的方式非共價地固定到玻璃基質上的方法所得到的結果，即使不使用將探針核苷酸共價地固定到玻璃基質上的傳統(tǒng)方法，也可以提供具有高分析靈敏性和特異性的微陣列。
實施例3PEG濃度對微陣列的影響在該實施例中，以與實施例1和2中相同的方式產生探針核苷酸陣列，并進行雜交反應，不同的是改變了待固定的探針核苷酸的序列。所述探針核苷酸具有SEQ ID No.25，靶多核苷酸具有與SEQ ID No.25完全匹配的多核苷酸序列。
結果是，利用PEG濃度0.4mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度是7,700，而利用PEG濃度6.0mM所獲得的微陣列上的點的熒光強度是15,000。圖2和3是表明分別利用PEG濃度0.4mM和6.0mM所產生的微陣列的熒光檢測結果的圖像。
這證明當用于固定探針核苷酸的PEG的濃度變高時，可檢測到的熒光強度變高。
實施例4通過使PEG和用氨基在其5’端進行功能化的DNA的混合物與硅晶片的表面起反應來產生DNA微陣列在該實施例中，以與實施例1中相同的方式來產生微陣列，不同的是用涂覆了GAPS的硅晶片(購自LG Siltron用硼浸潤的P型硅晶片)作為固體基質。然后在每個微陣列上進行與靶核酸的雜交，并且以與實施例2中相同的方式測量熒光強度。使用與實施例3中相同的探針和靶多核苷酸。
如下進行在硅晶片上涂覆GAPS。利用旋轉涂層儀(spincoater)型號CEE70TM(購自CEE)將GAPS的乙醇溶液(20％(v/v))旋轉涂覆(spin-coat)到硅晶片上。旋轉涂覆過程包括以500rpm/10秒起始涂覆，并且主要在2,000rpm/10秒進行涂覆。完成旋轉涂覆后，將基質固定在聚四氟乙烯(Teflon)晶片載體上以在120℃恢復(cure)40分鐘。然后將基質在水中浸泡10分鐘，超聲波洗滌15分鐘，并且再次在水中浸泡10分鐘。再旋轉干燥基質。干燥后，將基質切割成正方形(square)或矩形(rectangular)以用于試驗。所有的實驗在已經(jīng)除去大部分塵埃顆粒的凈化室-級別1,000中進行。
熒光強度的結果顯示在圖4中。圖4是表明分別利用濃度為0.4mM和6.0mM的PEG將探針多核苷酸固定到硅晶片上的微陣列的熒光強度圖表。如圖4中所表明的，證實即使利用PEG將探針非共價地固定到基質上也可獲得高的熒光強度，并且熒光強度與所使用的PEG的濃度成比例關系。
實施例5探針多核苷酸的濃度對熒光強度的影響在該實施例中，以與實施例1和2中相同的方式產生探針核苷酸陣列，并進行雜交反應以及檢測熒光強度，不同的是改變了待固定的探針多核苷酸的類型和濃度。在固定化反應中，使用濃度為20μM或100μM并具有SEQ IDNo.26的探針多核苷酸。
在分別利用濃度為20μM或100μM的探針多核苷酸的情況中，熒光強度分別為12,238和8,321。
根據(jù)實施例5的結果，證實利用濃度為大約20μM的探針多核苷酸可得到最佳的熒光強度。通常，當探針多核苷酸是共價固定的時，其所使用的濃度高于20μM。因此，根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法可減少在固定中使用的探針多核苷酸的量。
根據(jù)本發(fā)明實施方案的將生物分子固定到固體基質上的方法，可以在不使用具有強反應官能團的化學物質的情況下，將探針多核苷酸固定到固體基質上。因此，本方法可提供簡化的工藝和較低的成本。另外，本方法可提供在反應的靈敏度和特異性方面高品質的微陣列。
雖然，本發(fā)明已經(jīng)參考其例證性的實施方案進行特別地顯示和描述，本領域的普通技術人員將理解可在形式或細節(jié)中產生各種變化，而不背離如下列權利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>三星電子株式會社(samsung Electronics Co.Ltd.)<120>用于將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法和根據(jù)該方法產生的微陣列<130>PN052697<160>26<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探針核苷酸<400>1ctcctggaag ggca 14<210>2<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型探針核苷酸<400>2agctcctaga aggg 14<210>3<211>17
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探針核苷酸<400>3aggcatactc attgtca17<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型探針核苷酸<400>4aggcatactg attgtca17<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探針核苷酸<400>5ccaaagcggc cac13<210>6<211>13
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型探針核苷酸<400>6ccaaagtggc cac13<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探針核苷酸<400>7acgatgacgt tggt 14<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型探針核苷酸<400>8acgatgatgt tggt 14<210>9<211>13
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探針核苷酸<400>9tgggggatgg cag13<210>10<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型探針核苷酸<400>10gggggacggc aga13<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11cagcaacaca acatccccca gagg24<210>12<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12tacagcaacc accaaggcca aatct 25<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gggcctgggc agtccgatga t 21<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14aggggagggt tcctgggtct gtgta 25<210>15<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15agaatgtttg cagcgagggg tgtcc 25<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16agcggcccta ggatcatctc aaaag 25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17atgcccatct ccaacccaca actca 25<210>18<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18gcagggaaaa gtgaccaagc caata 25<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19gcagccatga acggcgagga g 21<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20aggtaaggcg gccgggtgag aac 23<210>21<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21aggtaaggcg gccgggtgag aac 23<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22tgtggcgacg cgctaaggcc ag 22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23ggcagggtgg gaggggagaa c 21<210>24<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24gcgtcagggt gcagtgggat gt 22<210>25<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針核苷酸<400>25tgttctcttg tcttg 15<210>26<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針核苷酸<400>26cagctggctc agtt 1權利要求
1.將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法，包括提供附著有第一官能團的固體基質，該第一官能團具有氫鍵供給能力；以及使具有氫鍵接受能力的化合物和用第二官能團進行功能化的生物分子的混合物與所述基質的表面進行反應，以便于將所述生物分子非共價地固定到基質上，其中該第二官能團具有氫鍵供給能力。
2.權利要求1的方法，其中所述具有氫鍵供給能力的第一官能團與具有氫鍵供給能力的第二官能團是不同或相同的。
3.權利要求1的方法，其中所述具有氫鍵供給能力的第一官能團和具有氫鍵供給能力的第二官能團分別選自氨基、硫醇基和羥基。
4.權利要求1的方法，其中所述具有氫鍵接受能力的化合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物，或聚乙烯亞胺或其衍生物。
5.權利要求1的方法，其中所述生物分子選自核酸、蛋白質、多糖、及其組合。
6.權利要求1的方法，其中所述固體基質是用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)涂覆的，所述具有氫鍵接受能力的化合物是聚乙二醇，而所述生物分子是用氨基己基在其5’端進行功能化的DNA。
7.權利要求6的方法，其中所述PEG的分子量為200至1,000,000Da。
8.權利要求6的方法，其中所述PEG的濃度范圍為0.4至8.0mM。
9.權利要求6的方法，其中所述DNA的濃度范圍為20至100μM。
10.根據(jù)權利要求1至9的任何一項的方法所產生的微陣列。
全文摘要
本發(fā)明提供將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法，包括提供附著有第一官能團的固體基質，該第一官能團具有氫鍵供給能力；以及使具有氫鍵接受能力的化合物和用第二官能團進行功能化的生物分子的混合物與基質的表面進行反應，該第二官能團具有氫鍵供給能力，以便于將生物分子非共價地固定到基質上。
文檔編號G01N33/547GK1821424SQ20051007412
公開日2006年8月23日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權日2004年2月16日
發(fā)明者許楠, 樸種勉 申請人:三星電子株式會社