專利名稱：用于支睪吸蟲病、肺吸蟲病、豬囊尾蚴病和裂頭蚴病診斷的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織寄生蟲感染的血清學診斷。更具體地，本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫吸附測定(以下縮寫為ELISA)試劑盒，它能同時診斷華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲(Paragonimuswestermani)、豬囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)和裂頭蚴(Sparganum)的感染。
背景技術(shù)：
在韓國，人類腸道寄生蟲，如人蛔蟲、毛首鞭蟲、犬鉤蟲和東方毛圓線蟲(它們經(jīng)常通過糞便檢來被檢測)，已經(jīng)被明顯降低，因此現(xiàn)在是可被忽視的?，F(xiàn)在，這樣的糞便檢驗僅在象醫(yī)院這樣的醫(yī)療機構(gòu)進行。相反，迄今為止，居住于組織內(nèi)的寄生蟲不斷地出現(xiàn)，因此，也變得相對越來越重要。進一步地，居住于組織內(nèi)的寄生蟲比腸道寄生蟲引起更嚴重的損傷，因此，它們的感染需要一種合適的藥物治療。精確的診斷是適當治療的第一步，因此，獲得合適的診斷工具是關(guān)鍵。
具體地，在許多發(fā)展中國家，被華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的感染是重要的地方病。很多人已經(jīng)被它們感染但沒有有效的治療。超過15百萬的病人所患支睪吸蟲病，一般通過糞便檢驗進行診斷。然而，很難診斷輕度感染。而且，很多人有不愿做糞便檢驗的傾向。此外，皮內(nèi)試驗可以用于群體篩選檢查，但用作診斷工具時特異性太低。因此，皮內(nèi)試驗傾向于被血清學試驗代替。
在另一方面，肺吸蟲病、豬囊尾蚴病和裂頭蚴病，每年有幾萬病人在遭受痛苦，只能通過血清學檢驗進行診斷。這樣的血清學試驗使用的ELISA包含了準備每種寄生蟲抗原的步驟和使用這些抗原的步驟。當前，在韓國，幾個試驗室已經(jīng)建立了它們自己的標準，并在自己試驗室試驗。然而，這種已知的方法不能被標準化。而且，這種方法一次只能檢測一種寄生蟲，要檢測幾種寄生蟲要重復幾次。因此，需要發(fā)展一種新的能通過簡單標準化方法一次診斷主要組織內(nèi)寄生蟲的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人進行了廣泛的研究來解決在組織內(nèi)寄生蟲診斷中的在先的問題。作為結(jié)果，本發(fā)明人注意了抗原-抗體反應(yīng)的免疫化學特性。發(fā)明人使用了來自華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的粗抗原，并使用人血清作為其陽性或陰性對照抗體，對支睪吸蟲病、肺吸蟲病、豬囊尾蚴病和裂頭蚴病同時診斷。
相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供一種能一次對支睪吸蟲病、肺吸蟲病、豬囊尾蚴病和裂頭蚴病進行標準化血清學診斷的的診斷試劑盒。
本發(fā)明涉及診斷支睪吸蟲病、肺吸蟲病、豬囊尾蚴病和裂頭蚴病的ELISA試劑盒，其包含a)多孔平板或長條，在之上有來自華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原覆蓋；b)不與上述抗原反應(yīng)的人血清，作為陰性對照；和c)作為陽性對照的人血清，每一種包含與上述抗原特異性反應(yīng)的抗體。
這個試劑盒可以進一步包含稀釋和清洗溶液、結(jié)合物溶液、底物緩沖液、封閉溶液。在優(yōu)選的實施方案中，稀釋和清洗溶液包含了磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。結(jié)合物溶液包含了辣根過氧化物酶標記的抗人IgG山羊血清。底物是O-苯二胺(OPD)。在這個例子中，試劑盒進一步包含了過氧化氫作為氧化劑。封閉溶液包含硫酸。
優(yōu)選地，試劑盒分別包含作為蛋白質(zhì)的來自華支睪吸蟲和衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲的抗原1.5-2μg/孔、以及豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原2-2.5μg/孔。也更優(yōu)選，使用前，與華支睪吸蟲、豬囊尾蚴反應(yīng)的血清被26倍稀釋，與衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲和裂頭蚴反應(yīng)的血清被101倍稀釋。
附圖簡述

圖1表示抗原覆蓋在抗原覆蓋平板的每一個小孔上的示意圖。
本發(fā)明的最好實施方式本發(fā)明提供了一種同時診斷4種一般用血清學方法檢測的蠕蟲類寄生蟲，華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的試劑盒。更具體的，本發(fā)明提供了采用來自華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原和包含這些抗原的抗體的人血清間的抗原-抗體反應(yīng)同時診斷上述寄生蟲感染的ELISA試劑盒。
因此，本試劑盒的特征在于包含僅一個小平板用來診斷華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的感染。那就是說，一個96孔小平板或一個12×8孔長條，被來自華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原覆蓋并固定。然后，受試驗者的血清被加上以診斷寄生蟲感染。幾種試劑是需要的，它們在這個平板的包裝中以給定的量提供。這可以實現(xiàn)一次性標準化診斷。
本發(fā)明的一個實施方案是包含作為樣品溶液的人血清、辣根過氧化物酶標記的抗人IgG山羊血清作為結(jié)合物溶液、O-苯二胺(OPD)作為底物、過氧化氫作為氧化劑的ELISA試劑盒。
試劑盒包含下列內(nèi)容物。它包含合適數(shù)量的抗原和未稀釋的血清，血清將依據(jù)寄生蟲的種類在使用前進行稀釋i)有4種寄生蟲抗原覆蓋的小平板96孔平板或12×8孔長條ii)陰性標準血清一瓶iii)陽性標準血清相應(yīng)于華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的各一瓶(共4瓶)iv)稀釋和清洗溶液(5倍濃縮的)2瓶v)結(jié)合物溶液(350倍濃縮的)1瓶vi)底物緩沖液1瓶vii)底物(O-苯二胺)4.6mgviii)過氧化氫1瓶ix)封閉溶液1瓶上述內(nèi)容物將在下面具體描述。
(i)覆蓋抗原的小平板
表196孔小平板或12×8孔長條上每孔的成分與含量

在A，B，C，D行的第一列的孔中沒有覆蓋抗原(ii)陰性標準血清一瓶表2一瓶陰性標準血清中的成分與含量(15μl)

(iii)陽性標準血清各1瓶(共4瓶)(iii-1)華支睪吸蟲陽性標準血清表3華支睪吸蟲陽性標準血清1瓶(6μl)中的成分與含量

(iii-2)衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲陽性標準血清表4衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲陽性標準血清1瓶(2μl)中的成分與含量

(iii-3)豬囊尾蚴陽性標準血清表4豬囊尾蚴陽性標準血清1瓶(6μl)中的成分與含量

(iii-4)裂頭蚴陽性標準血清表4裂頭蚴陽性標準血清1瓶(2μl)中的成分與含量

(iv)濃縮的稀釋、清洗溶液(10倍濃縮的)2瓶(使用前5倍稀釋)表7稀釋、清洗溶液1瓶(25ml)中的成分與含量

(v)稀釋的(350倍)結(jié)合物溶液1瓶(使用前稀釋100倍)表8稀釋的結(jié)合物溶液1瓶中的成分和含量

(vi)底物稀釋緩沖液1瓶表9底物緩沖液1瓶(6ml)中的成分與含量

底物緩沖液(6ml)檸檬酸-磷酸緩沖液(vii)底物1瓶表10底物(OPD)1瓶中的成分與含量

-O-苯二胺(OPD)鹽酸鹽(4.6mg)以粉狀提供，使用前稀釋于5ml PCB中。(viii)過氧化氫1瓶，包含30μl 30％未稀釋溶液，在使用前稀釋在底物緩沖液中至濃度為0.1％。(xi)封閉溶液1瓶表11封閉溶液1瓶(15ml)中的成分和含量

在上述試劑盒中，下列情況被認為是陽性。
華支睪吸蟲≥0.20；衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲≥0.25；豬囊尾蚴≥0.25；和裂頭蚴≥0.24。
本發(fā)明試劑盒用下列方法制造(i)抗原覆蓋平板的準備經(jīng)過純化的4種寄生蟲的粗抗原覆蓋在96孔平板上，封閉并干燥，然后冷藏。參照孔、陰性標準血清孔和4種陽性標準血清孔，也包括在這個平板上。在其余的孔中，21個樣品被檢測。也就是在A，B，C，D行的第一列的孔中沒有覆蓋抗原，被用做空白孔。華支睪吸蟲抗原覆蓋在A行的第2到第12列和E行的第1到第12列。衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲抗原覆蓋在B行的第2到第12列和F行的第1到第12列。豬囊尾蚴 抗原覆蓋在C行的第2到第12列和G行的第1到第12列。裂頭蚴抗原覆蓋在D行的第2到第12列和H行的第1到第12列。圖1表示了小平板上抗原的覆蓋。其他試劑通過標準方法準備。(ii)標準血清的準備-不與4種抗原反應(yīng)的陰性標準血清-與華支睪吸蟲抗原反應(yīng)的血清-與衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲抗原反應(yīng)的血清-與豬囊尾蚴抗原反應(yīng)的血清-與裂頭蚴抗原反應(yīng)的血清本發(fā)明可以通過下面的實施例更好地理解。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會容易領(lǐng)會，所描述的具體材料和結(jié)果只是例子，并且不是要，也不應(yīng)，對隨后的權(quán)利要求書中更全面描述的本發(fā)明進行限制。
實施例1抗原覆蓋小平板的準備(1)華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴抗原的準備從自然感染的中間宿主(華支睪吸蟲Pseudorasbora parva、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲Cambaroides similis)中分離華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲的囊蚴。兔子和狗分別被華支睪吸蟲和衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲口服感染。3到4個月后，在這些動物身上分別獲得2g或更多的華支睪吸蟲和衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲成蟲。
豬肉絳蟲(Taenia solium)的幼蟲被從被地方病地區(qū)豬囊尾蚴自然感染的豬中分離，從幼蟲囊腫中分離囊液。約2g或更多的裂頭蚴幼蟲被從自然感染的蛇上分離。
獲得的華支睪吸蟲和衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲成蟲和裂頭蚴被用10ml PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.13g/L Na2HPO4和0.2g/L KH2PO4，pH7.5)清洗5遍。把寄生蟲加入到15ml PBS中，在勻漿器中勻漿1到2分鐘。勻漿的天然寄生蟲抗原在4℃10000g離心60分鐘。測量上清液中蛋白濃度。每小瓶100μl分裝并-70℃冷藏。
(2)在小平板孔上覆蓋抗原使用小平板，CostarTM產(chǎn)品(96孔分析平板，平底，聚苯乙烯，Corning)。每種寄生蟲抗原用50mM的碳酸鈉緩沖液(1.5g/l Na2CO3，2.93g/l NaHCO3，pH9.6)稀釋，調(diào)整蛋白的量為20-25μg/ml。
從華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴中分離的每種抗原100μl被加到小平板上A和E、B和F、C和G、D和H行的小孔中(除了A1、B1、C1和D1)。然后，平板可以在4℃過夜，使抗原覆蓋在平板底部。
(3)清洗和封閉殘留的抗原被從小孔中清除。每一小孔用0.2ml的PBST(0.01M磷酸緩沖液，0.0027M氯化鉀，0.137M氯化鈉，pH7.4，0.05％Tween 20)清洗3遍。每個孔中加入0.1ml固定劑(3％脫脂乳/PBST，pH7.6)。固定在37℃條件下進行1小時。每孔用0.2ml的PBST清洗3遍。倒空平板使平板沒有殘留的溶液，干燥、密封，然后冷藏。
實施例2陰性標準血清的準備從顯示不與華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴抗原起反應(yīng)的人上收集10ml血液，從血液中分離血清。將血清加熱到56℃30分鐘使之滅活。使用無菌過濾器過濾。定量于1000μl，加入0.5μlProclin300來獲得1ml陰性標準血清。血清被分裝為15μl每小瓶并冷藏直至使用。
實施例3陽性標準血清的準備(1)支睪吸蟲病陽性對照血清從通過糞便檢測確認含有華支睪吸蟲卵的人上收集10ml血液，從血液中分離血清。將血清加熱到56℃30分鐘使之滅活。使用無菌過濾器過濾。定量于1000μl，加入0.5μl Proclin300來獲得lml華支睪吸蟲陽性標準血清。血清被分裝為5μl每小瓶并冷藏。血清在稀釋后使用(每100μl緩沖液中含有4μl血清)。
(2)肺吸蟲病陽性對照血清從確認感染有衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲或與特異抗原反應(yīng)的人上收集10ml血液，從血液中分離血清。將血清加熱到56℃30分鐘使之滅活。使用無菌過濾器過濾。定量于1000μl中，加入0.5μl Proclin300來獲得1ml衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲陽性對照血清。血清被分裝為2μl每小瓶并冷藏。血清在稀釋后使用(每100μl緩沖液中含有1μl血清)。
(3)豬囊尾蚴病陽性對照血清從確認含有豬囊尾蚴或與囊胞液中抗原反應(yīng)的人上收集10ml血液，從血液中分離血清。將血清加熱到56℃30分鐘使之滅活。使用無菌過濾器過濾。定量在1000μl中，加入0.5μl Proclin300來獲得1ml豬囊尾蚴陽性對照血清。血清被分裝為5μl每小瓶并冷藏。血清在稀釋后使用(每100μl緩沖液中含有4μl血清)。
(4)裂頭蚴病陽性對照血清從確認含有裂頭蚴或與裂頭蚴粗抗原反應(yīng)的人上收集10ml血液，從血液中分離血清。將血清加熱到55℃30分鐘使之滅活。使用無菌過濾器過濾。定量在1000μl中，加入0.5μl Proclin300來獲得1ml裂頭蚴陽性對照血清。血清被分裝為2μl每小瓶并冷藏。血清在稀釋后使用(每100μl緩沖液中含有1μl血清)。
實施例4血液中華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和/或裂頭蚴的測定平板都給定了自己的ID號碼。待測血清被寫在記錄表中，識別號被標記作為記錄。稀釋的標準血清和稀釋的血清樣品被加入到實施例1中制備的抗體覆蓋的小平板的小孔中。A1、B1、C1和D1小孔，作為空白小孔，不裝任何樣品。100μl陰性標準血清被加入到A2、B2、C2和D2小孔中，100μl陽性標準血清被加入到下一個小孔中。支睪吸蟲病陽性血清(1∶26稀釋)裝入A3小孔；肺吸蟲病陽性血清(1∶101稀釋)裝入B3小孔；豬囊尾蚴病陽性血清(1∶26稀釋)裝入C3小孔；裂頭蚴病陽性血清(1∶101稀釋)裝入D3小孔。從A4、B4、C4和D4到E12、F12、G12和H12小孔被用來裝21種稀釋的血清來進行4孔單位的檢測。在識別號的基礎(chǔ)上，在與華支睪吸蟲或豬囊尾蚴反應(yīng)的孔上加入了100μl 26倍稀釋(將10μl血清稀釋在250μl稀釋溶液中而獲得)的血清。在與衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲或裂頭蚴反應(yīng)的孔上加入了100μl 101倍稀釋(將2.5μl血清稀釋在250μl稀釋液中而獲得)的血清。A和E、B和F、C和G和D和H孔分別檢測華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴。因此，一種合適的稀釋血清應(yīng)根據(jù)ID號被加入到小孔中。
小平板用蓋子蓋住并在37℃溫育2小時。然后，用200μl稀釋的PBST(0.01M磷酸緩沖液，0.0027M氯化鉀，0.137M氯化鈉，pH7.4，0.05％Tween 20)清洗3遍，小平板翻轉(zhuǎn)過來并在吸水紙上輕敲使清洗液流盡。100μl稀釋的結(jié)合物(100倍稀釋的辣根過氧化物酶-結(jié)合抗人IgG山羊血清(Fc特異性)，蛋白終濃度110-140ng/ml在1×PBS，0.05％Proclin300中)溶液被加到小孔中。小孔加蓋后在黑暗37℃條件下反應(yīng)2小時。反應(yīng)液被從孔中移去，用清洗液清洗小孔3遍。
50μl底物溶液(將O-苯二胺(OPD)加入到檸檬酸鹽緩沖液中并在使用前加入過氧化氫而制備)被使用多道移液器加到每一小孔中。反應(yīng)在黑暗處進行10分鐘。50μl封閉溶液(4N硫酸)被使用多道移液器加到每一小孔中以終止反應(yīng)。在490nm處測量每一孔的光吸收。
在以上過程后進行檢測，陰性和陽性的光吸收分別在0.1或以下和0.3或以上，被確認是有效的。具有每個抗原指定的標準值或更高值的血清被確定為陽性的。4種寄生蟲感染的參照血清的光吸收值在下面的表11中列出。表124種寄生蟲感染的參照血清的光吸收值

工業(yè)實用能力本發(fā)明的試劑盒能簡單、快速、準確地通過標準化方法一次同時診斷主要的組織寄生的寄生蟲，即華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴，的感染。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴感染的ELISA試劑盒，包含a)多孔平板或長條，在之上有來自華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原覆蓋；b)不與上述抗原反應(yīng)的人血清，作為陰性對照；和c)作為陽性對照的人血清，每一種與上述抗原之一特異性反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，進一步包含稀釋和清洗溶液、結(jié)合物溶液、底物緩沖液、底物和封閉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的稀釋和清洗溶液包含PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的結(jié)合物溶液包含辣根過氧化物酶標記的抗人IgG山羊血清，底物是O-苯二胺，且該試劑盒進一步包含過氧化氫溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的封閉液包含硫酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的華支睪吸蟲和衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲抗原的量分別是1.5-2.0μg蛋白/孔，且豬囊尾蚴和裂頭蚴的抗原的量分別是2-2.5μg蛋白/孔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中向與華支睪吸蟲和豬囊尾蚴的抗原發(fā)生反應(yīng)的孔中加入26倍稀釋的血清，并向與衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲和裂頭蚴的抗原發(fā)生反應(yīng)的孔中加入101倍稀釋的血清。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ELISA試劑盒,能同時診斷華支睪吸蟲、衛(wèi)斯特曼并殖吸蟲、豬囊尾蚴和裂頭蚴的感染。本發(fā)明提供的試劑盒能簡單、快速、準確的通過標準化方法一次同時診斷主要的組織寄生的蠕蟲類寄生蟲的感染。
文檔編號G01N33/569GK1384360SQ02118880
公開日2002年12月11日 申請日期2002年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月2日
發(fā)明者趙昇烈, 蔡鍾一, 洪性臺, 韓信, 趙一煥 申請人:新豐制藥株式會社