專利名稱：一種用激光分選提取液相細胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是一種用激光分選提取液相細胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的細胞內(nèi)物質(zhì)分離方法主要有三種流式細胞儀(FACS)、玻璃微針法和激光彈射技術(shù)(LPC)。
流式細胞儀(FACS)分選效率高，廣泛用于大量細胞或細胞內(nèi)組分的分離與富集。但其樣品制備過程繁瑣，而且由于是在非目視狀態(tài)下分離，對分離對象有嚴格的要求。當被分選的細胞器大小的區(qū)別不夠明顯時，通過流式細胞儀得到的樣品純凈度較差，仍然含有幾種不同染色體的混合物。
玻璃微針法1981年Scanlenghe等最早采用玻璃微針挑出果蠅中期染色體鋪片中的單條染色體，目前已有應(yīng)用。但該方法操作難度大，對使用人員的實驗技能要求很高，因此效率低，不易推廣。特別是這種方法只能用于對鋪片染色體的分離與挑選，生物樣品已失去活性。
激光彈射技術(shù)(LPC)類似于玻璃微針挑取法。先進的激光彈射技術(shù)大大降低了對操作者實驗技能的要求，但同樣只能在干的鋪片上操作，存在影響生物組織活性的問題，而且要求專用樣品制備膜，價格昂貴，推廣應(yīng)用受到限制。
以上方法共同存在的缺點是，分選的樣品都是已經(jīng)從細胞中提取出來的細胞內(nèi)物質(zhì)，細胞的活性已經(jīng)受到干擾或失去活性。
本發(fā)明的目的在于解決上述問題，提出一種新的具有高選擇性，無損傷的液相中細胞內(nèi)物質(zhì)分選提取的方法，在保持細胞活性的情況下實現(xiàn)細胞內(nèi)物質(zhì)的實時分選，提取目標物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種用激光分選提取液相細胞內(nèi)物質(zhì)(以下簡稱細胞器)的技術(shù)，其特征是用兩束激光，即光刀(激光微束)和光鑷(光阱)對細胞或細胞器進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺在顯微鏡工作范圍內(nèi)實現(xiàn)微米精度操控，顯微操作分選過程由攝錄系統(tǒng)實時顯示于視屏上并記錄存儲。
具體分離方法是使待分離的細胞隨樣品載物臺移至光刀在視場中的作用位點，用光刀對細胞膜或結(jié)構(gòu)進行破壞，釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)。移動樣品載物臺，使被選中的目標細胞器隨樣品載物臺移至光鑷在視場中的光阱中心，細胞器被光鑷俘獲。再次移動樣品載物臺，周圍的雜質(zhì)及細胞殘骸隨樣品載物臺一起運動，而被光鑷俘獲的細胞器由于受到光阱的束縛而固定不動，實現(xiàn)目標細胞器與周邊環(huán)境的相對運動，用這種方法把該細胞器相對移動到一個比較空曠的視場中，遠離細胞碎片，與其它細胞或細胞殘骸的完全分離；最后用微吸管或微分選室，從樣品中提取被光鑷俘獲的目標細胞器，完成分選工作。
激光光鑷是20世紀80年代新發(fā)展起來的生命科學(xué)研究手段，主要用于在微米、亞微米尺度上對單個的細胞器，包括細胞、細胞器以及生物大分子進行顯微操作和研究，該方法一經(jīng)出現(xiàn)就在生命科學(xué)，基因工程，分散體系，大氣污染，微機械等領(lǐng)域得到應(yīng)用。本發(fā)明是綜合了光鑷和光刀的全光學(xué)生物微操作、微加工技術(shù)，在對微米、亞微米量級的細胞器進行顯微操作的同時進行精細的操控和加工，因為光刀切割的精確性(損傷范圍只有1微米，損傷位置可以精細調(diào)節(jié))，細胞器可以不受損傷，其形態(tài)依然保持完整，整個分離過程都在細胞器的液體生存環(huán)境中，并且通過光來完成，沒有直接接觸分選物，所以最大程度上避免了分選過程中可能發(fā)生的污染和其它意外。
本發(fā)明可直接從細胞中提取細胞內(nèi)物質(zhì)，實現(xiàn)單個目標細胞器的挑選與操控。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有樣品制備容易、分選效率高、自動化程度高、操作易掌握、無損傷以及操作尺度小(達亞微米量級)等優(yōu)點，本發(fā)明由于完全在液體環(huán)境中進行操作，操作條件溫和，可以保持細胞組分生物活性的條件下(例如對單條染色體的分選)分選其細胞組分。
附圖

圖1為本發(fā)明的裝置示意2為用本發(fā)明提取水稻單條染色體的過程示意圖參見圖1，在實施例中采用的倒置生物顯微鏡，使用100×物鏡，數(shù)值孔徑(是物鏡的一個參數(shù)，表征它的集光本領(lǐng))1.25。熒光經(jīng)M(M、M1、M2都是雙向分束鏡，對不同波長的光可產(chǎn)生反射或透射效應(yīng))反射進入顯微物鏡，光鑷光束經(jīng)過從M1透過，再由M2反射進入顯微物鏡，光刀光束被M3(全反鏡)反射，再經(jīng)過M1、M2耦合、從M透過進入顯微物鏡。這樣熒光光束、光鑷光束和光刀光束經(jīng)過反射和透射后合并成一束，經(jīng)過M進入物鏡并被聚焦后照射在樣品(樣品載物臺中間有通光孔，光可以從中透過)上，樣品載物臺通過計算機控制在顯微鏡工作范圍內(nèi)以微米精度運動。照明光由上至下照射樣品，通過顯微鏡物鏡在CCD(感光元件)上成像，CCD輸出的視頻信號送入錄像機進行記錄，同時在計算機屏幕上實時顯示并采集實驗中的動態(tài)圖象。
參見圖2圖2-1結(jié)構(gòu)完整的細胞器—染色體被包裹在細胞內(nèi)；圖2-2光刀精確作用于細胞，細胞壁局部穿孔、破裂，而細胞內(nèi)染色體物質(zhì)不受傷害；圖2-3細胞壁被光刀破壞，內(nèi)部的染色體開始散落到細胞外部。(由于細胞骨架的作用，染色體仍然相對集中)；圖2-4光鑷捕獲住染色體群中一個目標染色體，光鑷將其與染色體群及細胞碎片分離，并移至微吸管口；圖2-5微吸管(收集染色體所用的空心玻璃微吸管使用NARISHIGE公司產(chǎn)PP-830型拉制儀拉制，尖端直徑為2微米)接近被光鑷捕獲的染色體；圖2-6微吸管將染色體吸入管內(nèi)；圖2-7將吸取了染色體的微吸管從培養(yǎng)液中提出，完成整個分選過程。
權(quán)利要求
1.一種用激光分選提取液相細胞內(nèi)物質(zhì)(以下簡稱細胞器)的技術(shù)，其特征是用兩束激光，即光刀(激光微束)和光鑷(光阱)，對細胞或粒子進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺實現(xiàn)微米精度的操控，顯微操作分選過程由攝錄系統(tǒng)實時顯示于視屏上并記錄存儲。具體分離方法是使待分離的細胞器隨樣品載物臺移至光刀在視場中的作用位點上，用光刀對細胞膜或結(jié)構(gòu)進行破壞，釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)；移動樣品載物臺，使被選中的目標細胞器隨樣品載物臺移至光鑷在視場中的光阱中心，細胞器被光鑷俘獲。再次移動樣品載物臺，周圍的雜質(zhì)及細胞殘骸隨樣品載物臺一起運動，而被光鑷俘獲的細胞器由于受到光阱的束縛而固定不動，實現(xiàn)目標細胞器與周邊環(huán)境的相對運動，用這種方法把該細胞器相對移動到一個比較空曠的視場中，與其它細胞器或細胞殘骸的完全分離；最后用微吸管或微分選室，從樣品中提取被選中的目標細胞器，最終完成分選工作。
全文摘要
一種用激光分選提取液相細胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)，其特征是兩束激光，光刀(激光微束)和光鑷(光阱)，對細胞或細胞內(nèi)物質(zhì)進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺在顯微鏡工作范圍內(nèi)以微米精度移動，分別用光刀和切割細胞、光鑷俘獲目標細胞器，移動樣品載物臺使目標細胞器遠離雜質(zhì)或細胞殘骸，最后用微吸管或微分選室提取目標細胞器，最終使該細胞器與其它細胞器或細胞殘骸的完全分離。本發(fā)明可直接從細胞中提取細胞內(nèi)物質(zhì)，實現(xiàn)單個目標細胞器的挑選與操控。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有樣品制備容易、分選效率高、自動化程度高、操作易掌握、無損傷以及操作尺度小(達亞微米量級)等優(yōu)點，本發(fā)明由于完全在液體環(huán)境中進行操作，操作條件溫和，可以保持細胞組分生物活性的條件下(例如對單條染色體的分選)分選其它細胞組分。
文檔編號G01N21/66GK1438479SQ02160678
公開日2003年8月27日 申請日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者李銀妹, 王浩威, 樓立人 申請人:上海中科大光鑷科技有限公司