專利名稱：Cop1分子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥診斷和治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
p53作為傳統(tǒng)腫瘤抑制物起作用這一點(diǎn)已經(jīng)得到了人們的確認(rèn)。1生物化學(xué)上，p53作為應(yīng)激活化的序列特異性轉(zhuǎn)錄因子起作用，其激活從帶有p53共有結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。2此外，p53也作為強(qiáng)力的轉(zhuǎn)錄抑制物起作用，從而增加了另一層的基因調(diào)節(jié)。3因而，它保護(hù)細(xì)胞免于各種應(yīng)激信號(hào)，例如DNA損傷、核苷酸耗盡和癌基因活化，舉幾個(gè)例子，通過除了抑制涉及血管生成、抗細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)展的基因之外，激活涉及細(xì)胞周期延滯、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)的主要基因(a cadre of genes)的轉(zhuǎn)錄。p53的生理學(xué)的后果主要引起生長延滯或細(xì)胞凋亡，從而防止細(xì)胞復(fù)制遺傳受損的基因組。
p53是在某些、如果不是全部的癌癥中被負(fù)調(diào)節(jié)或突變的強(qiáng)力的腫瘤抑制物蛋白26，27。p53基因中的高頻率的改變，或p53途徑的失調(diào)節(jié)的元件，在人類惡性腫瘤中強(qiáng)調(diào)了p53完整性對(duì)于防止癌發(fā)生的重要性。根據(jù)對(duì)6月齡發(fā)展自發(fā)腫瘤的p53敲除小鼠的觀測進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。4在癌癥中p53基因改變的實(shí)際頻率估計(jì)為20-80％。廣泛的變異可以歸因于腫瘤起源的組織、檢測方法和/或被分析的基因的區(qū)域。例如，在乳腺腫瘤中，基因改變的估計(jì)頻率是約20％，而這個(gè)頻率在小細(xì)胞肺癌中顯著地提高到＞70％。5，6卵巢腫瘤一般具有野生型p53基因28。
通過蛋白酶體依賴性途徑通過對(duì)E3連接酶例如Pirh27和MDM28-10的底物識(shí)別，p53在未應(yīng)激的細(xì)胞中快速地翻轉(zhuǎn)，所述E3連接酶將遍在蛋白從E2酶例如UbcH5b轉(zhuǎn)移到多賴氨酸殘基上的底物、或底物結(jié)合的遍在蛋白上，來產(chǎn)生多聚遍在蛋白鏈。一旦K48連接的多聚遍在蛋白鏈長度達(dá)到4或更高，底物則被蛋白酶體的組件例如hRad23a11識(shí)別，將底物靶向降解。因而，MDM225和Pirh27是p53的陰性調(diào)節(jié)物。Pirh2和MDM2是p53可誘導(dǎo)的基因7，12，13，從而產(chǎn)生負(fù)反饋環(huán)路，這可以被采用來關(guān)閉p53反應(yīng)并容許細(xì)胞周期進(jìn)展。
Arabidopsis thaliana COP1是含有RING指的蛋白，其起作用來抑制植物光形態(tài)發(fā)生。AtCOP1通過負(fù)調(diào)節(jié)光介導(dǎo)的基因表達(dá)14來控制播種發(fā)育，微陣列分析顯示，AtCOP1調(diào)節(jié)了大多數(shù)，如果不是所有的光應(yīng)答的基因15，16。通過顯示了代表了黑暗中的光生長植物的表型的、COP/DET/FUS蛋白的喪失功能的突變體，例示了這一點(diǎn)17。在機(jī)制上，這歸因于AtCOP1抑制光介導(dǎo)發(fā)育的正調(diào)節(jié)物例如LAF118和HY519的能力。COP1在體外具有天然的E3連接酶活性29，30，并可以利用LAF1作為底物。雖然COP1是植物中重要的光介導(dǎo)的發(fā)育開關(guān)，它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的作為沒有得到很好地確定20。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在受試者中診斷癌癥的方法，所述方法包括檢測所述受試者癌中的COP1水平或活性。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述診斷方法包括檢測所述受試者的癌中的p53水平或活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測的p53分子是野生型p53分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述p53分子是人類p53分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述p53分子使用特異性結(jié)合p53的抗體來檢測。在所述診斷方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥中的所述p53的核酸序列被測序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用p53活性分析來檢測所述p53分子，所述p53活性分析選自下組中至少之一p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用、p21mRNA水平的降低。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述診斷方法包括檢測所述樣品中p21分子的步驟。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述被診斷的受試者是人類。根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，所述被診斷的癌癥選自下組中至少之一乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和移行細(xì)胞癌(transitional cell cancer)。根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，所述被診斷的癌癥選自由漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌和粘蛋白腺癌構(gòu)成的組。
本發(fā)明涉及在受試者中監(jiān)視癌癥治療的效力或評(píng)估癌癥治療的預(yù)后的方法，所述方法包括檢測來自所述受試者的樣品中的COP1分子，其中相對(duì)于對(duì)照所述COP1分子的過量表達(dá)方面的降低表明所述癌癥治療是有效的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括檢測所述樣品中的p53分子。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測的p53分子是野生型p53。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過觀察p53活性來檢測所述p53分子，所述p53活性選自下組中至少之一p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述被評(píng)估的癌癥治療是選自下組中至少之一的癌癥的治療乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和移行細(xì)胞癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述被評(píng)估的癌癥治療是選自下組中至少之一的癌癥的治療漿液腺癌(serous adenocarcinoma)、子宮內(nèi)膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma)、明細(xì)胞腺癌(clear cell adenocarcinoma)和粘蛋白腺癌(mucinous adenocarcinoma)。
本發(fā)明涉及在被診斷為患有癌癥或存在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者中治療癌癥的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的抑制COP1表達(dá)的第一化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括向所述受試者施用治療有效量的抑制MDM2或Pirh2表達(dá)的第二化合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一或第二化合物使所述癌癥對(duì)癌癥治療敏感。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一或第二化合物選自下組中至少之一反義寡核苷酸、形成三鏈的寡核苷酸(triple-strand forming oligonucleotide)和siRNA分子。所述方法可以進(jìn)一步包括在施用所述第一和/或第二化合物之前、期間或之后施用一種或多種在癌癥治療過程期間有用的其他治療試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述要治療的癌癥表達(dá)野生型p53。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述要治療的癌癥與對(duì)照相比過量表達(dá)COP1。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述要治療的癌癥與對(duì)照相比p53表達(dá)水平降低或p53活性降低。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述要治療的癌癥與對(duì)照相比p21表達(dá)水平降低。
本發(fā)明涉及篩選干擾COP1分子與p53分子結(jié)合的測試化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述測試化合物可以進(jìn)一步抑制COP1連接酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括確定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)COP1活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述COP1活性選自下組中至少之一p53的降解、p53的遍在化(ubiquitination)、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述COP1是人類COP1分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述p53是人類p53分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選方法是測量對(duì)COP1/p53結(jié)合的破壞或抑制的分析。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選方法是報(bào)告基因分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述篩選方法包括檢測COP1活性的進(jìn)一步的步驟，其中所述活性選自下組中至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。
本發(fā)明涉及篩選抑制p53的活性的化合物的方法，包括用與COP1結(jié)合的測試化合物處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟，并檢測所述處理的細(xì)胞中的p53。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測步驟包括測量選自下組中至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來表達(dá)COP1。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來表達(dá)p53。
本發(fā)明涉及抑制COP1分子表達(dá)或抑制COP1連接酶活性的化合物用于藥物的制備的用途，所述藥物用于在診斷為患有癌癥或存在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者中治療癌癥。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物是靶向COP1的RNAi。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述藥物包括抑制MDM2或Pirh2的表達(dá)的化合物或藥物的標(biāo)簽，所述標(biāo)簽提供有關(guān)與抑制COP1的化合物(COP1-inhibitingcompound)一同施用抑制MDM2或Pirh2的表達(dá)的化合物的信息。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述藥物進(jìn)一步包括抑制MDM2分子的表達(dá)或活性的化合物，和/或可以伴有施用所述MDM2抑制物的說明。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述藥物進(jìn)一步包括抑制Pirh2的表達(dá)或活性的化合物，和/或可以伴有施用所述Pirh2抑制物的說明。
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制p53的活性的方法，包括在細(xì)胞中過量表達(dá)COP1并檢測過量表達(dá)COP1的細(xì)胞中的p53的步驟。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含編碼p53分子的重組核酸分子和編碼哺乳動(dòng)物COP1分子的重組核酸分子。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有提高或降低p53分子表達(dá)的非編碼序列(例如，啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列或反義序列)連同提高或降低COP1分子表達(dá)的非編碼序列，或具有編碼COP1分子的分子。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有提高或降低COP1分子表達(dá)的非編碼序列(例如，啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列或反義序列)連同提高或降低p53分子表達(dá)的非編碼序列或編碼p53分子的分子。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有基因組上改變的p53的編碼序列，從而p53不被表達(dá)或被表達(dá)為突變體，連同工程化所述細(xì)胞來改變COP1分子表達(dá)或活性。本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有基因組上改變的COP1的編碼序列，從而COP1不被表達(dá)或被表達(dá)為突變體，連同工程化所述細(xì)胞來改變p53分子表達(dá)或活性。
本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的COP1活性和降低的MDM2活性，任選地所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以改變p53表達(dá)或活性。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的COP1活性和降低的Pirh2活性，任選地所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以改變p53表達(dá)或活性。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的COP1活性、降低的MDM2活性和降低的Pirh2活性，任選地被進(jìn)一步工程化以具有改變的p53表達(dá)或活性。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的MDM2活性、降低的Pirh2活性和提高的COP1活性。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的COP1活性。本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞被工程化以具有降低的p53活性以及提高的或正常的COP1活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過靶向p53或COP1分子的RNAi的方法來降低活性。
本發(fā)明還提供了包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的細(xì)胞，所述第一核酸分子包含與編碼COP1多肽的核酸分子可操作連接的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二核酸分子包含與編碼p53多肽的核酸分子可操作連接的反式激活結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子包含與能由所述序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列可操作連接的報(bào)告基因。本發(fā)明還提供了包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的細(xì)胞，所述第一核酸分子包含與編碼p53多肽的核酸分子可操作連接的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二核酸分子包含與編碼COP1多肽的核酸分子可操作連接的反式激活結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子包含與能由所述序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列可操作連接的報(bào)告基因。
本發(fā)明還提供了這樣的分析，包括例如在體外遍在蛋白分析、COP1/p53結(jié)合分析、COP1連接酶分析和p53活性分析中使用重組COP1分子連同使用重組p53分子。
本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測樣品中COP1分子的試劑和包裝插頁(package insert)，所述包裝插頁含有對(duì)在包含癌細(xì)胞的樣品中檢測COP1分子的說明。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞是表達(dá)野生型p53的癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞選自下組中至少之一乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和移行細(xì)胞癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥選自下組中至少之一漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌和粘蛋白腺癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于檢測樣品中p53分子的試劑。
本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含抑制COP1的表達(dá)的化合物連同藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含抑制MDM2或Pirh2的表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物選自下組中至少之一反義寡核苷酸、形成三鏈的寡核苷酸和siRNA分子。
在本發(fā)明的組合物和方法的一個(gè)實(shí)施方式中，COP1分子包含結(jié)合p53的、人類COP1或其變體的至少一部分。在本發(fā)明的組合物和方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述p53分子包含結(jié)合COP1的、人類p53或其變體的至少一部分。在本發(fā)明的組合物和方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，COP1分子包含結(jié)合p53的、人類COP1或其變體的至少一部分，連同具有連接酶活性的COP1的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的抑制物通過與COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的結(jié)合，或與編碼COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的基因，包括這些基因的非翻譯區(qū)的結(jié)合來抑制。
附圖的簡要說明附

圖1A-E.COP1和它與p53的相互作用。A，來自基于Flag肽的洗脫的銀染色SDS凝膠。p53蛋白(下部畫面)的序列(SEQ ID NO1)帶有通過質(zhì)譜的匹配肽，下劃線的。B，在體內(nèi)COP1與外源p53的相互作用。如所指出對(duì)Saos-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染、免疫沉淀和免疫印跡(Western印跡，WB)。C，在體內(nèi)COP1與內(nèi)源p53的相互作用。如所指出的用或不用COP1轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，免疫沉淀和免疫印跡。D，內(nèi)源p53與內(nèi)源COP1的相互作用。用抗p53或抗Myc免疫沉淀U2-OS細(xì)胞，并用抗COP1免疫印跡。E，在體外COP1與p53的相互作用。用體外翻譯的HA-COP1孵育GST或GST-p53，通過抗-HA免疫印跡檢測結(jié)合的COP1。下部的畫面代表HA-COP1的20％總輸入。
附圖2A-I.COP1負(fù)調(diào)節(jié)p53表達(dá)和反式激活活性，并在不存在MDM2或Pirh2時(shí)維持降解p53的能力。A，COP1妨礙外源p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。COP1或COP1ΔRING與p53一同轉(zhuǎn)染入Saos-2(p53-null)細(xì)胞，通過免疫印跡評(píng)定p53的穩(wěn)態(tài)水平。B，COP1妨礙內(nèi)源p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。COP1或COP1ΔRING轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)2-OS細(xì)胞，通過免疫印跡評(píng)定內(nèi)源p53的穩(wěn)態(tài)水平。C，COP1不改變p53mRNA水平。提取來自COP1或COP1ΔRING轉(zhuǎn)染的U2-OS細(xì)胞的RNA，通過實(shí)時(shí)PCR并通過beta-肌動(dòng)蛋白mRNA標(biāo)準(zhǔn)化來評(píng)定p53mRNA水平。D，COP1提高p53翻轉(zhuǎn)(turnover)。用或不用COP1轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過脈沖追蹤代謝標(biāo)記來測定內(nèi)源p53的半衰期。E，p53的COP1降解需要功能性的26S蛋白酶體。如B中的轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，只是在收集溶胞產(chǎn)物之前該細(xì)胞用或不用蛋白酶體抑制物ALLN處理6h。F，COP1促進(jìn)體內(nèi)的p53遍在化。用HA-遍在蛋白、p53和COP1或COP1ΔRING轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，并用ALLN處理。通過使用與抗-HA的免疫沉淀和使用抗-p53的免疫印跡來檢測遍在化的p53。G，在體外COP1直接遍在化p53。如所指出的將細(xì)菌表達(dá)的和純化的遍在蛋白成分與體外翻譯和免疫沉淀的p53孵育。用抗-Flag檢測遍在化的p53，并表示為產(chǎn)物＞53kDa。H，COP1阻抑p53對(duì)p21啟動(dòng)子的反式激活功能。用p53和COP1或COP1ΔRING與p21-Luc報(bào)告物和內(nèi)部對(duì)照pCMV-b-Gal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞。RLU，相對(duì)的光單位。I，COP1抑制p53依賴性細(xì)胞凋亡。如所指出的用p53和COP1轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞。通過EGFP的共轉(zhuǎn)染選擇短暫地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，產(chǎn)生的sub-G1群體通過碘化丙錠染色來對(duì)細(xì)胞死亡估計(jì)進(jìn)行評(píng)定。J，COP1以MDM2非依賴性的方式促進(jìn)p53降解。如所指出的用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染來自p53/MDM2null小鼠的MEFs，使溶胞產(chǎn)物經(jīng)歷針對(duì)p53、肌動(dòng)蛋白、MDM2和FLAG的抗體的免疫印跡。K，COP1以Pirh2非依賴性的方式促進(jìn)p53降解。通過siRNA耗盡Saos-2細(xì)胞的Pirh2，隨后用p53和FLAG-COP1或MDM2轉(zhuǎn)染。通過免疫印跡評(píng)定對(duì)p53的穩(wěn)態(tài)水平的影響。通過實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)Pirh2mRNA消除(ablation)。L，COP1抑制從bax啟動(dòng)子的p53依賴性轉(zhuǎn)錄。用摻入了報(bào)告物bax-Luc和內(nèi)部對(duì)照pCMV-βGal的p53和FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞。通過歸一化熒光素酶對(duì)β-Gal的活性來評(píng)定相對(duì)反式激活活性。M，COP1抑制內(nèi)源p53的反式激活活性。用pG13-Luc或NS-Luc和具有提高量的FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING的pCMVβ-Gal轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞。24小時(shí)轉(zhuǎn)染之后，用10μM依托泊苷(etoposide)或DMSO處理細(xì)胞，處理后6小時(shí)測定熒光素酶活性。
附圖3A-D.COP1的siRNA消除引起p53蛋白的積累并誘導(dǎo)G1延滯(arrest)。A，COP1的siRNA消除提高p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平并提高p21和Pirh2基因的反式激活。用針對(duì)COP1的siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染U2-OS和H1299細(xì)胞，或用反轉(zhuǎn)的COP1轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。使用標(biāo)出的抗體對(duì)溶胞產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡，通過實(shí)時(shí)PCR檢測目標(biāo)基因的mRNA。B，C，COP1的siRNA消除誘導(dǎo)p53依賴性的G1延滯。用COP1或反轉(zhuǎn)的COP1siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染U2-OS(B)或H1299(C)細(xì)胞，通過FACS的碘化丙錠染色測定細(xì)胞周期分布型。D，通過兩種進(jìn)一步不同的siRNA寡聚物的COP1消除引起在蛋白水平的p53積累。用COP1siRNA2或COP1siRNA3和溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞。
附圖4A-E.通過siRNA的COP1、Pirh2和MDM2消除穩(wěn)定和活化p53。A，COP1的消除穩(wěn)定p53。用針對(duì)COP1、MDM2和/或Pirh2的siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，隨后脈沖追蹤指定的時(shí)間段。然后收獲溶胞產(chǎn)物，用抗p53免疫沉淀，并在phosphorimager上定量。B，p53的反式激活活性在COP1的減少時(shí)提高。用標(biāo)明的siRNA寡核苷酸和p21-Luc報(bào)告物轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，通過對(duì)內(nèi)部轉(zhuǎn)染對(duì)照物pCMV-beta-Gal活性標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶來測定相對(duì)反式激活活性。C，響應(yīng)于COP1的消除，p53和下游的目標(biāo)p21在蛋白水平積累，并進(jìn)一步受到MDM2的共消除刺激。用針對(duì)p53、p21、COP1和MDM2的抗體探試來自b的溶胞產(chǎn)物。D，在正常細(xì)胞中COP1負(fù)調(diào)節(jié)p53。如C中用siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染BJ成纖維細(xì)胞，收獲溶胞產(chǎn)物，用針對(duì)p53、p21、肌動(dòng)蛋白、MDM2和COP1的抗體進(jìn)行免疫印跡。E，通過siRNA的COP1和MDM2消除使得U2-OS細(xì)胞對(duì)IR誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感。用標(biāo)明的siRNA寡核苷酸預(yù)先處理U2-OS細(xì)胞，經(jīng)受20Gy IR，通過碘化丙錠染色測定細(xì)胞死亡。
附圖5A-E.COP1是p53可誘導(dǎo)的基因。A，在COP1啟動(dòng)子上p53共有位點(diǎn)的鑒定。下劃線的序列代表p53decamer。B，來自COP1啟動(dòng)子的p53共有位點(diǎn)能夠?qū)嵤﹑53依賴性轉(zhuǎn)錄。將兩個(gè)拷貝的p53的COP1共有位點(diǎn)導(dǎo)入pGL3-啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告物構(gòu)建體的上游，并與野生型p53或突變p53R175H共轉(zhuǎn)染。通過對(duì)pCMV-beta-Gal活性歸一化來測定相對(duì)活性。C，COP1mRNA由p53誘導(dǎo)。用p53或R175H突變體轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，分離RNA并使用特異于COP1mRNA的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，并針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白mRNA歸一化。D，COP1蛋白水平由于p53而增高。用針對(duì)p53、p21、肌動(dòng)蛋白和COP1抗體免疫印跡來自C的溶胞產(chǎn)物。E，COP1蛋白水平響應(yīng)于IR而增高。用10Gy IR照射U2-OS細(xì)胞，8h后收獲。用針對(duì)p53、肌動(dòng)蛋白和COP1的抗體免疫印跡溶胞產(chǎn)物。
附圖6A-C.COP1在鼠組織中表達(dá)。A在正常睪丸中COP1的ISH分析。左側(cè)畫面代表明視野，右側(cè)畫面代表暗視野。B使用1st鏈cDNA畫面的全長COP1的RT-PCR。C全長COP1表達(dá)的Northern印跡分析。
附圖7A-D.卵巢腺癌中的COP1過量表達(dá)。A來自卵巢腫瘤的cop1mRNA的實(shí)時(shí)PCR分析。從帶有匹配的正常對(duì)照的腫瘤樣品制備RNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR Taqman分析。數(shù)據(jù)表示為針對(duì)匹配的正常cop1mRNA的倍數(shù)增加，并針對(duì)RPL19mRNA來歸一化。Bcop1mRNA通過ISH的過量表達(dá)。在贅生的上皮細(xì)胞中cop1表達(dá)是明顯的，但在相連的基質(zhì)中不是；正常的卵巢組織是陰性的。C在卵巢腺癌中COP1在蛋白水平的過量表達(dá)。與B中相同情況的卵巢腺癌證明了在贅生的上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中而不是相關(guān)的基質(zhì)中的COP1免疫反應(yīng)性。D卵巢腫瘤中p53基因狀態(tài)和COP1過量表達(dá)與p21mRNA降低的相關(guān)性。從A中的樣品提取DNA，并進(jìn)行p53基因的外顯子5-8的PCR，通過DNA測序來分析產(chǎn)物，稱為野生型(wt)或突變體(mu)。p53基因狀態(tài)下面的圖畫顯示了來自過量表達(dá)COP1的A的相同樣品也具有降低的p21mRNA。如A中通過實(shí)時(shí)PCR測定p21mRNA相對(duì)水平，針對(duì)RPL19mRNA歸一化。數(shù)據(jù)表示為p21信使方面的倍數(shù)下降。
附圖8A-G.在乳腺腺癌中COP1過量表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)評(píng)估包括32例乳腺腺癌的組織微陣列的COP1表達(dá)。在32例乳腺腺癌病例中的25例鑒定了COP1免疫反應(yīng)性。A在贅生的上皮細(xì)胞中顯示COP1免疫反應(yīng)性的代表性的乳腺腺癌。BA中顯示的情況的更高放大率。C相同的乳腺腺癌病例在贅生的上皮細(xì)胞中p53免疫反應(yīng)性是陰性的，盡管散布的基質(zhì)細(xì)胞是陽性的。DC中顯示的情況的更高放大率。E在一例乳腺腺癌中的陽性p53免疫反應(yīng)性?？偣玻?/32例是p53陽性的。FD中顯示的情況的更高放大率。Gp53突變，引起氨基酸替換C242F的G到T轉(zhuǎn)換，在E和F中顯示的IHC陽性實(shí)例中被證實(shí)了。原始放大率×100(A，C和E)；×200(B，D和F)。
附圖9A-B.乳腺腫瘤中的COP1和p53穩(wěn)態(tài)水平。A從正常的乳腺或腫瘤樣品收獲溶胞產(chǎn)物，并經(jīng)歷針對(duì)p53、COP1和肌動(dòng)蛋白的抗體的免疫印跡。B乳腺腫瘤樣品中的p53基因狀態(tài)。從A中的樣品提取DNA，進(jìn)行p53基因的內(nèi)含子-外顯子邊界以及外顯子5-8的PCR，通過DNA測序來分析產(chǎn)物。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明，部分地，證明了COP1在各種癌癥中過量表達(dá)，并鑒定了腫瘤抑制物蛋白p53為COP1相互作用蛋白。功能上地，COP1經(jīng)由蛋白酶體降解p53，以MDM2非依賴性方式在體內(nèi)使p53直接遍在化，在體外，抑制p53反式激活潛力，并抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，COP1的siRNA消除穩(wěn)定了p53并提高了下游目標(biāo)基因p21的反式激活，因而在細(xì)胞周期的G1期延滯細(xì)胞。COP1還被鑒定為參與自調(diào)整的反饋環(huán)路的p53可誘導(dǎo)的基因。此外，過量表達(dá)COP1的癌癥顯示了p21mRNA的下降。
因而，COP1的過量表達(dá)可以用來診斷各種癌癥或細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方式中，在表達(dá)野生型p53的細(xì)胞或組織中COP1的過量表達(dá)對(duì)癌癥具有診斷性。
在此描述了本發(fā)明的各種可選擇的實(shí)施方式和實(shí)施例。這些實(shí)施方式和實(shí)施例是說明性的，不應(yīng)被看作限制本發(fā)明的范圍。
異常細(xì)胞增殖術(shù)語“細(xì)胞增殖失調(diào)”或“增殖失調(diào)”是指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的失調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖失調(diào)是癌癥。
“癌(cancer)”、“贅生物”、“瘤形成”、“癌(carcinoma)”、“癌的”或“腫瘤”意思是指或描述在哺乳動(dòng)物中一般以不受調(diào)整的細(xì)胞生長為特征的生理狀況。一般地，贅生物或癌癥的細(xì)胞，例如贅生性(腫瘤)細(xì)胞，已經(jīng)從正常的細(xì)胞分裂控制中解放，即，細(xì)胞的生長或增殖不受細(xì)胞環(huán)境中普通的生物化學(xué)和物理影響的調(diào)節(jié)，并展現(xiàn)出不受調(diào)節(jié)的生長、局部組織侵入、轉(zhuǎn)移等等的特征。一般地，贅生性細(xì)胞增殖形成良性或惡性細(xì)胞的克隆。因此術(shù)語癌癥或贅生物包括技術(shù)上是良性的但帶有變?yōu)閻盒缘娘L(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞生長。“惡性腫瘤”是指任何細(xì)胞類型或組織的異常生長或增殖。當(dāng)與相同類型的正常細(xì)胞或組織相比時(shí)，惡性的細(xì)胞或組織可能抑制退行發(fā)育或分化/定向的喪失，并可能展現(xiàn)侵入和轉(zhuǎn)移能力。
此處使用的術(shù)語“腫瘤”是指所有贅生性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的或良性的，和所有癌前期的和癌性的細(xì)胞和組織。
大多數(shù)癌癥屬于三種廣泛的組織學(xué)分類癌(carcinomas)，其是主要的癌癥，是上皮細(xì)胞或覆蓋在器官、腺體、或其他身體結(jié)構(gòu)(例如，皮膚、子宮、肺、乳腺、前列腺、胃、腸)的外部或內(nèi)部表面的細(xì)胞的癌癥，其傾向于轉(zhuǎn)移；肉瘤(sarcomas)，其來自連接性或支持性組織(例如，骨骼、軟骨、肌腱、韌帶、脂肪、肌肉)；和血液腫瘤，其來自骨髓和淋巴組織。癌可以是腺癌(其一般在能分泌的器官或腺體，例如，乳腺、肺、結(jié)腸、前列腺或膀胱中發(fā)生)或可以是鱗狀細(xì)胞癌(其發(fā)源于扁平上皮并一般在身體的大多數(shù)區(qū)域發(fā)展)。肉瘤可以是骨肉瘤或骨原性肉瘤(骨骼)、軟骨肉瘤(軟骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、橫紋肌肉瘤(骨骼肌)、間皮肉瘤或間皮瘤(體腔的膜性內(nèi)層)、纖維肉瘤(纖維組織)、血管肉瘤或血管內(nèi)皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪組織)、膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤(腦中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)原性結(jié)締組織)、粘液肉瘤(原始的胚性結(jié)締組織)、mesenchymous或混合的中胚層腫瘤(混合的結(jié)締組織類型)。血液腫瘤可以是骨髓瘤，其發(fā)源于骨髓中的漿細(xì)胞；白血病，其可以是“液體腫瘤”并且是骨髓的癌癥，可以是髓性的或粒細(xì)胞性的白血病(骨髓的和粒細(xì)胞的白血球)，淋巴的、淋巴細(xì)胞的或成淋巴細(xì)胞的白血病(淋巴的和淋巴細(xì)胞的血細(xì)胞)例如，急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、慢性的髓細(xì)胞白血病，等，或真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera)或原紅細(xì)胞增多癥(erythremia)(各種血細(xì)胞產(chǎn)物，但紅血球占優(yōu)勢)；或淋巴瘤，其可以是實(shí)體腫瘤并且其在淋巴系統(tǒng)的腺體或淋巴結(jié)中發(fā)展，其可以包括何杰金(Hodgkin)或非何杰金淋巴瘤，Burkitt’s淋巴瘤，等等。此外，也存在混合型癌癥，例如腺鱗癌(adenosquamous)、混合的中胚層腫瘤、癌肉瘤(carcinosarcoma)或畸胎癌。
癌癥也可以根據(jù)它們發(fā)源的器官，即“原發(fā)位點(diǎn)”來命名，例如，乳腺、腦、肺、肝臟、皮膚、前列腺、睪丸、膀胱、結(jié)腸和直腸、宮頸、子宮，等等。即使癌癥轉(zhuǎn)移到不同于原發(fā)位點(diǎn)的身體的另外的部位，也保留這種命名，根據(jù)本發(fā)明的癌癥包括原發(fā)癌癥，以及已經(jīng)轉(zhuǎn)移的癌癥。
根據(jù)原發(fā)位點(diǎn)命名的癌癥可以與組織學(xué)分類相關(guān)。例如，肺癌一般是小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌，其可以是鱗狀細(xì)胞癌、腺癌或大細(xì)胞癌；皮膚癌一般是基底細(xì)胞癌、扁平細(xì)胞癌或黑素瘤，例如惡性黑色素瘤。淋巴瘤可以在與頭、頸和胸相關(guān)的淋巴結(jié)中，以及在腹部淋巴結(jié)或在腋下或腹股溝淋巴結(jié)中出現(xiàn)。癌癥的類型和階段的鑒定和分類可以通過使用例如國家癌癥學(xué)會(huì)(http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html)的Surveillance，Epidemiology，和End Results(SEER)程序，其是在美國關(guān)于癌癥發(fā)生和存活的權(quán)威的信息來源，并且是全世界公認(rèn)的。SEER程序的發(fā)生率和存活率數(shù)據(jù)可用于接近特定癌癥位點(diǎn)和階段的標(biāo)準(zhǔn)存活率。例如，為了確保最佳的比較組，可以從數(shù)據(jù)庫中選擇特定的標(biāo)準(zhǔn)，包括診斷的日期和確切的分期。通過使用例如診斷手冊如Merck Manual of Diagnosis and Therapy，17thedition，M.H.Beers and R.Barkow，eds.，John Wiley and Sons，1999中提供的信息，也可以進(jìn)行癌癥的鑒定。
癌癥或贅生物的實(shí)例還可以包括，但不限于，本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化的和永生的細(xì)胞、實(shí)體腫瘤、髓性增殖性疾病(myeloproliferative diseases)、胚細(xì)胞瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌(squamous cell cancer)(例如，上皮的鱗狀上皮細(xì)胞癌)、肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀細(xì)胞癌、腹膜的癌癥、肝細(xì)胞癌癥、胃或胃癌，包括胃腸癌癥、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜的或子宮的癌、漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌、粘蛋白腺癌、Brenner腫瘤、畸胎瘤、無性細(xì)胞瘤(dysgerminoma)、惡性合胞體瘤(choriocarcinoma)、纖維瘤、粒導(dǎo)細(xì)胞瘤(granulosa cell tumor)、Sertoli-Leydig細(xì)胞瘤、未分化的卵巢癌、唾液腺癌、腎或腎臟癌癥、前列腺癌癥、陰戶癌癥、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、頭和/或頸部的癌癥、Ewing’s肉瘤、血管內(nèi)皮瘤、Kaposi’s肉瘤、脂肪肉瘤、周圍神經(jīng)上皮瘤、滑膜肉瘤、何杰金氏病等等。
根據(jù)本發(fā)明的癌癥包括任何癌癥，其中癌細(xì)胞或組織過量表達(dá)COP1分子或其中COP1活性被增量調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的癌癥包括任何癌癥，其中癌細(xì)胞或組織還表達(dá)野生型p53分子。
多肽、核酸分子和測試化合物根據(jù)本發(fā)明的化合物包括，但不限于，COP1和p53核酸分子、多肽和/或其類似物、變體、同源物和片段。這些化合物可以用于本發(fā)明的診斷、預(yù)后、治療、篩選方法等等的任一種。通過，例如，使用其他的保守氨基酸殘基，即，具有相似的物理、生物或化學(xué)性質(zhì)的殘基，或使用非保守性的殘基，在COP1或p53肽或肽類似物的任何位置替換、刪除或插入氨基酸殘基，篩選所述化合物介導(dǎo)與p53(如果所述化合物是COP1分子)或COP1(如果所述化合物是p53分子)結(jié)合的能力，可以制備化合物。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以是MDM2、Pirh2或p21分子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物包括特異性結(jié)合COP1或p53，例如突變或野生型p53的抗體。這種抗體可以是例如人源化的抗體。
當(dāng)抗體識(shí)別并結(jié)合抗原、但基本上不識(shí)別和結(jié)合樣品中的其它分子時(shí)，抗體“特異性結(jié)合”抗原。例如，COP1抗體特異性結(jié)合COP1分子，但基本上不結(jié)合任何其它分子，例如癌細(xì)胞或組織中存在的那些。在某些實(shí)施方式中，COP1抗體可以特異性結(jié)合人類COP1分子，并且可以不特異性結(jié)合來自其他物種的COP1分子。在另一個(gè)實(shí)例中，p53抗體特異性結(jié)合p53分子，但基本上不結(jié)合任何其它分子，例如癌細(xì)胞或組織中存在的那些。在某些實(shí)施方式中，p53抗體可以特異性結(jié)合人類p53分子，并且可以不特異性結(jié)合來自其他物種的p53分子。在某些實(shí)施方式中，p53抗體可以特異性結(jié)合突變體p53分子，并且可以不特異性結(jié)合野生型p53分子。在某些實(shí)施方式中，p53抗體可以特異性結(jié)合野生型p53分子，并且可以不特異性結(jié)合突變體p53分子。特異性結(jié)合抗原的抗體具有，例如，對(duì)于抗原的親合力，所述親合力是所述抗體對(duì)樣品中其它參考分子的親合力的至少10、100、1000或10000倍。
在此使用的“COP1分子”是指一種分子，其基本上相同于COP1多肽；編碼COP1多肽的核酸分子；COP1核酸分子；以及其同種型、片段、類似物或變體。例如，COP1分子可以包括來自哺乳動(dòng)物、具有結(jié)合p53的能力和/或COP1連接酶活性的COP1多肽的同種型、片段、類似物或變體。
COP1分子可以包括，但不限于，含有序列的多肽或核酸分子，所述序列基本上相同于登記號(hào)為AAH82804(小鼠)、NP_036061(小鼠)、NP_001001740(人類、同種型d24)、NP_071902(人類、同種型a)、XP_468011(Oryza sativa)、XP_468010(Oryza sativa)、XP_463866(Oryza sativa)、AAM34692(人類)、AAH39723(人類)、BAB45239(人類)、P_ABG08243(人類)、AAD51094(小鼠)、AAN86553(Brassica rapa subsp.Pekinensis)、CAA98718(Saccharomyces cerevisiae)、CAA04168(Arabidopsis thaliana)、XM_477896(Oryza sativa)、XM_479164(Oryza sativa)、BK000438(人類)、AF508940(人類)、AF151110(小鼠)、L24437(Arabidopsis thaliana)、P_AAY60008(人類)、P_ABJ19398(人類)、P_ABB11576(人類)、P_ABG95247(人類)、P_AAW74797(人類)、P_ABP69180(人類)、P_AAB92798(人類)、XP_064815(人類)、和/或P_AAG02591(人類)中闡述的那些，以及其同種型、片段、類似物或變體。COP1分子可以是Bianchiet al.30、Wang et al.39或Yi et al.20中描述的分子。COP1分子可以包括包含相應(yīng)于COP1的結(jié)構(gòu)域的序列的分子，例如，登記號(hào)為NP_071902的殘基136-177(RING結(jié)構(gòu)域)；登記號(hào)為NP_071902的殘基231-306(卷曲-纏繞結(jié)構(gòu)域(coiled-coilded domain))；和/或登記號(hào)為NP_071902的殘基410-727(WD40結(jié)構(gòu)域)。在某些實(shí)施方式中，COP1多肽包括能夠直接結(jié)合p53多肽和/或抑制p53活性或功能、基本上相同于在此列出的序列的分子。不限于任何特定的假說，COP1多肽可以形成同二聚體來負(fù)調(diào)節(jié)p53。因而，COP1可以包括能夠同二聚化的、基本上相同于在此列出的序列的分子。在某些實(shí)施方式中，具有在此列出的序列的COP1多肽或核酸分子可以具體地從根據(jù)本發(fā)明的某些方法中排除，例如，通過檢測COP1表達(dá)水平來診斷特定癌癥，例如乳腺癌的方法。
“p53”是編碼393個(gè)氨基酸的磷蛋白的強(qiáng)力腫瘤抑制蛋白26，27。p53在許多癌癥中被負(fù)調(diào)節(jié)或突變。40-43p53的缺乏或失活可能促發(fā)癌癥。存在各種p53突變?！耙吧汀眕53是在正常的(即，非癌細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的p53，或是不具有與癌癥相關(guān)的突變的p53?？梢栽u(píng)定樣品的p53狀態(tài)(例如，樣品是否包括野生型或突變體p53)，實(shí)例在Vogelstein等的美國專利6,090,566中描述，或使用例如在此描述的或本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。p53分子可以包括，但不限于，含有序列的多肽，所述序列基本上相同于在例如登記號(hào)為P04637中列出的，和由所述序列編碼的核酸分子。
MDM2或Pirh2分子包括連接酶7-10，其將遍在蛋白從E2酶，例如UbcH5b轉(zhuǎn)移到多賴氨酸殘基上的底物，或到底物偶聯(lián)的遍在蛋白上，來產(chǎn)生多聚遍在蛋白鏈，并且是p53的負(fù)調(diào)節(jié)物。7，25MDM2或Pirh2分子包括具有序列的分子，所述序列基本上相同于登記號(hào)為AF527840(MDM2)和AF255666(Pirh2)中闡述的那些，和由所述序列編碼的核酸分子。
p21或“WAF1/Cip1”最初被描述為cyclin依賴性激酶的通用抑制物。它由p53依賴性和p53非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)，并已經(jīng)被暗示作為細(xì)胞增殖的抑制物。P21分子包括具有序列的分子，所述序列基本上相同于登記號(hào)U03106中列出的那些，和由所述序列編碼的核酸分子。
“基本上相同的”序列是氨基酸或核苷酸序列，其不同于參考序列僅一個(gè)或多個(gè)保守性替換，或在此討論的，或一個(gè)或多個(gè)非保守性替換、刪除或插入，位于不破壞所述氨基酸或核酸分子的生物學(xué)功能的序列位置。當(dāng)在氨基酸或核苷酸水平使用例如Genentech開發(fā)的Align-2程序與用于比較的序列最佳地對(duì)齊時(shí)，這種序列可以是從10％到99％的任何整數(shù)、或更一般地至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多達(dá)96％、97％、98％或99％相同。對(duì)于多肽，比較序列的長度可以是至少2、5、10或15個(gè)氨基酸，或至少20、25或30個(gè)氨基酸。在可選擇的實(shí)施方式中，比較序列的長度可以是至少35、40或50個(gè)氨基酸，或超過60、80或100個(gè)氨基酸。對(duì)核酸分子，比較序列的長度可以是至少5、10、15、20或25個(gè)核苷酸，或至少30、40或50個(gè)核苷酸。在可選擇的實(shí)施方式中，比較序列的長度可以是至少60、70、80或90個(gè)氨基酸，或超過100、200或500個(gè)核苷酸。
此處的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定義為在對(duì)齊序列并引入缺口(如有必要)，達(dá)到最大序列同一性百分比之后，與選定序列中氨基酸殘基相同的候選序列中氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸序列同一性百分比的對(duì)齊可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種方式來實(shí)現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST(National Library of Medicinesoftware)、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于衡量對(duì)齊的合適的參數(shù)，包括在被比較的序列全長上實(shí)現(xiàn)最大對(duì)齊所需的任何算法。然而，在此處，通過使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2如下所述的獲得氨基酸序列同一性值％。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序是由Genentech，Inc.編寫的，以及以用戶文件在美國Copyright Office，Washington D.C.，20559提交，在那里它通過U.S.版權(quán)登記，登記號(hào)TXU510087，通過Genentech，Inc.，South San Francisco，California，公眾可獲得。ALIGN-2應(yīng)被編譯用于UNIX操作系統(tǒng)上，優(yōu)選為數(shù)字的UNIXV4.0D。通過ALIGN-2程序設(shè)置所有序列比較參數(shù)，并且不改變。
做為選擇，或另外地，兩個(gè)核酸序列如果它們在高嚴(yán)格條件下雜交可以是“基本上相同的”。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格度”通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定，一般是取決于探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)性計(jì)算。一般地，為了適當(dāng)退火，更長的探針需要更高的溫度，而更短的探針需要更低的溫度。雜交一般取決于當(dāng)在低于它們的熔解溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)變性的DNA重新退火的能力。在探針和可雜交序列之間期望的同源性越高，可以使用的相對(duì)溫度越高。結(jié)果，于是更高的相對(duì)溫度將傾向于產(chǎn)生更嚴(yán)格的反應(yīng)條件，而較低的溫度產(chǎn)生較低的嚴(yán)格度。對(duì)于雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度的其它細(xì)節(jié)和說明，參見，Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience Publishers，(1995)，將其引入本文作參考。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，雜交處在高嚴(yán)格條件下。在此定義的“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格條件”，可以通過以下來確定(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫度用于洗滌，例如在50℃0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉(2)在雜交期間采用變性劑，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉在42℃；或(3)在溶液中過夜雜交，所述溶液采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt’s溶液、超聲作用后的鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖在42℃，和在0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中在42℃洗滌10分鐘，繼之以含EDTA的0.1×SSC構(gòu)成的在55℃的10分鐘高嚴(yán)格洗滌。
“中度嚴(yán)格條件”可以如Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989所描述的確定，包括使用比以上描述的那些較低嚴(yán)格度的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中度嚴(yán)格條件的實(shí)例是在37℃在溶液中孵育過夜，所述溶液包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭魚精子DNA，繼之以在約37-50℃在1×SSC中洗滌濾膜。熟練技術(shù)人員將知道如何根據(jù)需要調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等等，來適應(yīng)探針長度等的因素。
雜交可以在約20到30分子、或約2到6小時(shí)、或約10到15小時(shí)、或超過24小時(shí)或更久的時(shí)段內(nèi)進(jìn)行。高嚴(yán)格雜交也依賴于由分子生物學(xué)家通常進(jìn)行的許多技術(shù)的成就，例如，高嚴(yán)格PCR、DNA測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和原位雜交。與northern和Southern雜交相比，這些技術(shù)通常用相對(duì)短的探針進(jìn)行(例如，通常約16個(gè)核苷酸或更長用于PCR或測序，約40個(gè)核苷酸或更長用于原位雜交)。
本領(lǐng)域公知的是，可以在多肽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行某些修飾和改變而基本上不改變該肽的生物學(xué)功能，來獲得生物學(xué)上等價(jià)的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽也擴(kuò)展到生物學(xué)上等價(jià)的肽，所述肽因不影響生物學(xué)功能的氨基酸替換而不同于本發(fā)明的多肽的序列的一部分。
如在此使用的，術(shù)語“保守的氨基酸替換”是指在肽的給定位置一個(gè)氨基酸對(duì)另一個(gè)的替換，在所述位置可以進(jìn)行替換而沒有相關(guān)功能的實(shí)質(zhì)(substantial)喪失。在進(jìn)行這種改變時(shí)，可以根據(jù)側(cè)鏈取代基的相似性，例如，它們的大小、電荷、疏水性、親水性等等進(jìn)行相似氨基酸的替換，可以通過常規(guī)測試來分析這種替換對(duì)肽的功能的影響。
如在此使用的，術(shù)語“氨基酸”是指在天然發(fā)生的蛋白質(zhì)中一般存在的那些L-氨基酸，D-氨基酸和當(dāng)它們被修飾時(shí)的那些氨基酸。因而，本發(fā)明的氨基酸可以包括，例如2-氨基脂肪酸；3-氨基己二酸；β-丙氨酸；β-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸；piperidinic acid；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基酸異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；鎖鏈素(Desmosine)；2，2’-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥基賴氨酸；別-羥基賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈素；別-異亮氨酸；N-甲基甘氨酸；肌氨酸；N-甲基異亮氨酸；6-N-甲基賴氨酸；N-甲基纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；和鳥氨酸。
在某些實(shí)施方式中，可以進(jìn)行保守的氨基酸替換，其中氨基酸殘基被具有相似親水性值(即，在加或減2.0、或者加或減1.5，或者加或減1.0，或者加或減0.5的值之內(nèi))的另一個(gè)替換，其中以下的可以是具有約-1.6的親水的指數(shù)的氨基酸，例如Tyr(-1.3)或Pro(1.6)被分配給氨基酸殘基(如在美國專利No.4,554,101中詳述的，引用本文作參考)Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。
在可選擇的實(shí)施方式中，可以進(jìn)行保守性氨基酸替換，其中氨基酸殘基被具有相似親水性指數(shù)的另一個(gè)替換(例如，在加或減2.0、或者加或減1.5、或者加或減1.0、或者加或減0.5的值之內(nèi))。在這種實(shí)施方式中，每個(gè)氨基酸殘基可以根據(jù)它們的疏水性和電荷特征分配親水性指數(shù)，如下Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
在可選擇的實(shí)施方式中，保守性氨基酸替換可以使用公眾可獲得的相似性矩陣家族來進(jìn)行(Altschul，S.F.1991.“Amino acid substitution matricesfrom an information theoretic perspective.”Journal of Molecular Biology，219555-665；Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.“A model ofevolutionary change in proteins.”In“Atlas of Protein Sequence and Structure”5(3)M.O.Dayhoff(ed.)，345-352，National Biomedical Research Foundation，Washington；States，D.J.，Gish，W.，Altschul，S.F.1991.“Improved Sensitivity ofNucleic Acid Database Search Using Application-Specific Scoring Matrices”MethodsA companion to Methods in Enzymology 3(1)66-77；StevenHenikoff and Jorja G.Henikoff.1992“Amino acid substitution matrices fromprotein blocks.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(biochemistry)10915-10919；M.S.Johnson and J.P.Overington.1993.“A Structural Basis of SequenceComparisonsAn evaluation of scoring methodologies.”Journal of MolecularBiology.233716-738.Steven Henikoff and Jorja G.Henikoff.1993.“Performance Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices.”ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics.1749-61；Karlin，S.and Altschul，S.F.1990.“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence featuresby using general scoring schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.872264-2268.)PAM矩陣基于來自進(jìn)化模型的計(jì)數(shù)，而Blosum矩陣使用了來自比對(duì)內(nèi)部高度保守的字塊的計(jì)數(shù)。在PAM或Blosum矩陣中零以上的相似性計(jì)分可以用來進(jìn)行保守性氨基酸替換。
在可選擇的實(shí)施方式中，可以進(jìn)行保守性氨基酸替換，其中氨基酸殘基被相同種類中的另一個(gè)替換，其中氨基酸被分為非極性的、酸性的、堿性的和中性的種類，如下非極性的Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性的Asp、Glu；堿性的Lys、Arg、His；中性的Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
保守性氨基改變可以包括通過相應(yīng)的D-氨基酸、通過保守的D-氨基酸、或通過天然發(fā)生的、氨基酸的非遺傳編碼的形式來替換L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守性替換。天然發(fā)生的非遺傳編碼的氨基酸包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基丙酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羥脯氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、t-丁基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亞砜、高精氨酸、N-乙?；嚢彼?、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4，-二氨基丁酸、p-氨苯基丙氨酸、N-甲基纈氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、delta-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。
在可選擇的實(shí)施方式中，保守性氨基酸改變包括基于親水性或疏水性、大小或容積、或電荷的考慮的改變。氨基酸一般可以被表征為疏水性或親水性的，主要依據(jù)氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。根據(jù)Eisenberg等(J.Mol.Bio.179125-142，184)的標(biāo)準(zhǔn)化的共有疏水性分值，疏水性氨基酸展現(xiàn)出大于零的疏水性，親水性氨基酸展現(xiàn)出低于零的親水性。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met和Trp，遺傳編碼的親水性氨基酸包括Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser和Lys。非遺傳編碼的疏水性氨基酸包括t-丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的親水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
疏水性或親水性的氨基酸可以根據(jù)它們的側(cè)鏈的特征進(jìn)一步細(xì)分。例如，芳香族氨基酸是具有含至少一個(gè)芳香環(huán)或雜芳香環(huán)的側(cè)鏈的疏水性氨基酸，其可以含有一個(gè)或多個(gè)取代基，例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等等，其中R獨(dú)立地是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20個(gè)原子的(5-20membered)雜芳基、取代的5-20個(gè)原子的雜芳基、6-26個(gè)原子的烷基雜芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26個(gè)原子的烷基雜芳基。遺傳編碼的芳香族氨基酸包括Phe、Tyr和Trp，而非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、beta-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
無極性氨基酸是具有在生理pH不帶電的側(cè)鏈的疏水性氨基酸，其具有鍵，在所述鍵中被兩個(gè)原子共有的一對(duì)電子一般由兩個(gè)原子的每一個(gè)相等地保持(即，側(cè)鏈不是極性的)。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Gly、Leu、Val、Ile、Ala和Met，而非遺傳編碼的非極性氨基酸包括環(huán)己基丙氨酸。非極性氨基酸可以被進(jìn)一步細(xì)分到包括脂肪族氨基酸，其是具有脂肪族烴側(cè)鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Ala、Leu、Val和Ile，而非遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。
極性氨基酸是具有生理pH下不帶電的側(cè)鏈的親水性氨基酸，但其具有一個(gè)鍵，其中由兩個(gè)原子共用的電子對(duì)被原子之一更緊密地保持。遺傳編碼的極性氨基酸包括Ser、Thr、Asn和Gln，而非遺傳編碼的極性氨基酸包括瓜氨酸、N-乙酰基賴氨酸和甲硫氨酸亞砜。
酸性氨基酸是側(cè)鏈pKa值低于7的親水性氨基酸。酸性氨基酸一般由于氫離子的損失在生理學(xué)pH具有帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Asp和Glu。堿性氨基酸是側(cè)鏈pKa值高于7的親水性氨基酸。堿性氨基酸一般由于與水合氫離子的締合在生理pH具有帶正電的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Arg、Lys和His，而非遺傳編碼的堿性氨基酸包括非環(huán)狀氨基酸鳥氨酸、2，3，-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，上述分類法不是絕對(duì)的，氨基酸可以被分類到超過一個(gè)種類中。此外，可以根據(jù)已知的行為和或特征性化學(xué)、物理或生物學(xué)性質(zhì)，根據(jù)特定分析，或與早先鑒定的氨基酸比較，來對(duì)氨基酸分類。氨基酸也可以包括具有氨基酸樣側(cè)鏈的雙功能部分。
保守性改變也可以包括通過例如氨基酸的功能性側(cè)基的反應(yīng)的化學(xué)上衍生部分對(duì)非衍生殘基的替換。因而，這些替換可以包括一些化合物，所述化合物的游離氨基以及被衍生為鹽酸胺、p-甲苯磺?；鶊F(tuán)、芐氧羰基基團(tuán)、t-丁氧羧基基團(tuán)、氯乙?；鶊F(tuán)或醛基基團(tuán)。類似地，游離羧基可以被衍生來形成鹽、甲基和乙基酯或其它類型的酯或酰肼，側(cè)鏈可以被衍生來形成對(duì)于游離羥基來說為O-酰基或O-烷基衍生物，或?qū)τ诮M氨酸的咪唑氮來說為N-im-苯基組氨酸。肽類似物還包括化學(xué)上改變的氨基酸，例如，通過甲基化、通過烷基胺例如乙胺、乙醇胺或乙二胺的C-末端氨基酸的酰胺化、或氨基酸側(cè)鏈的?；蚣谆?例如，賴氨酸的ε氨基的酰化)。肽類似物還可以包括用取代的酰胺(例如，式-C(O)-NR的化合物，其中R是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烯基或取代的(C1-C6)炔基)或酰胺鍵的電子等排物(isostere)(例如，-CH2NH-、-CH2S、-CH2CH2-、-CH＝CH-、(順式和反式)、-C(O)CH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-)替換肽中的酰胺鍵。
例如，通過聚合或接合(conjunction)，化合物可以共價(jià)連接來形成同聚物或異聚物?？梢允褂瞄g隔區(qū)(spacer)和接頭，其一般由小的中性分子，例如在生理?xiàng)l件下不帶電的氨基酸組成。可以以許多方式實(shí)現(xiàn)連接。例如，可以在肽末端添加半胱氨酸殘基，通過受控的氧化可以共價(jià)地結(jié)合多個(gè)肽。
做為選擇，可以使用異雙功能試劑，例如形成二硫化物/酰胺的試劑，或形成硫醚/酰胺的試劑?；衔镆部梢赃B接到另一個(gè)化合物，所述另一個(gè)化合物可以，例如，靶向癌細(xì)胞或抑制癌癥細(xì)胞的生長或增殖。例如，通過具有環(huán)狀的部分，也可以限制化合物。
肽或肽類似物可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)技術(shù)，例如，通過使用溶液或固相合成方法的自動(dòng)化合成來合成。自動(dòng)化的肽合成儀是商業(yè)上可獲得的，并使用了本領(lǐng)域公知的技術(shù)。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual.2nded.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)或Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，1994)中描述的那些，使用重組DNA技術(shù)來制備肽和肽類似物。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物包括基本上相同于COP1、MDM2、p21或p53核酸分子或其片段，或與COP1、MDM2、p21、或p53核酸分子或其片段互補(bǔ)的核酸分子。例如，這種核酸分子可以用作本發(fā)明的分析和方法中的探針或引物?！疤结槨被颉耙铩笔嵌x的序列的單鏈DNA或RNA分子，其可以與含有互補(bǔ)序列的第二DNA或RNA分子(目標(biāo))堿基配對(duì)。產(chǎn)生的雜交分子的穩(wěn)定性取決于發(fā)生堿基配對(duì)的程度，并受到一些參數(shù)，例如探針和目標(biāo)分子之間的互補(bǔ)性的程度和雜交條件的嚴(yán)格性的程度的影響。雜交嚴(yán)格度的程度受到一些參數(shù)，例如溫度、鹽濃度和有機(jī)分子例如甲酰胺的濃度的影響，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來測定。特異于在此描述的核酸序列的探針或引物，或其部分，可以在長度上不同，從至少8個(gè)核苷酸到超過500個(gè)供貨商的任何整數(shù)，包括中間的任何數(shù)字，取決于所為的目的、所處的條件、所使用的探針或引物。例如，探針或引物可以是長度8、10、15、20或25個(gè)核苷酸，或可以是長度至少30、40、50或60個(gè)核苷酸，或可以是長度超過100、200、500或1000個(gè)核苷酸。特異于在此描述的核酸分子的探針或引物可以與在此描述的核酸序列具有大于20-30％的序列同一性、或至少55-75％的序列同一性、或至少75-85％的序列同一性、或至少85-99％的序列同一性、或100％的序列同一性。
探針或引物可以來自基因組DNA或RNA，例如，通過擴(kuò)增，或來自克隆的DNA片段，并可以含有代表來自單個(gè)個(gè)體的單個(gè)基因的全部或一部分的基因組DNA或cDNA序列。探針可以具有獨(dú)特的序列(例如，與COP1或p53核酸分子的100％同一性)和/或具有已知的序列?？梢曰瘜W(xué)合成探針或引物。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，探針或引物可以放射性地或非放射性地被可檢測地標(biāo)記。探針或引物可以用于涉及核酸雜交的方法，例如，核酸測序、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、限制性片斷多態(tài)性(RFLP)分析、Southern雜交、northern雜交、原位雜交、電泳遷移移動(dòng)分析(EMSA)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。
核酸分子也可以是反義分子、siRNA分子或三螺旋(triple helix)分子，其可以用于例如降低細(xì)胞中目標(biāo)分子的表達(dá)。在此使用的“翻譯”涉及核酸是指與核酸分子，例如，基因，如COP1、mdm2、p21或p53基因的編碼鏈互補(bǔ)的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，反義核酸分子是當(dāng)都在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠降低由互補(bǔ)基因編碼的多肽的水平的核酸。在某些實(shí)施方式中，與在僅表達(dá)基因、不表達(dá)互補(bǔ)的反義核酸分子的細(xì)胞中的多肽水平相比，多肽水平被降低從至少10％到至少25％的任意值，或從至少25％到至少50％的任意值、或從至少50到至少75％的任意值、或從至少75％到100％的任意值、或從至少2倍到至少10倍的任意值、或100倍。
“siRNA”分子或“RNAi”分子是指形成雙鏈RNA的核酸，該雙鏈的RNA當(dāng)siRNA在基因或目標(biāo)基因的相同細(xì)胞中表達(dá)時(shí)具有降低或抑制基因或目標(biāo)基因的表達(dá)的能力?！皊iRNA”因而是指由互補(bǔ)鏈形成的雙鏈RNA。雜交以形成雙鏈分子的siRNA的互補(bǔ)部分一般具有基本上的或完全的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，siRNA是指具有與目標(biāo)基因基本上的或完全的同一性并形成雙鏈siRNA的核酸。siRNA的序列可以相應(yīng)于全長目標(biāo)基因，或其子序列。一般地，siRNA長度至少約15-50個(gè)核苷酸(例如，雙鏈siRNA的每個(gè)互補(bǔ)序列長度是15-50個(gè)核苷酸，雙鏈siRNA長度是約15-50個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選約20-30個(gè)堿基核苷酸、優(yōu)選長度約20-25或約24-29個(gè)核苷酸，例如，長度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。還參見PCT/US03/07237，完全引入本文作參考。當(dāng)siRNA或RNAi在表達(dá)目標(biāo)核酸的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果它降低所述核酸的表達(dá)至少約10％，那么可以說siRNA分子或RNAi分子“特異于”目標(biāo)核酸。
可以理解的是，在此討論的治療試劑，包括核酸分子，可以被修飾或合成，來改善它們的生物利用率、藥物動(dòng)力學(xué)和藥效性質(zhì)。例如，治療性核酸分子可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)合成從而伴有一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯鍵。
在某些實(shí)施方式中，測試化合物包括小的有機(jī)分子?！靶〉挠袡C(jī)分子”是指天然發(fā)生或合成的有機(jī)分子，其具有超過約50道爾頓并低于約2500道爾頓、優(yōu)選低于約2000道爾頓，優(yōu)選在約100到約1000道爾頓之間、更優(yōu)選在約200到約500道爾頓之間的分子量。小的有機(jī)分子可以是遍在蛋白連接酶抑制物，例如Ro106-9920和其類似物。44在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，測試化合物包括能夠干擾COP1/p53相互作用或結(jié)合的抗體。測試化合物也可以包括肽、核酸分子或小分子，其能夠干擾COP1/p53相互作用或結(jié)合和/或抑制COP1活性(例如，COP1酶活性)。
候選或測試化合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法從天然產(chǎn)物的大庫或合成的(或半合成的)提取物或化學(xué)物質(zhì)庫來鑒定。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的設(shè)計(jì)人員將理解，測試提取物或化合物的準(zhǔn)確的來源對(duì)于本發(fā)明的方法不是關(guān)鍵的。因而，使用在此描述的示范性的方法可以篩選實(shí)際上許多的化學(xué)提取物或化合物。這種提取物或化合物的實(shí)例包括，但不限于，基于植物、真菌、原核生物或動(dòng)物的提取物、發(fā)酵肉湯、和合成的化合物，以及已有化合物的修飾。對(duì)于任何數(shù)量的化合物，包括但不限于，基于糖類、脂質(zhì)、肽和核酸的化合物的隨機(jī)產(chǎn)生或直接合成(例如，半合成或全合成)，許多方法也是可獲得的。合成的化合物庫是商業(yè)上可獲得的。做為選擇，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的庫是從許多來源的商業(yè)途徑可獲得的，包括Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceanographic Institute(Ft.Pierce，F(xiàn)L，USA)和PharmaMar，MA，USA.。此外，如果希望，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過標(biāo)準(zhǔn)的提取和分餾方法，產(chǎn)生天然或合成產(chǎn)生的庫。此外，如果希望，使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)、物理或生物化學(xué)方法容易地修飾任何庫或化合物。
例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)粗提物抑制COP1/p53相互作用時(shí)，進(jìn)一步分餾陽性引導(dǎo)性提取物(positive lead extract)是必需的，以分離對(duì)觀察的效果直接相關(guān)的化學(xué)組分。因而，提取、分餾和純化過程的目標(biāo)是具有COP1/p53結(jié)合抑制活性的粗提物中化學(xué)實(shí)體的仔細(xì)表征和鑒定。在此描述的用于化合物的混合物中活性檢測的相同分析可以被用于純化活性成分和測試其衍生物。分餾和純化這種異質(zhì)提取物的方法是本領(lǐng)域已知的。如果希望，被證明是對(duì)治療有用的試劑的化合物根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行化學(xué)修飾。鑒定為具有治療、預(yù)防、診斷或其它價(jià)值的化合物可以使用，例如，任何癌癥動(dòng)物模型來隨后進(jìn)行分析。
診斷、治療、預(yù)防和/或篩選的用途、分析方法和試劑根據(jù)本發(fā)明的化合物、組合物(例如，藥物組合物)和方法可以在受試者中用于診斷癌癥或用于治療或預(yù)防癌癥，或用于篩選對(duì)治療或預(yù)防癌癥有用的測試化合物。
在此使用的，受試者可以是人類、非人靈長類、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、蠅、蠕蟲，等等。受試者可以是臨床患者、臨床試驗(yàn)志愿者、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，等等。受試者可以被懷疑患有癌癥或存在患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，被診斷患有癌癥，或是確認(rèn)沒有患癌癥的對(duì)照受試者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受試者是人類。
癌癥的診斷方法和癌癥診斷的臨床描繪是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。如在此討論的，通過測量COP1表達(dá)水平可以診斷或檢測各種癌癥，其中COP1的過量表達(dá)表明了癌癥診斷結(jié)論?！斑^量表達(dá)”是指相對(duì)于對(duì)照，例如，相對(duì)于由非癌細(xì)胞正常產(chǎn)生的表達(dá)水平，特定分子，例如COP1的mRNA或多肽表達(dá)增加。展現(xiàn)COP1分子的過量表達(dá)的癌癥也可以展現(xiàn)p53分子(例如，p53多肽)的降低的表達(dá)，或p21分子(例如，p21mRNA)的降低的表達(dá)?！氨磉_(dá)水平的降低”是指相對(duì)于對(duì)照，例如，相對(duì)于由非癌細(xì)胞正常產(chǎn)生的表達(dá)水平，特定分子，例如p53或p21的mRNA或多肽表達(dá)的降低。當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)，這種提高或降低可以是10％和90％之間的任何值，或30％和60％之間的任何值，或超過100％，或可以是2倍到10倍之間的任何值，包括2倍和10倍，或更高，例如100倍。過量表達(dá)或提高、或者降低或減少的精確數(shù)量不是關(guān)鍵的，只要過量表達(dá)或降低是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
根據(jù)本發(fā)明的試劑包括在此描述的化合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包括在此描述的化合物的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，通過例如重組技術(shù)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以被工程化，用以包括重組p53、重組Pirh2、重組MDM2和/或重組COP1分子，或用以降低或敲除內(nèi)源蛋白表達(dá)，或通過改變編碼這些蛋白的基因來突變那些蛋白。這些分子的表達(dá)水平或活性可以通過例如使用特異性針對(duì)這些分子的siRNA分子來降低。例如，這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如可以用于篩選干擾p53/COP1結(jié)合或抑制p53或COP1活性的測試化合物。
例如，為了篩選用于治療癌癥或細(xì)胞增殖性失調(diào)的測試化合物，對(duì)照細(xì)胞可以表達(dá)降低的或零水平的p53，和表達(dá)正?；蛟龈叩乃降腃OP1。測試細(xì)胞可以表達(dá)正?；蛟龈咚降腃OP1和p53兩者?？梢杂脺y試化合物孵育這種細(xì)胞，分析細(xì)胞周期、p21表達(dá)、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、p53依賴性反式激活、COP1連接酶活性等等方面的變化?？梢允褂没跇?gòu)建體的報(bào)告物例如p21-熒光素酶，使用內(nèi)部熒光素酶報(bào)告物作為背景以及實(shí)時(shí)RT-RCR技術(shù)。這種哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在現(xiàn)有細(xì)胞系中進(jìn)行工程化，例如p53野生型細(xì)胞系(U2-OS細(xì)胞)、或p53-null細(xì)胞系(H1299)，其可以被工程化來過量表達(dá)COP1分子。
根據(jù)本發(fā)明的分析可以在體內(nèi)、體外或回體(ex vivo)使用從標(biāo)準(zhǔn)來源獲得的樣品并通過標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行?！皹悠贰笨梢允侨魏畏蛛x自受試者的器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞提取物，例如分離自患有癌癥的哺乳動(dòng)物的樣品。例如，樣品可以包括，但不限于，細(xì)胞或組織(例如，來自活組織檢查或尸檢)，其來自從患者(人類或動(dòng)物)、測試受試者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物獲得的骨骼、腦、乳腺、結(jié)腸、肌肉、神經(jīng)、卵巢、前列腺、視網(wǎng)膜、皮膚、骨骼肌、腸、睪丸、心臟、肝臟、腎臟、胃、胰腺、子宮、腎上腺、扁桃體、脾、軟組織、外周血、全血、紅血球濃縮物、血小板濃縮物、白細(xì)胞濃縮物、血細(xì)胞蛋白、血漿、富血小板血漿、血漿濃縮物、來自血漿的任何分餾物的沉淀、來自血漿的任何分餾物的上清液、血漿蛋白質(zhì)餾分、純化的或部分純化的血液蛋白或其它成分、血清、精液、哺乳動(dòng)物初乳、奶、尿、大便、唾液、腦脊液、心包液、腹膜液、胎盤提取物、羊水、冷沉淀物(cryoprecipitate)、冷上清液、細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)物、腹水、血細(xì)胞中存在的蛋白、實(shí)體腫瘤或其它樣本，或其任何提取物。在某些實(shí)施方式中，期望的是從樣品中得到的與非癌細(xì)胞分離的癌細(xì)胞。
樣品還可以包括，但不限于，由正常的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(例如，經(jīng)由重組DNA或單克隆抗體技術(shù))的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的產(chǎn)物。樣品還可以包括，但不限于，分離自非哺乳動(dòng)物受試者，例如昆蟲或蠕蟲的任何器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞提取物?！皹悠贰币部梢允窃趯?shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的、不是從受試者直接分離的細(xì)胞或細(xì)胞系。樣品也可以是無細(xì)胞的、人工衍生的或合成的。樣品可以來自已知是癌的、懷疑是癌的、據(jù)信不是癌的(例如，正常的或?qū)φ盏?的細(xì)胞或組織。
“對(duì)照物”包括用于確定基線表達(dá)或活性而獲得的樣品。因而，可以通過許多方法從非癌細(xì)胞或組織，例如從圍繞受試者的腫瘤或癌的細(xì)胞；從沒患癌癥的受試者；從不懷疑存在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者；或從來自這些受試者的細(xì)胞或細(xì)胞系獲得對(duì)照樣品。對(duì)照物還包括早先已建立的標(biāo)準(zhǔn)物。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施的任何測試或分析可以與所述建立的標(biāo)準(zhǔn)物相比，可以不必每次獲得用于比較的對(duì)照樣品。在體外遍在化分析中，對(duì)照物可以是具有降低的遍在化p53分子能力的COP1分子(例如，在它的連接酶結(jié)構(gòu)域中有缺陷的分子例如COP1RΔRing)。
例如，COP1或p53分子可以在癌細(xì)胞、組織或細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(cell lysate)中提供，或可以使用重組技術(shù)構(gòu)建。可以使用微陣列，例如組織微陣列?？梢詮募?xì)胞或細(xì)胞系的商業(yè)來源，例如，ATCC，Manassas，VA，USA獲得重組蛋白、細(xì)胞和/或細(xì)胞系。
可以從例如The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA，獲得癌癥的適合的動(dòng)物模型。在某些實(shí)施方式中，可以使用在COP1或p53表達(dá)或活性中有缺陷的動(dòng)物模型。
COP1或p53核酸分子或多肽表達(dá)或活性，或COP1/p53結(jié)合可以使用各種技術(shù)來分析，包括免疫組織化學(xué)(IHC)、原位雜交(ISH)、Northern印跡、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，實(shí)時(shí)定量PCR或RT-PCR)、基于抗體的分析，例如免疫沉淀、免疫熒光、Western印跡，核酸測序等等。例如，對(duì)來自樣品的PCR產(chǎn)物的如測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析或限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析的方法可以用于檢測COP1或p53基因中的突變；免疫沉淀、RIA、ELISA或Western印跡可以用于測量COP1或p53多肽的水平或結(jié)合；COP1或p53基因或mRNA的表達(dá)可以使用反義寡核苷酸、siRNA或形成三鏈寡核苷酸下調(diào)來抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯；northern印跡可用于測量COP1或p53mRNA水平，或者PCR可以用于測量COP1或p53核酸分子的水平。這種分析包括任何或所有形式的COP1或p53的檢測，包括前體、片段(例如，由內(nèi)蛋白水解性降解產(chǎn)生的)、翻譯后修飾的形式，等等。本發(fā)明的方法涵蓋對(duì)COP1相關(guān)生物學(xué)活性的分析，例如p53降解、p53的遍在化、p53反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用、p21mRNA的降低，等等。
在某些實(shí)施方式中，受試者中的細(xì)胞可以在體內(nèi)暴露于抗體(例如，COP1抗體或p53抗體或兩者)，所述抗體任選地被可檢測地標(biāo)記，例如放射性同位素，通過，例如放射性的外部掃描或活組織的分析可以評(píng)估所述抗體與細(xì)胞的結(jié)合。
可以使用可檢測地標(biāo)記的分子，即，用于標(biāo)記和鑒定分子，例如寡核苷酸探針或引物、基因或其片段、肽、或cDNA分子的存在的任何手段，來進(jìn)行分析?？蓹z測地標(biāo)記分子的方法是本領(lǐng)域公知的，包括，但不限于，放射性標(biāo)記(例如，用同位素例如32P或35S)和非放射性的標(biāo)記，例如酶的標(biāo)記(例如，使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記，熒光標(biāo)記(例如，使用熒光素)、生物發(fā)光標(biāo)記、或?qū)Ω街谔结樀呐潴w的抗體檢測。還包括在這個(gè)定義內(nèi)的是通過間接手段可檢測地標(biāo)記的分子，例如，與第一部分(例如生物素)結(jié)合、隨后與可被觀察和分析的第二部分(例如，熒光素標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白)結(jié)合的分子。標(biāo)記還包括毛地黃毒苷、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
“檢測”是用來包括確定物質(zhì)的存在或不存在，或定量物質(zhì)的數(shù)量。因而該術(shù)語是指使用本發(fā)明的材料、組合物和方法用于定性的和定量的測定。一般地，用于檢測的特定技術(shù)對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明不是關(guān)鍵的。例如，根據(jù)本發(fā)明的“鑒定”包括使用本領(lǐng)域已知的或以下描述的方法檢測COP1、mdm2、p21或p53的基因、基因組或核酸分子或者COP1、mdm2、p21或p53多肽的存在或缺乏；COP1、mdm2、p21或p53基因中的突變；COP1、mdm2、p21或p53核酸分子，例如，mRNA或多肽的表達(dá)水平的變化；COP1多肽(例如，COP1連接酶活性、p53翻轉(zhuǎn)(turnover)、p53依賴性反式激活活性的抑制)或p53多肽(例如，p53結(jié)合、p53依賴性反式激活、COP1結(jié)合、p21的反式激活，等等)的生物學(xué)功能/活性的變化。在某些實(shí)施方式中，“檢測”可以包括檢測野生型p53。在某些實(shí)施方式中，“檢測”可以包括檢測突變型p53。檢測可以包括定量當(dāng)與對(duì)照物相比時(shí)在10％和90％之間的任何值、或30％和60％之間的任何值、或超過100％的變化(提高或降低)。檢測可以包括定量2倍到10倍之間的任何值，包括2倍和10倍，或更高，例如100倍的改變。
藥物組合物&獸醫(yī)用組合物、劑量和施用本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)地或與其它化合物(例如，核酸分子、小分子、肽或肽類似物)組合地，在存在脂質(zhì)體、佐劑或任何藥學(xué)上可接受的載體的情況下，以適合于向哺乳動(dòng)物，例如，人類、小鼠等施用的形式來提供。如果希望，用根據(jù)本發(fā)明的化合物處理可以和更多傳統(tǒng)的和現(xiàn)有的癌癥治療組合，例如化學(xué)療法例如烷化劑、抗代謝物、抗生素、抗微管化合物，例如，Avastin、CPT11、oxaliplatin、放射療法，例如電離輻射，等等。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的的治療化合物包括針對(duì)COP1、p53、p21、MDM2或Pirh2分子的siRNA分子。根據(jù)本發(fā)明的的化合物可以長期地(chronically)或間歇地(intermittently)提供?！伴L期施用”是指化合物連續(xù)地施用延長的時(shí)間段，代替使用急性的短期劑量，以便維持最初的治療效果(活性)?！伴g歇的”施用是用沒有具體化合物的治療的時(shí)段點(diǎn)綴其間的治療。
可以采用常規(guī)的藥物實(shí)踐來提供適合的制劑或組合物，來將所述化合物施用給患有癌癥或癌癥前期癥狀的受試者?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)氖┯猛緩?，例如，胃腸外的、靜脈內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、顱內(nèi)的、眶內(nèi)的、眼的、心室內(nèi)的、囊內(nèi)的、脊柱內(nèi)的、鞘內(nèi)的、腦池內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、氣霧、表面的或口服施用。治療制劑可以是液體溶液或懸浮液形式，對(duì)于口服施用，制劑可以是片劑或膠囊的形式；對(duì)于鼻內(nèi)的制劑，為粉末、滴鼻劑或氣霧劑的形式。
在例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(19thedition)，ed.A.Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa中，可以找到用于制備制劑的本領(lǐng)域公知的方法。用于腸胃外施用的制劑可以，例如，含有賦形劑、無菌水或鹽水、聚二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、或氫化的萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧化丙烯共聚物可以用來控制化合物的釋放。其它潛在地有用的胃腸外遞送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。用于吸入的制劑可以含有賦形劑，例如，乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或可以是用于以滴鼻劑形式或作為膠體施用的油溶液。對(duì)于治療或預(yù)防或防止性組合物，取決于癌癥，以足夠防止、抑制或減緩癌癥生長或發(fā)展的量向個(gè)體施用化合物?；衔锏男ЯΦ臏y量包括可觀察的和/或可測量的以下一種或多種的降低或消失癌細(xì)胞數(shù)目的降低或癌細(xì)胞消失，腫瘤大小的降低；癌細(xì)胞向周圍器官浸潤得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤生長在一定程度上得到抑制；和/或與具體癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀一定程度上得到減輕，和發(fā)病率和死亡率降低。
根據(jù)本發(fā)明的“有效量”的化合物包括治療有效量或預(yù)防有效量。“治療有效量”是指在劑量上和在必需的時(shí)段內(nèi)，實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果有效的量，所述治療結(jié)果例如可觀察的和/或可測量的以下一種或多種的降低或消失癌細(xì)胞數(shù)目的減少或癌細(xì)胞消失，腫瘤大小的降低；癌細(xì)胞向周圍器官浸潤得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤生長在一定程度上得到抑制；和/或與具體癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀在一定程度上得到減輕，和發(fā)病率和死亡率降低?；衔锏闹委熡行Я靠梢愿鶕?jù)一些因素例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體的體重，和化合物在個(gè)體中引發(fā)期望的反應(yīng)的能力而變化?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案來提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量也是一種量，其中治療有益的效果勝過化合物的任何毒性或不利影響?！邦A(yù)防有效量”是指在劑量上和必需的時(shí)段內(nèi)，實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果有效的量，例如可觀察的和/或可測量的一種或多種以下的降低或消失癌細(xì)胞數(shù)目的減少或癌細(xì)胞消失，腫瘤大小的降低；癌細(xì)胞向周圍器官浸潤得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移得到抑制(即，防止、抑制、減緩或停止)；腫瘤生長在一定程度上得到抑制；和/或與具體癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀在一定程度上得到減輕，和發(fā)病率和死亡率降低。一般地，在疾病之前或較早階段，在受試者中使用預(yù)防劑量，從而預(yù)防有效量可以低于治療有效量。化合物的治療或預(yù)防有效量的優(yōu)選的范圍可以是從0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM之間的任何整數(shù)。
注意到，給藥值可以隨要減輕的狀況的嚴(yán)重度而變化。對(duì)于任何具體受試者，根據(jù)個(gè)體需要和施用或監(jiān)督組合物的施用的人的專業(yè)判斷，可以調(diào)節(jié)具體的給藥方案。以上闡述的劑量范圍僅是示范性的，不限制可由執(zhí)業(yè)醫(yī)生選擇的劑量范圍。組合物中活性化合物的量可以根據(jù)一些因素例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體的體重而變化?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案來提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以使用單個(gè)丸劑(a single bolus)，可以隨著時(shí)間使用幾個(gè)分開的劑量(sevral divided doses)，或劑量可以視治療情況的需求成比例降低或提高。以劑量單位形式(dosage unit form)配置胃腸外的組合物可能是有益的，便于施用和劑量均勻化(uniformity)。
對(duì)于疫苗制劑來說，可以提供本發(fā)明的化合物的免疫原性有效量，單獨(dú)地或與其它化合物組合，與免疫佐劑，例如，F(xiàn)reund’s不完全佐劑、二甲基雙十八烷基銨氫氧化物或氫氧化鋁施用。化合物也可以與載體分子例如牛血清白蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)來增強(qiáng)免疫原性。
一般地，應(yīng)當(dāng)使用本發(fā)明的化合物而不引起實(shí)質(zhì)上的毒性。本發(fā)明的化合物的毒性可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定，例如，通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測試，并確定治療指數(shù)，即，LD50(對(duì)群體的50％致死的劑量)和LD100(對(duì)群體的100％致死的劑量)之間的比例。然而在某些情況下，例如在嚴(yán)重的疾病狀況中，施用實(shí)質(zhì)上過量的組合物可能是必需的。
實(shí)施例1材料和方法表達(dá)載體、重組蛋白和抗體早先已經(jīng)描述了Flag-COP133。通過將COP1 PCR亞克隆到pcDNA3.1+(Invitrogen)中產(chǎn)生HA-COP1，通過將COP1亞克隆到pGEX6P1(Pharmacia)中產(chǎn)生GST-COP1。早先已經(jīng)描述了pcDNA3.1+53、pG13-Luc、p21-Luc、bax-Luc、NS-Luc和pCMV-MDM221，22，35。
從來自HEK293T細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增全長COP1。通過PCR將HA-COP1亞克隆到pcDNA3.1+(Invitrogen)中，通過PCR和亞克隆到pGEX6P1(Pharmacia)中產(chǎn)生GST-COP1。通過將含有來自COP1啟動(dòng)子的p53共有位點(diǎn)的兩個(gè)拷貝、或含有共有位點(diǎn)的突變體的寡核苷酸連接到pGL3-啟動(dòng)子(Promega)中，產(chǎn)生COP1-Luc和COP1mut-Luc。
所有GST重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)密碼子+(Stratagene)中表達(dá)，用1mg/ml溶菌酶超聲降解，在PBS中用蛋白酶抑制物混合物(Roche)用1％TritonX-100溶解，隨后使用Glutathione Sepharose4B分批方法純化，用還原的谷胱甘肽洗脫或用PreScission蛋白酶(Pharmacia)裂解。重組蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯使用帶T7/T3的TnT試劑盒(Promega)或Rapid翻譯系統(tǒng)(RTS)(Roche)進(jìn)行。
根據(jù)廠家的推薦使用抗-p53(DO-1；Calbiochem)、抗-p53(1801；BDPharmingen)、抗-p53(FL-393；Santa Cruz Biotechnology)、抗-p21(Ab-1；Calbiochem)、抗-MDM2(2A10；Calbiochem)、抗-Flag(M2；Sigma)、抗-Myc(9E10；Roche)、抗-His-HRP(Roche)、抗-肌動(dòng)蛋白(ICN)、抗-GST(B-14；Santa Cruz Biotechnology)和抗-HA(Roche)?？?COP1是針對(duì)人類COP1的氨基酸71-270產(chǎn)生的單克隆抗體。
細(xì)胞、轉(zhuǎn)染、報(bào)告物和細(xì)胞凋亡分析U2-OS、Saos-2、HEK293T和BJ細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并在McCoy’s 5A(Invitrogen)或DMEM(Sigma)培養(yǎng)基中維持。p53-/-/MDM2-/-MEFs在具有10％FBS和1x L-Glutamine的DMEM中生長。H1299細(xì)胞在RPMI中生長。
根據(jù)廠家的推薦使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)或Geneporter 2(Gene Therapy Systems)進(jìn)行所有轉(zhuǎn)染。為了評(píng)價(jià)COP1對(duì)p53的穩(wěn)態(tài)水平的影響，用漸增量的FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING和250或500ng pcDNA3.1+p53轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，或者用或不用漸增量(0.5、1和2μg)的pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，按說明在收獲細(xì)胞之前用50μMALLN處理6小時(shí)。
對(duì)于報(bào)告物分析，用150或250ng pcDNA3.1+p53或pcDNA3.1+p53R175H、100ng p21-Luc、bax-Luc、COP1-Luc、COP1mut-Luc或NS-Luc，和10ng pCMVβ-Gal，有或沒有漸增量(0.5、1和2μg)的pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING短暫地轉(zhuǎn)染Saos-2或H1299細(xì)胞。根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行熒光素酶分析，并針對(duì)β-半乳糖苷酶活性(Promega)歸一化。
對(duì)于p53依賴性細(xì)胞死亡分析，用1μg增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)和5μg pcDNA3.1+、pcDNA3.1+p53、pCMV-FLAG-COP1或pcDNA3.1+p53和pCMV-FLAG-COP1短暫地轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞48小時(shí)。收獲細(xì)胞，用碘化丙錠染色，用于通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行分析。挑選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，根據(jù)DNA含量確定隨后的細(xì)胞周期分布型。
通過Genentech或Dharmacon合成具有30個(gè)dTdT懸伸的COP1siRNA1(AACUGACCAAGAUAACCUUGA)(SEQ ID NO2)，COP1siRNA1反向的(AAAGUUCCAAUAGAACCAGUC)(SEQ ID NO3)，COP1siRNA2(AAGACUUGGAGCAGUGUUACU)(SEQ ID NO4)，COP1siRNA3(AAGAGGUGUUGGAGUGUUGAC)(SEQ ID NO5)，Pirh2siRNA1(AACTGTGGAATTTGTAGG)(SEQ ID NO6)，Pirh2B反向的(AAGGAUGUUUAAGGUGUCAA)(SEQ ID NO7)，Pirh2siRNA2(AAUGUAACUUAUGCCUAGCUA)(SEQ ID NO8)，Pirh2siRNA2反向的(AAAUCGAUCCGUAUUCAAUGU)(SEQ ID NO9)和MDM2(AAGGAAUUUAGACAACCUGAA)(SEQ ID NO10)siRNA寡核苷酸。實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照siRNA是指反向的siRNA寡核苷酸的混合物。用siRNA寡核苷酸以24-36h的間隔轉(zhuǎn)化U2-OS、h1299、Saos-2和BJ細(xì)胞三次，并根據(jù)需要擴(kuò)增以防止接觸抑制。
免疫沉淀和GST pull down分析在免疫沉淀(IP)裂解緩沖液(1％Triton X-100，150mM NaCl，50mMTris，pH 7.4，和蛋白酶抑制物混合物)或放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液(0.1％SDS，1％NP-40，150mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鹽，50mM Tris，pH 7.4，和蛋白酶抑制物混合物)中裂解細(xì)胞，用目標(biāo)抗體和蛋白A/GPLUS珠子(Pierce)預(yù)先澄清和免疫沉淀。COP1相互作用蛋白的鑒定如早先描述的進(jìn)行33，除了制備穩(wěn)定地表達(dá)Flag-COP1的U2-OS細(xì)胞。
在PBST(具有0.1％Tween 20的PBS)中用與體外翻譯的HA-COP1組合的5μg GST或GST-p53，在冰上孵育1小時(shí)進(jìn)行GST pull down分析。然后向混合物添加谷胱甘肽瓊脂糖4B珠子，孵育1小時(shí)，隨后用PBST洗滌5次。使GST-結(jié)合的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和使用抗-HA和抗-GST對(duì)其進(jìn)行免疫印跡。按需要用高鹽裂解緩沖液洗滌IPs。如早先描述的進(jìn)行脈沖追蹤試驗(yàn)7，除了用pCMV-Flag6a或pCMV-Flag-COP1轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞24h，和用所指明的siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞。
原位雜交、實(shí)時(shí)PCR和Northern印跡如早先描述的23，使用COP1-1特異性688bp33P標(biāo)記的反義核探針，對(duì)石蠟包埋的組織和組織微陣列(TMA)切片進(jìn)行同位素原位雜交。這種探針覆蓋了COP-1從核苷酸364開始編碼序列的大部分5′一半。從相同的模板轉(zhuǎn)錄的并包括在每個(gè)雜交實(shí)驗(yàn)中的有義對(duì)照探針沒有顯示在任何組織中的背景之上的信號(hào)。如早先描述24的構(gòu)建代表正常組織和卵巢腫瘤的TMA。卵巢腫瘤TMA由正常卵巢、輸卵管、子宮的樣品以及78個(gè)表面上皮細(xì)胞瘤組成。使用Qiagen RNAeasy試劑盒從細(xì)胞或組織提取總RNA，設(shè)計(jì)探針用于COP1、p21、RPL19和β-肌動(dòng)蛋白mRNA的實(shí)時(shí)PCR。使用ABI 7700序列檢測器根據(jù)廠家的推薦進(jìn)行所有反應(yīng)。
在65℃在Church緩沖液(35.5g/L Na2HPO4，0.17％(v/v)H3PO4，1％(w/v)牛血清白蛋白，1mM EDTA，7％(w/v)SDS)中小鼠Multiple TissueNorthern Blots(Clontech)與全長、32P標(biāo)記的鼠COP1cDNA雜交過夜。在40mM磷酸鈉緩沖液pH 7.2/1％(w/v)SDS中在65℃洗滌濾膜，在-70℃對(duì)底片曝光。
體外和體內(nèi)遍在化分析對(duì)于體外遍在化反應(yīng)，用抗-p53(DO-1和1801)免疫沉淀體外翻譯的p53，用PBST洗滌5次，在蛋白A/G珠子上進(jìn)行反應(yīng)。在室溫用20μM ZnCl2預(yù)先孵育30分鐘的10μg His-Ubiquitin(Boston Biochem)或FLAG-遍在蛋白(Sigma)、20ng Ubc5Hb(A.G.Scientific)、20ng兔E1(Sigma)和500ng GST-COP1(E3)，與30μl的總體積的含有50mM Tris pH7.5，2mMATP，5mM MgCl2和2mM DTT的緩沖液孵育。在30℃孵育2小時(shí)之后，然后在具有1％SDS的PBST中使反應(yīng)沸騰5分鐘，然后降低到0.2％的SDS使用抗-p53(DO-1和FL-393)進(jìn)行重新免疫沉淀。最后，在95℃在SDS樣品緩沖液中用2-巰基乙醇孵育樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，繼之以使用抗-His-HRP(Roche)或抗-FLAG-HRP(M2)的免疫印跡來檢測p53的遍在化的種類。
對(duì)于體內(nèi)分析，用100ng HA-Ub、500ng pcDNA3.1+p53、2μgpCMV-FLAG6a、pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)化H1299s或p53-/-/MDM2-/-MEF，在收獲之前用50μM ALLN處理2小時(shí)，用抗-HA進(jìn)行免疫沉淀和用抗-p53(DO-1)進(jìn)行Western印跡。
COP1相互作用蛋白的鑒定通過用pcDNA3.1+共轉(zhuǎn)染并根據(jù)G418(Invitrogen)抗性進(jìn)行選擇，產(chǎn)生表達(dá)pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG6a的U2-OS穩(wěn)定細(xì)胞系。擴(kuò)增FLAG或FLAG-COP1表達(dá)克隆并用50μM ALLN處理2小時(shí)，然后用低滲的裂解緩沖液(10mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM HEPES pH7.9，1mM DTT、蛋白酶抑制物混合物)收獲，繼之進(jìn)行勻漿。然后將通過離心澄清的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行與抗-FLAG M2珠子(Sigma)的孵育。在過夜孵育之后，用洗滌緩沖液1(20mM HEPES pH7.9，420mM NaCl，1.5mM MgCl2，0.2mM EDTA，25％甘油和蛋白酶抑制物混合物)洗滌珠子1次，用洗滌緩沖液2(0.1％NP-40，20mM Tris pH7.5，300mM NaCl和蛋白酶抑制物混合物)洗滌5次。用300μg/ml FLAG肽(Sigma)洗脫結(jié)合的蛋白，隨后通過SDS和銀染色分析。切下感興趣的條帶，用胰蛋白酶原位消化，通過毛細(xì)管液相色譜-離子阱串聯(lián)的質(zhì)譜法(ion trap tandem mass spectrometry)對(duì)產(chǎn)生的肽測序。
p53基因測序、實(shí)時(shí)PCR和western印跡分離腫瘤樣品并通過強(qiáng)力渦旋在裂解緩沖液(1％SDS、20mM TrispH7.5，2mM EDTA，400mM NaCl)中進(jìn)行重懸浮，補(bǔ)充500μg/ml蛋白酶K(Sigma)，在55℃孵育過夜直到樣品完全消化。然后將樣品以1∶1比例和苯酚-氯仿-isoayml alcohol(25∶24∶1)重懸浮，以14,000rpm離心10分鐘之前在室溫孵育30分鐘。然后在等體積的異丙醇中重懸浮上部的水層，進(jìn)一步離心15分鐘。產(chǎn)生的團(tuán)粒在70％乙醇中洗滌，在無核酸酶的H2O中重懸浮。對(duì)于石蠟包埋的組織微陣列樣品，通過在65℃在30μlPicoPure K提取緩沖液(Arcturus，Mountainview，CA)中孵育微切割的腫瘤組織48小時(shí)來提取DNA。在95℃將消化物熱鈍化10分鐘，直接添加到PCR反應(yīng)中(ExpandHigh Fidelity PCR系統(tǒng)，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。分離的基因組DNA進(jìn)行用以下引物進(jìn)行PCR，所述引物針對(duì)p53基因的外顯子5-8并包括M13特異性序列外顯子5R(CAGGAAACAGCTATGACCAGCCCTGTCGTCTGTCCA)(SEQ ID NO11)外顯子5F(TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAACTCTGTCTCCTTC)(SEQ ID NO12)外顯子6R(CAGGAAACAGCTATGACCTTAACCCCTCCTCCCAGAGA)(SEQ ID NO13)外顯子6F(TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCTGATTCCTCACTGAT)(SEQ ID NO14)外顯子7R(CAGGAAACAGCTATGACCTGTGCAGGGTGGCAAGTGGC)(SEQ ID NO15)外顯子7F(TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCGCACTGGCCTCATCTT)(SEQ ID NO16)外顯子8R(CAGGAAACAGCTATGACCAGGCATAACTGCACCCTTGG)(SEQ ID NO17)外顯子8F(TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTACTGCCTCTTGCTTCTC).(SEQ ID NO18)用M13F和M13R測序引物，使用熒光染料-終止子化學(xué)方法(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City CA)對(duì)PCR產(chǎn)物測序。
使用如下的針對(duì)COP1、p21、Pirh2、β-肌動(dòng)蛋白和RPL19的特異性探針，從分離自正常和腫瘤樣品的總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用ABI 7700序列檢測器根據(jù)廠家的推薦進(jìn)行所有反應(yīng)。
RT-PCR引物序列(所有引物擴(kuò)增每個(gè)基因的3′UTR的片段)ss.Pirh2-1290F-TCCTCTAAATGTGAATTTTGATGTAA(SEQ ID NO19)ss.Pirh2-1463R-TCCCAACTACTTTTATGGAATACCT(SEQ ID NO20)ss.Pirh2-1359T-TTTTCCAAAGTTTTCTATGTTTGGCTCAATTAGG(SEQ ID NO21)p21WAF1-1866F-GTGCTTAGTGTACTTGGAGTATTGG(SEQ ID NO22)p21WAF1-1939R-AGTCCAGGCCAGTATGTTACAG(SEQ ID NO23)p21WAF1-1893T-TCTGACCCCAAACACCTTCCAGC(SEQ ID NO24)b-actin-1312F-AAAACTGGAACGGTGAAGGT(SEQ ID NO25)b-actin-1380R-CGGCCACATTGTGAACTT(SEQ ID NO26)b-actin-1356T-ATGCTCGCTCCAACCGACTGC(SEQ ID NO27)hCOP-2362F-CCTTTGGGACATTGGGAAT(SEQ ID NO28)hCOP-2436R-CCACCAAGAGCAGCAATGT(SEQ ID NO29)hCOP-2382T-CCCAGCCAACTCTCCACCATCAA(SEQ ID NO30)RPL19序列DNA103410-432F AGCGGATTCTCATGGAACA(SEQ ID NO31)DNA103410-502R CTGGTCAGCCAGGAGCTT(SEQ ID NO32)DNA103410-453T TCCACAAGCTGAAGGCAGACAAGG(SEQ ID NO33)在TLB(0.5％NP40、20mM Tris pH7.5、5mM EDTA、蛋白酶抑制物混合物(Roche))中收獲組織，繼之以勻漿。在進(jìn)行SDS-PAGE和western印跡分析之前通過在20,000×g離心60分鐘來澄清溶胞產(chǎn)物。用針對(duì)COP1、p53(DO-1和1801，Santa Cruz Biotechnology)和肌動(dòng)蛋白(ICN)的抗體對(duì)膜進(jìn)行探查。
COP1和p53的免疫組織化學(xué)收集組織，在10％中性緩沖液的福爾馬林中固定，并包埋入石蠟。將玻璃載片上的5μ切片脫蠟并在蒸餾水中水化。對(duì)于p53染色，在99℃在Dako Target Retrieval(Dako，S1700)溶液中將載玻片孵育20分鐘，然后在TBST中漂清載玻片。使用KPL封閉緩沖液(KPL，37-00-84)和Vector抗生物素蛋白/生物素試劑盒(Vector，SP2001)使內(nèi)源的過氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素淬滅，隨后是TBST漂清。在3％BSA/PBS的10％正常馬血清中孵育載玻片30分鐘。然后在室溫在5μg/ml抗-p53抗體(NovusBiologicals，NB200-104)中孵育載玻片60分鐘。在TBST中洗滌之后，在室溫用2.5μg/ml生物素化的馬抗小鼠第二抗體(Vector，BA2001)孵育載玻片30分鐘。用TBST洗滌之后，在室溫用Vectastain ABC Elite試劑(Vector，PK6100)孵育載玻片30分鐘。然后用TBST漂清載玻片，用Pierce MetalEnhanced DAB孵育四分鐘，在水中漂洗。然后載玻片用Mayer’s蘇木素復(fù)染，脫水，封固并蓋上玻片，用于明視野觀察。對(duì)于COP1染色，在99℃在Dako Target Retrieval High pH溶液(Dako，S3308)中孵育載玻片20分鐘，然后載玻片在TBST中漂洗。使用KPL封閉試劑和Vector抗生物素蛋白/生物素試劑盒淬滅內(nèi)源的過氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素，隨后TBST漂清。在3％BSA/PBS的10％正常馬血清中孵育載玻片30分鐘。然后在室溫在1μg/ml抗-COP1(克隆1D5)抗體中孵育載玻片60分鐘。在TBST中洗滌之后，在室溫用2.5μg/ml生物素化的馬抗小鼠第二抗體孵育載玻片30分鐘。在TBST洗滌之后，在室溫用Vectastain ABC Elite試劑孵育載玻片30分鐘。然后在biotinyl tyramide試劑(Perkin Elmer，NEL700)中孵育載玻片3分鐘，隨后TBST洗滌，然后用Vectastain ABC Elite試劑孵育30分鐘。在TBST洗滌之后，用Pierce Metal Enhanced DAB孵育載玻片四分鐘，在水中漂清，用Mayer’s蘇木素復(fù)染，脫水，封固并蓋上玻片。
實(shí)施例2p53是COP1的底物為了獲得COP1如何調(diào)節(jié)細(xì)胞過程的了解，使來自穩(wěn)定表達(dá)FLAG標(biāo)記的COP1或空載體的U2-OS細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物經(jīng)歷與抗-FLAG的免疫沉淀，通過FLAG肽洗脫結(jié)合的蛋白，通過SDS-PAGE分析，通過質(zhì)譜法測序特定的條帶(附圖1A)。大約53kDa處的條帶的質(zhì)譜分析顯示了來自腫瘤抑制物蛋白p53的5個(gè)匹配肽。為了確認(rèn)這種相互作用是真實(shí)的，無p53的Soas-2細(xì)胞用p53和Myc-COP1轉(zhuǎn)染，用抗-p53(DO-1)免疫沉淀，用抗-Myc免疫印跡(附圖1B)。COP1僅在存在轉(zhuǎn)染的p53的情況下被免疫沉淀，從而表明COP1可以與p53相互作用。還用轉(zhuǎn)染的COP1和內(nèi)源的p53觀察到這種相互作用(附圖1C)。此外，在U2-OS細(xì)胞中在p53和COP1之間在內(nèi)源蛋白水平存在相互作用(附圖1D)。體外翻譯的血凝素(HA)-COP1能夠在體外與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-p53相互作用(附圖1E)。
通過用穩(wěn)定量的p53和增加量的FLAG-COP1或缺少RING指結(jié)構(gòu)域的COP1突變體FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)染，來評(píng)定COP1影響p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平潛力。COP1的轉(zhuǎn)染引起外源p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平的降低，其隨RING指結(jié)構(gòu)域的刪除被取消(附圖2A)。為了評(píng)定COP1是否影響內(nèi)源p53的穩(wěn)態(tài)水平，用FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞(附圖2B)。與在外源p53的情況下一樣，COP1能夠降低內(nèi)源p53的穩(wěn)態(tài)水平，其取決于COP1的RING指結(jié)構(gòu)域。
為了獲得對(duì)p53蛋白水平中這種降低機(jī)制的進(jìn)一步的了解，對(duì)p53基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來確定COP1是否抑制p53基因轉(zhuǎn)錄(附圖2C)。在U2-OS細(xì)胞中Flag-COP1或Flag-COP1ΔRING的轉(zhuǎn)染沒有引起p53信使RNA水平的顯著的變化。然而，使用脈沖追蹤分析，在人類胚腎HEK293T細(xì)胞中COP1的轉(zhuǎn)染顯示了相對(duì)于空的載體對(duì)照p53半衰期的明顯降低，表明COP1主動(dòng)地提高p53的翻轉(zhuǎn)(turnover)。假定p53的半衰期由于COP1過量表達(dá)顯著地縮短，并且這與p53mRNA影響或?qū)DM2蛋白水平的任何直接影響無關(guān)，那么這種效果可能是翻譯后的。
為了測試這種假說，用FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，并用DMSO或蛋白酶體抑制物ALLN處理(附圖2E)。ALLN的添加顯著地提高了p53蛋白的水平，這早先已由Flag-COP1的轉(zhuǎn)染降低，表明COP1指導(dǎo)了p53的蛋白酶體介導(dǎo)的降解。
為了確定p53經(jīng)由蛋白酶體的COP1介導(dǎo)的降解是否是p53遍在化的結(jié)果，用p53、FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING和HA-遍在蛋白轉(zhuǎn)染H1299或Saos-2細(xì)胞(附圖2F)。用抗-HA免疫沉淀和用抗-p53免疫印跡揭示了p53的遍在化的種類僅與FLAG-COP1的共轉(zhuǎn)染存在。這些數(shù)據(jù)表明COP1靶向p53，通過遍在化經(jīng)由蛋白酶體降解。
為了確定COP1是否通過MDM2或Pirh2起作用來調(diào)節(jié)p53降解，在p53-/-/MDM2-/-小鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)中或在通過siRNA耗盡Pirh2的Saos-2細(xì)胞中進(jìn)行p53和COP1或COP1ΔRING的短暫轉(zhuǎn)染，并評(píng)定它們影響p53穩(wěn)態(tài)水平的能力(附圖2J，K)。基本上，COP1能夠解釋在含MDM2和Pirh2的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的p53的負(fù)調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明COP1在調(diào)節(jié)p53時(shí)可以獨(dú)立于MDM2起作用。
由于COP1在體內(nèi)調(diào)節(jié)p53的遍在化(附圖2F)，我們希望確定在體外p53是否是COP1的直接底物。在大腸桿菌中表達(dá)GST和GST-COP1，并純化，隨后用于使用體外翻譯的p53進(jìn)行遍在化分析(附圖2G)。只有存在所有的反應(yīng)成分和p53時(shí)COP1才能直接遍在化p53。因此，這些數(shù)據(jù)表明COP1充當(dāng)了p53的E3連接酶。
實(shí)施例3為了確定COP1過量表達(dá)對(duì)p53依賴性反式激活的影響，用p53和COP1或COP1ΔRING，和p21-熒光素酶(Luc)或bax-Luc轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞(附圖2H，L)。添加COP1顯著地降低p53從p21和bax啟動(dòng)子反式激活的能力。此外，內(nèi)源p53的反式激活能力，以及由DNA損傷誘導(dǎo)的能力，通過COP1的過量表達(dá)以相同的方式被消除(附圖2M)。為了進(jìn)一步評(píng)定COP1負(fù)調(diào)節(jié)p53的能力，我們確定了COP1是否能在Saos-2細(xì)胞中抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(附圖21)。p53的轉(zhuǎn)染顯著地提高SubG1群體中的細(xì)胞群體，盡管如此，這被COP1的共轉(zhuǎn)染顯著地抑制，表明COP1抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。單獨(dú)的COP1轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期分布沒有深刻的影響。
為了揭示COP1在更多生理情況下的作用，使內(nèi)源COP1經(jīng)歷通過siRNA的消除(ablation)，評(píng)定對(duì)內(nèi)源p53穩(wěn)態(tài)水平的任何影響(附圖3A)。通過實(shí)時(shí)PCR和免疫印跡來評(píng)定COP1的敲除。在U2-OS細(xì)胞中通過siRNA缺失(delete)COP1引起p53蛋白的顯著積累。這些結(jié)果是可以用兩種進(jìn)一步的獨(dú)立的siRNA寡核苷酸(附圖3D)重現(xiàn)，表明COP1在未應(yīng)激的細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)p53。根據(jù)這種p53蛋白水平的顯著積累，我們接下來確定了p53是否可以誘導(dǎo)它的下游目標(biāo)基因，p21和Pirh2。使用實(shí)時(shí)PCR，我們觀察了響應(yīng)于COP1消除的p21和Pirh2mRNA的顯著提高，表明了p53依賴性轉(zhuǎn)錄的提高。此外，通過導(dǎo)入COP1siRNA，總p21蛋白水平顯著地提高。相比之下，COP1siRNA寡核苷酸向p53-null細(xì)胞系H1299中的轉(zhuǎn)染對(duì)p21蛋白或?qū)21和Pirh2mRNA水平?jīng)]有影響。此外，在U2-OS細(xì)胞中COP1的缺失引起G1/S比例的顯著的提高(1.82到3.71)，但在H1299細(xì)胞中未能具有任何影響(附圖3C)表明G1延滯以p53依賴性方式發(fā)生。
為了確認(rèn)在未應(yīng)激的細(xì)胞中COP1介導(dǎo)p53翻轉(zhuǎn)，在缺失COP1的U2-OS細(xì)胞中進(jìn)行脈沖追蹤分析(附圖4A)。相對(duì)于對(duì)照物，COP1蛋白的消除提高了p53的半衰期2倍。還通過siRNA消除了Pirh2和MDM2，用于脈沖追蹤分析和與COP1比較。相比對(duì)照物，Pirh2的缺失提高了p53的半衰期1.5倍，而MDM2消除提高了p53的半衰期2倍。將COP1置于MDM2和Pirh2的環(huán)境中，通過siRNA的COP1和Pirh2的共消除引起p53半衰期的進(jìn)一步提高，超過對(duì)照3.5倍。令人驚訝地，COP1和MDM2一同消除引起了對(duì)p53半衰期的協(xié)同作用，使其延長8倍。通過同時(shí)的Pirh2消除沒有進(jìn)一步延長所述半衰期，表明p53的半衰期在這個(gè)特定系統(tǒng)中已經(jīng)達(dá)到了最大值。進(jìn)行報(bào)告物分析來測量p53的反式激活功能(附圖4B)。與p53的半衰期方面的提高相符，在COP1、Pirh2或MDM2的消除時(shí)，存在p21啟動(dòng)子的反式激活的中度提高，伴隨來源于MDM2的消除的最高刺激。在蛋白水平也證實(shí)了這些觀察結(jié)果(附圖4C)。響應(yīng)于COP1和MDM2的共消除，還存在著來自p21啟動(dòng)子的顯著刺激和蛋白水平方面的提高(附圖4A，B)。值得注意的是，響應(yīng)于所有E3連接酶的消除，p53或p21蛋白水平(附圖4C)，或啟動(dòng)子活性(附圖4B)沒有進(jìn)一步增強(qiáng)，表明增生細(xì)胞可能具有p21和/或p53的有限閾值。此外，COP1、Pirh2或MDM2的消除引起正常BJ成纖維細(xì)胞中p53和p21穩(wěn)態(tài)水平的提高，表明每種連接酶在正常細(xì)胞中在負(fù)調(diào)節(jié)p53方面具有作用(附圖4D)。
根據(jù)COP1和MDM2的消除引起p53反應(yīng)的觀察結(jié)果，我們測試了COP1和/或MDM2的缺失是否在U2-OS細(xì)胞中恢復(fù)正常的DNA-損傷反應(yīng)，因?yàn)橐阎鼈儗?duì)電離輻射(IR)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是高度抗性的31。用針對(duì)COP1和/或MDM2的siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，隨后用20Gy IR處理，通過碘化丙錠染色評(píng)估細(xì)胞死亡(附圖4E)。用對(duì)照siRNA預(yù)先處理的U2-OS細(xì)胞在用IR處理后對(duì)細(xì)胞死亡是高度抗性的；然而，用COP1或MDM2siRNA預(yù)先處理的細(xì)胞產(chǎn)生了對(duì)IR誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感的細(xì)胞亞群。更顯著地，通過siRNA的COP1和MDM2的同時(shí)消除引起了對(duì)IR的細(xì)胞死亡的協(xié)同致敏。
COP1是參與負(fù)反饋環(huán)路的p53可誘導(dǎo)的基因假定MDM2和Pirh2形成自動(dòng)調(diào)節(jié)的反饋環(huán)路，我們研究了COP1也是這種調(diào)節(jié)機(jī)制的部分的可能性。掃描COP1基因的啟動(dòng)子區(qū)域揭示了，相對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)從-2094到-2073的p53共有結(jié)合位點(diǎn)32的存在(附圖5A)。將這個(gè)共有位點(diǎn)(COP1-Luc)或這個(gè)共有位點(diǎn)版本的突變體(COP1mut-Luc)的兩個(gè)拷貝插入到含有最小啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因的上游，并轉(zhuǎn)染到具有pcDNA3.1+，p53或DNA結(jié)合突變體p53R175H的H1299細(xì)胞中(附圖5B)。p53的轉(zhuǎn)染提高了COP1-Luc的熒光素酶活性，但COP1mut-Luc報(bào)告物構(gòu)建體沒有，而p53R175H突變體未能對(duì)COP1-Luc或COP1mut-Luc具有任何深刻的影響。此外，同實(shí)時(shí)PCR評(píng)定的，p53的轉(zhuǎn)染實(shí)質(zhì)上提高了H1299細(xì)胞內(nèi)的COP1mRNA水平(附圖5C)。還通過用抗-COP1的western印跡檢測了總COP1蛋白方面的提高(附圖5D)。此外，用IR處理的U2-OS細(xì)胞，其活化了p53依賴性轉(zhuǎn)錄并穩(wěn)定了p53，引起了相對(duì)未處理細(xì)胞的COP1蛋白水平的提高(附圖5E)。作為對(duì)照，還通過免疫印跡評(píng)定了p21和p53蛋白水平來證實(shí)IR損害引發(fā)了p53反應(yīng)。結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)表明，COP1是參與負(fù)反饋環(huán)路的p53可誘導(dǎo)的基因。
COP1在癌細(xì)胞中過量表達(dá)通過實(shí)時(shí)PCR和原位雜交(ISH)技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織中檢查COP1表達(dá)。我們通過ISH(附圖6A)、RT-PCR(附圖6B)和Northern印跡(附圖6C)在正常的鼠組織中進(jìn)行了表達(dá)分析。ISH分析表明，cop1在正常的鼠骨骼肌、腸和睪丸中表達(dá)。在睪丸中，在賴氏細(xì)胞(Leydig cells)中顯著的表達(dá)是明顯的，在生殖細(xì)胞中也存在中度的信號(hào)(附圖6A)。Northern印跡畫面證實(shí)了cop1在睪丸以及心臟、肝臟和腎臟中表達(dá)(附圖6C)。cDNA畫面RT-PCR也表明，cop1在腦、胃、小腸、胰腺、腎上腺、子宮和前列腺中表達(dá)。RT-PCR和Northern印跡畫面對(duì)于全長cop1mRNA表達(dá)的組織分布是良好符合的。除了鼠組織之外，我們通過ISH評(píng)估了人類組織并在正常人扁桃體、脾、睪丸、胰腺和結(jié)腸中鑒定了cop1表達(dá)。這與之前的發(fā)現(xiàn)是一致的，之前的發(fā)現(xiàn)通過Northern印跡顯示了在正常人睪丸、胸腺、結(jié)腸、心臟、前列腺、脾、腸和肝臟中顯著的cop1表達(dá)。36為了確定COP1基因表達(dá)在癌癥中是否改變，從各種正常組織和腫瘤樣品收獲了總RNA，通過實(shí)時(shí)PCR和針對(duì)RPL19mRNA來標(biāo)準(zhǔn)化測定了相對(duì)cop1表達(dá)。存在著cop1mRNA相對(duì)正常對(duì)照的2-8倍顯著提高(附圖7A)。因而，我們在由67個(gè)卵巢腺癌病例的0.6mm核心組成的卵巢組織微陣列(TMA)上使用ISH的cop1特異性探針一式三份進(jìn)行了大量的研究。漿液腺癌的30％(8/27)病例顯示了僅在惡性細(xì)胞內(nèi)的陽性信號(hào)，而在基質(zhì)區(qū)室中(附圖7B)或正常卵巢組織中沒有觀察到信號(hào)。此外，子宮內(nèi)膜腺癌(Endometrioid adenocarcinoma)的16％(3/19)病例和明細(xì)胞腺癌(clear celladenocarcinoma)的27％(3/11)病例顯示了編碼COP1的mRNA的陽性信號(hào)(表1)。
表1組織微陣列上卵巢腺癌病例的概述。通過ISH和IHC展現(xiàn)了COP1表達(dá)。
為了證實(shí)在蛋白水平上COP1在這些腫瘤中過量表達(dá)，對(duì)如上所述的相同卵巢TMA以及附圖7A中用于RT-PCR的卵巢樣品進(jìn)行使用針對(duì)COP1的特異性抗體的IHC分析。TMA的結(jié)果在表1中概述，顯示了47％(11/27)的漿液腺癌、63％(12/19)的子宮內(nèi)膜腺癌、36％(4/11)的明細(xì)胞腺癌和50％(5/10)的粘蛋白腺癌顯示了在惡性細(xì)胞的核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)室內(nèi)的強(qiáng)的COP1免疫反應(yīng)性；然而，在基質(zhì)內(nèi)沒有檢測到信號(hào)(附圖7C)。此外，正常組織對(duì)于與COP1抗體的任何反應(yīng)性是陰性的?？偲饋碚f，這些數(shù)據(jù)表明了COP1mRNA和蛋白質(zhì)在惡性細(xì)胞中特異性地過量表達(dá)。存在著ISH和IHC數(shù)據(jù)的良好擬合(表1)；相對(duì)于ISH數(shù)據(jù)，根據(jù)IHC子宮內(nèi)膜和粘蛋白腺癌顯示了更高百分比的COP1陽性樣品，提示了COP1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
接下來我們希望確定過量表達(dá)COP1的任何腫瘤樣品是否帶有p53依賴性反應(yīng)中的缺陷。為了解決這個(gè)問題，我們使用針對(duì)p53目標(biāo)基因和cyclin-依賴性激酶抑制物p21/WAF1的特異性探針對(duì)過量表達(dá)COP1卵巢腫瘤進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR(附圖7A)，通過與正常對(duì)照樣品比較，評(píng)定了mRNA中的倍數(shù)變化。相對(duì)于匹配的正常對(duì)照，過量表達(dá)COP1的大多數(shù)樣品顯示p21mRNA顯著降低(附圖7D)。這些結(jié)果與COP1負(fù)調(diào)節(jié)p53活化p21轉(zhuǎn)錄的能力相一致。
假定在卵巢癌癥中p53可能是突變的，那么確定這些樣品中的p53基因狀態(tài)是重要的，因?yàn)閜53的特定突變體喪失了它們從p21啟動(dòng)子反式激活的天生能力。例如，如果在COP1過量表達(dá)的樣品中p53被突變，則觀察到的p21mRNA的減量調(diào)節(jié)可能獨(dú)立于p53。因此，我們對(duì)經(jīng)常鑒定出p53突變的外顯子5-8以及內(nèi)含子-外顯子邊界進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)這些樣品的7/8是野生型的，1/8具有R249S突變，其位于p53DNA結(jié)合區(qū)中并顯示使正常的乳腺上皮細(xì)胞永生。37此外，R249S突變卵巢樣品(編號(hào)8)具有正常水平的p21mRNA，與通過COP1的野生型p53依賴性轉(zhuǎn)錄的抑制相符。
使用COP1特異性抗體，在具有1mm核心上排列的32例乳腺腺癌的TMA上進(jìn)行了IHC。引人注目地，81％(25/32)的病例顯示了在惡性細(xì)胞中專有的、而在基質(zhì)或正常的上皮細(xì)胞內(nèi)沒有的與COP1抗體的強(qiáng)免疫反應(yīng)性(附圖8A和8B)。使用不受蛋白質(zhì)磷酸化影響的1801p53-特異性抗體的IHC分析38揭示了僅3/32例具有陽性信號(hào)(附圖8E和8F)。相比之下，COP1陽性的大多數(shù)病例是p53陰性的(附圖83C和8D)。假定除非被DNA破壞劑或基因突變穩(wěn)定化，通過IHC難以在組織中檢測p53，對(duì)來自乳腺TMA的p53基因進(jìn)行測序來確定這些特定的樣品實(shí)際上是突變的p53(附圖8G)。在三個(gè)病例的每一個(gè)中鑒定的突變引起如下的氨基酸替換C242F、P278S和R175H。
為了更為定量地比較乳腺癌樣品中p53和COP1的蛋白水平，我們進(jìn)行了腫瘤溶胞產(chǎn)物的Western印跡分析(附圖9A、B)。用抗COP1的免疫印跡揭示了正常乳腺組織(樣品N)中非常弱的信號(hào)，但在67％(10/15)的病例中檢測到COP1的顯著提高，證實(shí)了使用乳腺TMA的早先的觀測(附圖8A和8B)，COP1在乳腺腺癌中實(shí)際上過量表達(dá)。與正常的乳腺組織相比時(shí)，在53％(8/15)的病例中p53水平降低，但在20％(3/15)的病例中顯著地提高。
為了進(jìn)一步闡明COP1過量表達(dá)對(duì)p53的重要性，必需確定這些樣品中的p53基因狀態(tài)。因此，外顯子5-8被測序并分析了在內(nèi)含子-外顯子邊界處的突變以及外顯子的突變。27％(4/16)的病例帶有外顯子8內(nèi)的突變(附圖9B)樣品T6和T12含有R290H突變，而樣品T7和T10帶有R273H突變。當(dāng)在乳腺腫瘤中過量表達(dá)COP1時(shí)，所述乳腺腫瘤表現(xiàn)出75％(6/8)的病例野生型p53水平被顯著降低，p53的穩(wěn)態(tài)蛋白水平被顯著地降低，COP1被過量表達(dá)。僅25％(2/8)的病例顯示p53水平的降低。當(dāng)觀察到COP1過量表達(dá)并且p53水平?jīng)]有伴隨的降低時(shí)，p53基因狀態(tài)是突變的，從而表明COP1具有負(fù)調(diào)節(jié)野生型p53的能力。
結(jié)果表明，至少45％的卵巢腺癌和80％的乳腺腺癌具有強(qiáng)的COP1過量表達(dá)，在含有野生型p53和過量表達(dá)COP1的某些樣品中、但不在含有突變p53和過量表達(dá)的COP1的樣品中，可以看到p53功能或穩(wěn)態(tài)蛋白水平中的缺陷(附圖7A-D和9A-B)。在含有野生型p53的癌癥中主要地而不是專有地檢測到COP1的過量表達(dá)，表明COP1的主要作用之一是抑制p53依賴性腫瘤抑制。
在各種癌癥中COP1和p53水平的檢查產(chǎn)生以下結(jié)果對(duì)于結(jié)腸腺癌，12/38病例是p53陽性的，12個(gè)p53陽性病例中的5個(gè)也是COP1陽性的，8例是COP1陽性p53陰性；對(duì)于乳腺腺癌，3/32例是p53陽性，根據(jù)IHC，3例p53陽性病例的2例也是COP1陽性的，23/32例是COP1樣品p53陰性；對(duì)于移行細(xì)胞癌(transitional cell carcinoma)(腎臟、前列腺、膀胱)，3/3例是p53和COP1陽性的；對(duì)于肺部腺癌，1/3是p53和COP1陽性的；對(duì)于淋巴瘤，1/3是p53和COP1陽性的；對(duì)于卵巢腺癌，32/67是COP1陽性的，亞型COP1陽性如下漿液腺癌11/27；子宮內(nèi)膜腺癌12/19；明細(xì)胞腺癌4/11；粘蛋白腺癌5/10。
因此，COP1在許多癌癥中過量表達(dá)，包括乳腺癌、卵巢癌癥等等，這伴隨著野生型p53穩(wěn)態(tài)蛋白水平或p53依賴性轉(zhuǎn)錄方面的下降。我們還在卵巢、血清、子宮內(nèi)膜腺癌和粘蛋白腺癌的一些病例中通過IHC檢測了COP1，通過ISH在mRNA水平?jīng)]有觀察到可檢測信號(hào)，表明COP1蛋白的穩(wěn)態(tài)水平方面的提高也可以在翻譯后水平發(fā)生而不是提高轉(zhuǎn)錄。
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權(quán)利要求
1.一種在受試者中診斷癌癥的方法，所述方法包括檢測來自所述受試者的癌癥的樣品中的COP1分子，其中所述COP1分子相對(duì)于對(duì)照的過量表達(dá)是癌癥的指示。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括檢測所述樣品中的p53分子，其中p53表達(dá)水平的降低或p53活性的抑制是癌癥的指示。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述p53分子是野生型的。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述p53分子是人類p53分子。
5.權(quán)利要求2到4的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53分子是p53多肽。
6.權(quán)利要求5的方法，其中使用特異性結(jié)合所述p53多肽的抗體來檢測所述p53多肽。
7.權(quán)利要求5的方法，其中使用免疫組織化學(xué)來檢測所述p53多肽。
8.權(quán)利要求2到7的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53活性選自下組中的至少之一p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
9.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是人類COP1。
10.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是COP1多肽。
11.權(quán)利要求10的方法，其中使用特異性結(jié)合所述COP1多肽的抗體來檢測所述COP1多肽。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中使用免疫組織化學(xué)來檢測所述COP1多肽。
13.權(quán)利要求1到10的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是COP1mRNA。
14.權(quán)利要求13的方法，其中使用原位雜交來檢測所述COP1 mRNA。
15.權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括檢測所述樣品中的p21分子，其中p21表達(dá)水平的降低是癌癥的指示。
16.權(quán)利要求1到15的任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人類。
17.權(quán)利要求1到16的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是表達(dá)野生型p53的癌癥。
18.權(quán)利要求1到17的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥選自下組中的至少之一乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和移行細(xì)胞癌。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述卵巢癌選自下組中的至少之一漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌和粘蛋白腺癌。
20.一種在受試者中監(jiān)視癌癥治療的效力的方法，所述方法包括提供來自所述受試者的樣品；和檢測所述樣品中的COP1分子，其中相對(duì)于對(duì)照所述COP1分子的過量表達(dá)方面的降低表明癌癥治療是有效的。
21.一種評(píng)定患有癌癥的受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括提供來自所述受試者的樣品；和檢測所述樣品中的COP1分子，其中所述COP1分子相對(duì)于對(duì)照的過量表達(dá)方面的降低表明改善的預(yù)后。
22.權(quán)利要求20或21的方法，進(jìn)一步包括檢測所述樣品中的p53分子，其中p53表達(dá)水平的提高或p53活性的提高是有效的癌癥治療或改善的預(yù)后的指示。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述p53分子是野生型的。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述p53分子是人類p53分子。
25.權(quán)利要求22到24的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53分子是p53多肽。
26.權(quán)利要求25的方法，其中使用特異性結(jié)合所述p53多肽的抗體來檢測所述p53多肽。
27.權(quán)利要求25的方法，其中使用免疫組織化學(xué)來檢測所述p53多肽。
28.權(quán)利要求22到27的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53活性選自下組中的至少之一p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
29.權(quán)利要求20到28的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是人類COP1。
30.權(quán)利要求20到29的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是COP1多肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中使用特異性結(jié)合所述COP1多肽的抗體來檢測所述COP1多肽。
32.權(quán)利要求30或31的方法，其中使用免疫組織化學(xué)來檢測所述COP1多肽。
33.權(quán)利要求20到29的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是COP1mRNA。
34.權(quán)利要求33的方法，其中使用原位雜交來檢測所述COP1 mRNA。
35.權(quán)利要求20到34的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括檢測所述樣品中的p21分子，其中p21表達(dá)水平的降低是癌癥的指示。
36.權(quán)利要求20到35的任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人類。
37.權(quán)利要求20到36的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是表達(dá)野生型p53的癌癥。
38.權(quán)利要求20到37的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥選自下組中的至少之一乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和移行細(xì)胞癌。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述卵巢癌選自下組中的至少之一漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌和粘蛋白腺癌。
40.一種在診斷為患有癌癥或存在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者中治療癌癥的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的抑制COP1的表達(dá)的第一化合物。
41.權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包括向所述受試者施用治療有效量的抑制MDM2或Pirh2表達(dá)的第二化合物。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中所述第一或第二化合物選自下組中的至少之一反義寡核苷酸、形成三鏈的寡核苷酸和siRNA分子。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述第一或第二化合物使所述癌癥對(duì)癌癥治療敏感。
44.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括施用所述癌癥治療。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述第一或第二化合物在所述癌癥治療之前施用。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述第一或第二化合物在所述癌癥治療期間施用。
47.權(quán)利要求43到46的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥治療包括放射治療或化學(xué)治療。
48.權(quán)利要求40到47的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是表達(dá)野生型p53的癌癥。
49.權(quán)利要求40到48的任一項(xiàng)的方法，其中與對(duì)照相比在所述癌癥中COP1過量表達(dá)。
50.權(quán)利要求40到49的任一項(xiàng)的方法，其中與對(duì)照相比在所述癌癥中p53表達(dá)水平降低。
51.權(quán)利要求40到50的任一項(xiàng)的方法，其中與對(duì)照相比在所述癌癥中p21表達(dá)水平降低。
52.權(quán)利要求40到51的任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人類。
53.一種篩選干擾COP1分子與p53分子的結(jié)合的測試化合物的方法，所述方法包括a)在容器中提供第一多肽、第二多肽和測試化合物，所述測試化合物是要檢測它干擾所述第一和第二多肽的結(jié)合的能力的化合物；和b)測定與所述第二多肽結(jié)合的所述第一多肽的量、從所述第二多肽上被替換下來的所述第一多肽的量或被阻止與所述第二多肽結(jié)合的所述第一多肽的量；其中所述第一多肽是COP1多肽和所述第二多肽是p53多肽，或者其中所述第一多肽是p53多肽和所述第二多肽是COP1多肽；和其中降低與所述第二多肽結(jié)合的所述第一多肽的量的化合物、或替換結(jié)合到所述第二多肽上的所述第一多肽的化合物、或阻止所述第一多肽與所述第二多肽結(jié)合的化合物，被鑒定為干擾COP1分子與p53分子結(jié)合的化合物。
54.權(quán)利要求53的方法，進(jìn)一步包括確定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)COP1活性。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述COP1活性選自下組中的至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
56.權(quán)利要求53到55的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1分子是人類COP1。
57.權(quán)利要求53到56的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是人類p53。
58.一種篩選干擾COP1分子與p53分子的結(jié)合的測試化合物的方法，所述方法包括a)提供第一核酸分子、第二核酸分子、第三核酸分子和測試化合物，所述第一核酸分子包含與編碼第一多肽的核酸分子可操作連接的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二核酸分子包含與編碼第二多肽的核酸分子可操作連接的反式激活結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子包含與能由所述序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列可操作連接的報(bào)告基因，所述測試化合物是要檢測它在細(xì)胞中干擾所述第一和第二多肽結(jié)合的能力的化合物，其中所述第一多肽是COP1多肽和所述第二多肽是p53多肽，或者所述第一多肽是p53多肽和所述第二多肽是COP1多肽；和b)測定所述報(bào)告基因的表達(dá)水平，其中降低所述報(bào)告基因的表達(dá)的化合物是干擾COP1分子與p53分子的結(jié)合的化合物。
59.權(quán)利要求58的方法，進(jìn)一步包括確定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)COP1活性。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述COP1活性選自下組中的至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
61.權(quán)利要求58到60的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1是人類COP1。
62.權(quán)利要求58到61的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是人類p53。
63.一種篩選抑制p53的活性的測試化合物的方法，包括用與COP1結(jié)合的測試化合物處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞、并檢測所述處理的細(xì)胞中的p53的步驟。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述檢測步驟包括測量選自下組中的至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
65.權(quán)利要求63或64的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來表達(dá)COP1。
66.權(quán)利要求63到65的任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來表達(dá)p53。
67.權(quán)利要求63到66的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1是人類COP1。
68.權(quán)利要求63到67的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是人類p53。
69.抑制COP1分子表達(dá)或抑制COP1連接酶活性的化合物用于藥物的制備的用途，所述藥物用于在診斷為患有癌癥或存在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者中治療癌癥。
70.權(quán)利要求69的用途，其中所述癌癥相對(duì)于對(duì)照具有COP1分子的過量表達(dá)。
71.權(quán)利要求69或70的用途，其中所述癌癥相對(duì)于對(duì)照具有在癌癥中p53活性的降低。
72.權(quán)利要求69到71的任一項(xiàng)的用途，其中所述癌癥相對(duì)于對(duì)照具有在癌癥中p53水平的降低。
73.權(quán)利要求69到72的任一項(xiàng)的用途，其中所述癌癥具有相對(duì)于對(duì)照物在癌癥中p21水平的降低。
74.權(quán)利要求69到73的任一項(xiàng)的用途，其中在所述癌癥中表達(dá)野生型p53。
75.權(quán)利要求69到74的任一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是靶向COP1的RNAi。
76.權(quán)利要求69到74的任一項(xiàng)的用途，還包括使用抑制MDM2或Pirh2的表達(dá)的化合物。
77.權(quán)利要求69到76的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1是人類COP1。
78.權(quán)利要求69到77的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是人類p53。
79.權(quán)利要求69到78的任一項(xiàng)的方法，其中所述MDM2是人類MDM2。
80.權(quán)利要求69到79的任一項(xiàng)的方法，其中所述Pirh2是人類Pirh2。
81.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制p53的活性的方法，包括在細(xì)胞中過量表達(dá)COP1并檢測在過量表達(dá)COP1的所述細(xì)胞中所述p53的步驟。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述檢測步驟包括測量選自下組中的至少之一p53的降解、p53的遍在化、p53依賴性反式激活的抑制作用、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。
83.權(quán)利要求81或82的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來表達(dá)p53。
84.權(quán)利要求81到83的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是野生型p53。
85.權(quán)利要求81到84的任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來具有MDM2活性的降低的表達(dá)。
86.權(quán)利要求81到85的任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被工程化來具有Pirh2活性的降低的表達(dá)。
87.權(quán)利要求81到86的任一項(xiàng)的方法，其中所述COP1是人類COP1。
88.權(quán)利要求81到87的任一項(xiàng)的方法，其中所述p53是人類p53。
89.權(quán)利要求81到88的任一項(xiàng)的方法，其中所述MDM2是人類MDM2。
90.權(quán)利要求81到89的任一項(xiàng)的方法，其中所述Pirh2是人類Pirh2。
91.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包含編碼p53分子的重組核酸分子和編碼哺乳動(dòng)物COP1分子的重組核酸分子。
92.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已經(jīng)被工程化以具有降低的COP1活性和降低的MDM2活性。
93.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已經(jīng)被工程化以具有降低的COP1活性和降低的Pirh2活性。
94.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已經(jīng)被工程化以具有降低的COP1活性、降低的MDM2活性和降低的Pirn2活性。
95.上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)被進(jìn)一步工程化來表達(dá)p53。
96.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已經(jīng)被工程化以具有降低的MDM2活性、降低的Pirh2活性和提高的COP1活性。
97.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已經(jīng)被工程化以具有降低的p53活性以及提高或正常的COP1活性。
98.任何上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述活性通過RNAi的方法來降低。
99.任何上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中通過向所述細(xì)胞中導(dǎo)入編碼COP1分子的DNA分子來提高COP1活性。
100.一種細(xì)胞，其包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述第一核酸分子包含與編碼COP1多肽的核酸分子可操作連接的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二核酸分子包含與編碼p53多肽的核酸分子可操作連接的反式激活結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子包含與能由所述序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列可操作連接的報(bào)告基因。
101.一種細(xì)胞，其包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述第一核酸分子包含與編碼p53多肽的核酸分子可操作連接的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二核酸分子包含與編碼COP1多肽的核酸分子可操作連接的反式激活結(jié)構(gòu)域，所述第三核酸分子包含與能由所述序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列可操作連接的報(bào)告基因。
102.權(quán)利要求100或101的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述報(bào)告基因是熒光素酶。
103.任何上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于篩選干擾COP1分子與p53分子的結(jié)合的測試化合物的用途。
104.一種試劑盒，包含用于檢測樣品中COP1分子的試劑和包裝插頁，所述包裝插頁含有對(duì)在包含癌細(xì)胞的樣品中檢測COP1分子的說明。
105.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述癌細(xì)胞是表達(dá)野生型53的癌細(xì)胞。
106.權(quán)利要求104或105的試劑盒，其中所述癌癥選自下組中的至少之一乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和移行細(xì)胞癌。
107.權(quán)利要求104到106的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述卵巢癌選自下組中的至少之一漿液腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、明細(xì)胞腺癌和粘蛋白腺癌。
108.權(quán)利要求104到107的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包含用于檢測樣品中p53分子的試劑。
109.一種試劑盒，包含用于檢測樣品中COP1分子的試劑和用于檢測樣品中p53分子的試劑。
110.一種藥物組合物，包含抑制COP1的表達(dá)的化合物連同藥學(xué)上可接受的載體。
111.權(quán)利要求110的藥物組合物，進(jìn)一步包含抑制MDM2或Pirh2的表達(dá)的化合物連同藥學(xué)上可接受的載體。
112.權(quán)利要求110或111的藥物組合物，其中所述化合物選自下組中的至少之一反義寡核苷酸、形成三鏈寡核苷酸和siRNA分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了在各種癌癥中檢測COP1過量表達(dá)的診斷、預(yù)后和治療用途。所述方法和用途進(jìn)一步包括檢測p53表達(dá)。本發(fā)明還提供了用于篩選干擾COP1和p53結(jié)合的測試化合物的試劑和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101080638SQ200480044616
公開日2007年11月28日 申請日期2004年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者戴維·多南, 多蘿西·弗倫奇, 維什瓦·迪克西特 申請人:健泰科生物技術(shù)公司