專利名稱：微流控通道胚胎和/或卵母細胞處理,分析和生物評價的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總的來說涉及胚胎的處理。本發(fā)明還涉及卵母細胞(未受精胚胎)，和卵的處理。這里所用的胚胎包含卵母細胞，卵以及受精胚胎。本發(fā)明特別涉及胚胎的微流控處理，以用來培養(yǎng)、操作和分析。
背景技術：
輔助繁殖技術的工藝的重要性和使用頻率不斷增加，該技術中對來自哺乳動物生物源單獨處理。這些技術對通過獨立的有性繁殖無法生孩子的人而言具有最直接的好處。農業(yè)也日益依賴這種輔助繁殖技術。胚胎操作用于家畜繁殖中，以便控制這樣的事情，即使牛更快地遺傳進化，并允許一個個體優(yōu)異的母?；蚬５倪z傳特征傳給大量的后代，其后代數量超過通過獨立有性繁殖所得的后代數量。
由于基因操作手術，無性繁殖系化和體外受精(IVF)技術的發(fā)展，家畜胚胎操作變得越來越常規(guī)化。家畜胚胎操作的總目標是增加生產效率，特別是涉及繁殖、產奶量或特殊的奶成分的生產效率，降低脂肪含量，瘦肉組織生長并降低對特定病的易感性。胚胎轉移還用來引入或拯救有價值的種質(germplasm)，繁殖稀少的飼養(yǎng)動物，例如瀕于滅絕的外來物種。
由于成本和較低的成功率，給人以及家畜使用這些輔助繁殖技術帶來明顯的負擔。對人的繁殖來說，這種成本和失敗增加了感情和經濟負擔。另外，預防失敗的安全措施常導致不希望的或很難處理的多胎，以及需要保養(yǎng)額外保存的胚胎，并且在以后的一些時間點作出的額外的困難決定。家畜繁殖則主要關心費用問題。
繁殖和測試技術以及其它胚胎處理技術的失敗率主要歸因于在執(zhí)行這些技術時對胚胎而言效果顯著的處理和操作。最近幾年，動物繁殖技術得以提高，但在動物繁殖中采用的工藝并沒有顯著變化。精密鏜孔的玻璃移液管仍是胚胎學家使用的其中一個基本的工具。利用標準的皮氏培養(yǎng)皿，例如卵的體外成熟(IVM)，體外受精和胚胎培養(yǎng)(EC)的程序中需要為每個程序若干次挑選和放置單獨的卵和胚胎。
從一個皮氏培養(yǎng)皿至另一個皮氏培養(yǎng)皿的這種處理和移動明顯存在潛在的損壞或污損。盡管如此，更重要的可能是在皮氏培養(yǎng)皿中穩(wěn)定的胚胎無法模擬相應的自然界生物繁殖條件。人們付出了一些努力，以便使皮氏培養(yǎng)皿中的胚胎借助皮氏培養(yǎng)皿的攪動而移動，但這是隨意的方法。在此，由于手動皮氏培養(yǎng)皿進行傳統的胚胎處理的方法需要相對大量的生物培養(yǎng)基，這也會因此產生費用問題。牛胚胎用移液管和大的貴重的操縱器獨立處理。包括用于人胚胎培養(yǎng)的生長因子的大量生物培養(yǎng)基的使用使相應的體外程序花費更高。家畜生長刺激素例如每50微克花費超過200美元。
當胚胎生長時，這種靜態(tài)培養(yǎng)系統也不允許改變培養(yǎng)基內的環(huán)境。具有流動的培養(yǎng)基的現有培養(yǎng)系統具有小至0.2至0.5毫升的培養(yǎng)室。然而，培養(yǎng)容積大于所需，且培養(yǎng)基補充太快。促進生長的內生生長因子被稀釋和沖走。當使用貴重的生長因子例如IGF-II(每50微克200美元)時，所需要的大體積的培養(yǎng)基大大地增加了成本。另外，現有的系統不能跟蹤單獨的胚胎。
傳統的處理技術在評價胚胎方面還能力有限。能夠對預植入胚胎包括胚胎、精子或卵子的單倍體核受精卵和卵母細胞進行評價將提供更佳的植入成功率。當前，我們對大多數胚胎在其轉移到容器中之前對其形態(tài)學進行評價。形態(tài)學檢查將挑選出具有嚴重缺陷的胚胎，但它不是生存能力的高度可靠的指示器。目前采用的是在一段時間內進行化學監(jiān)測，但需要在一段時間內進行大量的測量。結果是生存能力的更佳的預測器，大約80％數量級，但許多胚胎在監(jiān)測程序中沒有生存下來。這樣需要使用補充的胚胎。從而導致多胎和其它并發(fā)癥，并伴有額外的勞動力成本。
傳統的技術還提供去除透明帶的苛刻的方法，這是制造嵌合體(chimeric)胚胎中關鍵的步驟。傳統上，采用移液管口將一個胚胎從包含培養(yǎng)基的一個組織培養(yǎng)皿吸取至一個包含酸性培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。胚胎留在培養(yǎng)基中一段時間(幾十秒)，然后用移液管口吸取至包含新鮮的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。接下來，胚胎在移液管內進出沖刷幾次，以便迅速沖散所有酸性培養(yǎng)基，并使之對細胞膜的損害最小。移液管口的開口與胚胎大小幾乎相同，因此，沖刷在胚胎上產生剪切應力。因此，移液管口操作的不精確將使胚胎受損的幾率大大增加。
這樣，需要一種改進的胚胎處理裝置和方法，它以公知的胚胎處理技術解決上述問題。一種改進的胚胎處理裝置和方法應提供一種改進的方法來模擬自然條件。還應提供一種構件模塊，例如胚胎培育系統，胚胎分析系統，胚胎存儲系統和類似的系統。較大和/或大功率和精確的儀器可基于該構件模塊。另外還需要改進對胚胎生存能力的評價。

發(fā)明內容
這些需要符合或超出現有的微流控胚胎處理裝置和方法。本發(fā)明模擬胚胎的生物旋轉。一個胚胎流動通道通過流體使嵌入其中的胚胎移動，并且其尺寸確定為與待處理的特定類型的一個或多個胚胎為相同數量級。所確定的尺寸和流體連通產生了胚胎的模擬的生物旋轉。另外，在一個或多個胚胎周圍流動的流體避免了其停滯，降低了一個或多個胚胎產生“褥瘡”的可能性。
本發(fā)明還允許生物培養(yǎng)基流體逐漸改變，與手工重復地將一個胚胎從在移液管或皮氏培養(yǎng)皿中的一種培養(yǎng)基轉移到另一種培養(yǎng)基中相比較，這具有顯著的優(yōu)點。培養(yǎng)基的逐漸改變避免了在局部環(huán)境種突然改變所帶來的沖擊。本發(fā)明的微流控系統還允許一個胚胎與其它胚胎共同培養(yǎng)，一個或多個胚胎與胚胎上游的細胞共同培養(yǎng)，并保持對與對象胚胎分享共同的生物培養(yǎng)基的胚胎進行獨立控制培養(yǎng)，從而確保試驗胚胎具有與對象胚胎相同的環(huán)境條件。
本發(fā)明的其它方面涉及微流控胚胎經處理以便進行操作、評價和定位胚胎的廣義原理上的特殊使用。一方面涉及使用一系列的逐漸收縮部來去除胚胎周圍的材料。這一點從從卵母細胞去掉周圍的堆積物(cumulus)得到證明。最初的幾個收縮部切除堆積物，然后在最終的小的收縮部該堆積物從卵母細胞上吸出，該收縮部的尺寸為可防止卵母細胞通過。
根據本發(fā)明的基本原理，胚胎評價也可實現。在一個優(yōu)選的評價中，對胚胎的表面性能和柔順性(變形)進行評價。微流控通道提供對壓力進行微調控制的機會，以便在略低于公知的發(fā)生胚胎損害的力時進行不同的評價。在一個相同壓力梯度微流控通道中對胚胎滾動的距離和/或速度進行測量可提供的信息是，健康的胚胎表現為與通道壁具有更大的靜摩擦，因而它們移動較慢或移動較短的距離。當定位一在收縮部時，健康的胚胎液還表現為其變形小于不健康的胚胎，該不健康的胚胎更容易牽拉到收縮部內。另外，健康的胚胎表現為能夠更好地恢復其形狀。
微流控通道中的流體在不改變胚胎環(huán)境的條件下很容易在下游收集，從而提供比傳統的人工處理和取樣技術更好的機會來進行流體化學分析。另外，從微流控通道收集的全部流體已經過胚胎。這提供比圍繞皮氏培養(yǎng)皿中的胚胎的流體停滯更好的評價信息。
通過本發(fā)明，培養(yǎng)基可連續(xù)或周期性的經過胚胎，并在下游收集，這消除了在皮氏培養(yǎng)皿技術中所需要的額外處理。本發(fā)明提供更一致的流體樣品，因為流體可以相同的方式重復收集，反之，從皮氏培養(yǎng)皿中采集的樣品可基于吸入培養(yǎng)基的移液管的放置而改變，即它與一個胚胎有多遠或多近。
使用透明的通道區(qū)域允許進行許多種類的光學分析。在透明區(qū)域處，可添加污點或顏料，以便目視檢查透明區(qū)域。該透明區(qū)域還提供使用圖象分析裝置的機會，因為微流控通道可構造成將一個胚胎精確地定位在一個位置，以便通過成像設備分析。
采用本發(fā)明的通道和收縮部來給胚胎精確地定位和/或流動操作還能夠進一步提供一種去除哺乳動物胚胎的透明帶的改進的方法。胚胎通過流體移動到一個精確的位置，在此，細胞溶解劑可沖洗胚胎，以去掉透明帶。


參考附圖，并通過下面的詳細描述，對本領域的普通技術人員來說，本發(fā)明的其它目的，特征和優(yōu)點將變得更清楚，附圖中圖1表示根據本發(fā)明構造的一種優(yōu)選的微流控胚胎處理裝置的橫截面；圖2(a)是表示用于胚胎定位的一種優(yōu)選的窄的微流控通道收縮部的頂視圖；圖2(b)是表示用于胚胎定位的另一種優(yōu)選的淺的微流控通道收縮部的橫截面視圖；圖2(c)和2(d)是一種替代的優(yōu)選的流體動力學收縮部的示意圖；圖2(e)是又一種替代的優(yōu)選的流體動力學收縮部的示意圖；圖2(f)是一種替代的優(yōu)選的機械收縮部幾何外形；
圖2(g)表示例如用于帶處理的圖2(e)流體動力學收縮部中特定的流動模型。
圖3(a)是根據本發(fā)明構造的一種優(yōu)選的重力流驅動的微流控培養(yǎng)和測試裝置的透視圖；圖3(b)是用于本發(fā)明的去除透明帶過程的微流控通道的示意橫截面；圖4是根據本發(fā)明構造的胚胎分析裝置的框圖；圖5(a)-5(c)表示根據本發(fā)明的優(yōu)選的胚胎微流控通道嵌入和去除結構；圖6(a)-6(b)表示根據本發(fā)明構造的優(yōu)選的培養(yǎng)裝置；圖7(a)和7(b)示意性表示用于從卵母細胞國去除堆積物的狹窄的通道外形；圖8(a)和8(b)表示用于去除堆積物的完整的原型裝置；圖8(c)至(f)表示在圖8(a)和8(b)的原型試驗中使用的步驟，以便從卵母細胞中去除堆積物；和圖9(a)-9(d)表示用作胚胎生存能力的指示器的胚胎的變形評價。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種微流控胚胎處理裝置，該裝置減少了在胚胎的天然生物宿主外處理該胚胎時施加在其上的應力。該裝置和方法在促進胚胎滑動和旋轉的通道中，通過流體輔助移動，再現了模擬胚胎生物旋轉。這里涉及的旋轉可包含完全旋轉或部分旋轉。部分旋轉也可稱為搖動。
現在參考圖1，圖中所示是微流控胚胎處理裝置10的橫截面圖，該裝置包括一個胚胎傳輸網絡12，該胚胎傳輸網絡至少部分由基本上為胚胎級別的通道14形成。通道14內的胚胎16與通道14中的流體流一起移動，同時通道的緊密尺寸導致胚胎14以模擬的生物旋轉運動移動。十倍于胚胎大小的通道已用來形成滾動和滑動。在生物宿主中，發(fā)育的胚胎在其初始發(fā)育階段向著子宮移動，它們通過旋轉和滑動附著在子宮上。微流控通道14產生這種模擬運動。
通道的尺寸對產生生物旋轉很重要。高度是嚴格的尺度，并且業(yè)已發(fā)現約三倍于胚胎直徑的高度可促使旋轉。由于流體的流動也起作用，確定的該比率在某種程度上可改變，但已發(fā)現三比一的最大比率可產生旋轉?？梢岳斫猓ǖ缹挾炔荒敲粗匾?。寬度可任意選擇。這樣，如果胚胎保持在一個數量級時，那么寬度可小于胚胎直徑的兩倍。如果希望有多個胚胎，可使用更大寬度的通道。
通道14的網絡提供培養(yǎng)胚胎的手段，并且提供可將胚胎移動和放置在期望位置的手段。在發(fā)育的最初階段，多數哺乳動物胚胎的大小在受精后頭幾天中通常保持恒定。這樣，通道14的大小不會對其中培養(yǎng)的胚胎造成障礙。有利的是，胚胎16可保持移動和/或可具有圍繞它的連續(xù)或脈沖式流體流，以避免對胚胎16的潛在的有害生物作用。
包括通道的裝置10的優(yōu)選示例結構也在圖1中顯示。通過對合適材料，例如硅片18采用任何合適的顯微機械加工技術可形成微流控通道14。所選材料必須能消毒并且不應對胚胎造成生物威脅。裝置的通道14整個被覆層20密封。形成玻璃或其它透明材料的覆層有利于方便地視覺監(jiān)控通道14中的胚胎。粘合劑22將覆層20粘到硅片18上。另外，覆層的材料可設計成能屏蔽掉對通道14內的胚胎有害的射線。
不象其它細胞傾向于浮在流體培養(yǎng)基中，相對大而重的胚胎沉在微流控通道14的底部。所關心的典型的哺乳動物植入前胚胎是90至180μm直徑的球體。每個胚胎中，細胞膜圍繞每個細胞(卵裂球)，透明帶、糖蛋白膜或殼圍繞整個細胞團塊。細胞在受精后頭幾天分裂幾次，胚胎的體積保持恒定，在本發(fā)明的原理基礎上構造的同一裝置中，卵可受精和發(fā)育成胚泡。胚泡是胚胎植入子宮前的最后階段。
對制造這種裝置和類似裝置來說，同樣重要的是其能夠處理單個的胚胎或少量胚胎。將胚胎定位到給定位置，移動到替代位置，并且圍繞胚胎保持恒定或改變的生物狀態(tài)都是根據本發(fā)明的基本原理提供的能力，并且本發(fā)明的受精、發(fā)育、試驗結構和其它裝置均依賴于部分或全部這些性能。為了使胚胎能在發(fā)育期間連續(xù)移動，可產生長通道或形成一個圈?？晒┻x擇的是，在例如圖6(a)和6(b)所示的發(fā)育站可發(fā)生胚胎的停置。通過改變流體流，有限大小的隔室或通道也可用來使胚胎在其中前后翻轉，如后面將進一步根據圖6(a)和6(b)來對此進行討論的那樣。
本發(fā)明利用收縮部提供獨立胚胎的精確定位，其優(yōu)選實施例如圖2(a)和2(b)所示。圖2(a)是在微流控通道14中形成的狹窄的收縮部24的截面頂視圖。許多原因導致需要例如在胚胎處理裝置10中精確定位。在裝置中設置的分析儀器需要胚胎在電極、光電檢測器、顯微鏡的焦點或其它類似傳感器處精確定位。將胚胎傳輸到收縮部24允許這種所需的定位而不需借助反饋系統。通過使生物流體培養(yǎng)基30反向流動，胚胎16即可簡單地不受收縮部24約束。即使在保持在收縮部時，胚胎16也承受著圍繞它的生物流體培養(yǎng)基的流動，因為流體30流經它并經過收縮部24。這是有利的，因為滯流于流體中的胚胎具有更多的潛在可能產生“褥瘡”，這是在胚胎處理技術中對低成功率的令人疑慮但還未證明的解釋。
微流控通道14的側壁部分28a，28b在期望的位置收縮，以防止胚胎16通過那里。收縮部24沒有完全關閉微流控通道14，這樣流體生物培養(yǎng)基30可經過定位在收縮部24處的胚胎16。圖2(b)顯示出了替代的淺收縮部26的側截面圖，其中當胚胎16位于收縮部時，流體生物培養(yǎng)基30同樣能經過。收縮部也可以為其它形狀?？偟膩碚f，能夠防止胚胎通過，同時允許流體流經收縮部的任何，例如對稱形狀以及梳狀都是可以接受的，以便在根據本發(fā)明的裝置10中定位胚胎。最好收縮部的尺寸設定成使胚胎定位并防止該胚胎通過，同時不必增加在裝置10中使用的流體壓力來移動胚胎。收縮部長度還應保持足夠小，以避免流體控制出現問題，因為微流控通道的收縮部將具有比微流控通道14的無約束部分更高的單位長度流體阻力。
在微流控通道14內的流體動力還可以用于定位胚胎。盡管圖2(a)和2(b)所示的收縮部是物理收縮部，但在圖2(c)和2(d)中，可實現有效的流體動態(tài)收縮，而不必采用物理障礙來阻止胚胎的通過。在圖2(c)和2(d)中，一個深度增加的微流控通道阱部分14a限定了一個位置，在該位置，胚胎16可利用流體動力學控制，即溢出和流過阱部分14a從而有意識地得到保持。在圖(c)中，高層流或非層流導致胚胎16留在阱部分內，因為在阱部分14a的前緣發(fā)生了分流。在(低)流速期間，流體流線符合包括阱部分14a的微流控通道14的輪廓，以便將胚胎沖出阱部分外。對于特定的阱幾何外形和尺寸，可分別計算保持胚胎和沖出胚胎的預定流速，或者可通過試驗確定。圖2(e)表示定位胚胎16的一個替代的策略。在圖2(e)中，在微流控通道14的交叉處形成T形匯合處14b。在平衡的流體流條件下，如圖2(e)所示，在胚胎位置沒有流動，允許它保持就位。盡管沒有圖示，但具有鋸齒形或其它小的物理形狀可能增加圖2(e)中胚胎16的穩(wěn)定性。圖2(f)中示出了另一種幾何外形構造。
對于圖2(a)-2(f)所示的幾何外形和流動而言，有可能將胚胎定位在微流控通道的網絡內的一個精確位置。通過成像或其它裝置以及對胚胎的處理來提供目測檢查、胚胎去除、胚胎測試、分析胚胎的機會。因此，采用本發(fā)明可實現對胚胎的許多機械操作，并且通過對胚胎的移動進行這種精確的定位有助于進行任何處理、分析或操作，同時本發(fā)明還能夠操作和控制流體環(huán)境。
利用收縮部和微流控通道流體來將胚胎定位在圖2(a)-2(e)所示類似的裝置中的特定的典型的處理技術是從胚胎中去除透明帶。透明帶是包圍胚細胞的糖蛋白基質。嵌合體，即具有兩個DNA組的單體動物是通過去除透明帶并將分離的胚細胞聚在一起來實現的。對于基因轉錄程序、試管受精(IVF)和細胞活體檢查來說，變薄或去除帶也很重要。為去除透明帶限定存放位置，例如如圖2(f)所示。在圖2(f)中收縮部頂面處為0.01數量級的低高寬比可能需要支撐，以避免塌陷。在一種原型裝置中，這利用圍繞收縮區(qū)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)柱實現。一個或多個胚胎靠在其上的收縮區(qū)可以成形為使胚胎聚在一起，在嵌合體成形時這是必要的。V形放置表面以如下方式將胚胎聚在一起。在如圖2(f)所示的收縮部上游，微流控通道構造成使得酸性溶液的控制沖洗可導致該溶液流過停留的一個或多個胚胎。例如，酸性入口可t形匯合到主流內，以便導入圖2(f)的停留區(qū)域。在收縮部附近和上游，在短期內例如由細胞溶解栓提供進入主通道的酸性溶液，以實現去除透明帶。對于微流控通道而言，在所需的時間段內可實現流動的精確控制。在原型裝置中，與包括收縮部和“T”交叉通道在內的主微流控通道相連的注射器用來控制胚胎定位和使流體流過定位的胚胎。注射器提供對流體的精確控制，計算機控制的微型注射器進一步對流量控制和計時進行精確控制。
去除透明帶的一種替代的機械方法涉及對透明帶的機械破壞。這是例如使帶通過本發(fā)明的微流控通道來實現的，該微流控通道包括一種機械結構，以便在透明帶上刻劃或切割。本發(fā)明的精確的流量控制還有可能形成一種層流方法，以便對帶“刻劃”。在圖2(e)的“T”形匯合處，兩種不同溶液的兩個分離流束在“T”形處匯合流入一個如圖2(g)所示的單一通道，這里的虛線指流束分離。這些流束可以在單一通道內因層流而保持分離。一個流束(左邊)包含例如使透明帶稀薄的酸。驅動壓力控制在兩種溶液之間的交界面的橫向位置，這樣，胚胎16的透明帶由酸“刻劃”。
包括如圖2(a)所示的收縮部，用于定位胚胎的培養(yǎng)和試驗裝置31在圖3(a)中示出。裝置31具有在微流控通道14的網絡32中的流體流，該流體的流動基于在若干流體容器34內的流體30的液面，由重力驅動。用于驅動流體30的任何適當的裝置均被認為與本發(fā)明的基本原理相符合，例如泵送，但圖3(a)中所示的重力法對于簡單和效率而言最優(yōu)。流動的方向由容器34中流體的液面簡單控制。這樣，例如保持在收縮部24以便通過適當的儀器培養(yǎng)或檢查的胚胎16通過首先調節(jié)液面得到定位，從而使其從入口36移動到收縮部24，并且當流體流反向經過收縮部24時使胚胎釋放。通過流體流使胚胎移動到出口38來實現胚胎16的去除。
在移動經過網絡32的微流控通道14期間，如上所述，一個或多個胚胎滾動和滑動，以模擬胚胎朝向哺乳動物宿主的體內子宮的自然移動。這種期望的移動方式可借助于適當的表面活性劑例如BSA(牛的血清白蛋白)。該表面活性劑有助于促進胚胎滾動時的某種程度上的滑動。
圖3(a)還示出了本發(fā)明提供有平行附加微流控處理和培養(yǎng)裝置31a而具有的附加優(yōu)點。附加裝置31a具有與裝置31相似的結構，但可具有更少甚至單個微流控通道。理想化地講，它們的結構是相同的。裝置31a的重要特征是它與主裝置的入口36和出口38共享共同的流體源。裝置31a中處理的胚胎與主裝置31中的胚胎生物隔離，但它們通過共享相同的流體源、壓力和/或相同的生物培養(yǎng)基條件而具有相同的生物學條件。在示例的使用中，附加裝置31a因此可能形成重要的控制培養(yǎng)，其中通過試驗胚胎的發(fā)育或發(fā)育缺乏可確認主裝置31中建立的條件是合適或是不合適。
圖4是胚胎分析裝置的方框圖。在圖4的裝置中，微流控通道14的網絡32將胚胎移到一個或多個分析站40a，40b或40c。胚胎經過如上所述那樣的收縮部定位于給定分析站。分析站可包括能獲得關于胚胎的信息的任何儀器，同時通過形成收縮部使胚胎定位于對于分析站中特定儀器來說合適的檢測點。胚胎經過一個或多個出口38a，38b移出裝置，這樣可替代地將胚胎引導至采取?？繀^(qū)形式的培養(yǎng)站、微流控通道14的附加長度段或為了使胚胎在培養(yǎng)期間連續(xù)移動而形成的環(huán)狀微流控通道中。
用于本發(fā)明裝置中的入口和出口可包括用于胚胎嵌入或移去的任何傳統方式或結構。但是，嵌入和移去的附加優(yōu)選結構如圖5(a)-5(c)中所示。在圖5(a)中，使用與微流控通道14流體連通的阱42。阱42中的流體最好還包括重力供送，它有助于驅動通道14中的微流控流體。胚胎16置于阱42內，并且與生物培養(yǎng)基一起移動到通道14中，或者在未建立流體條件下簡單地獨立沉在通道14中?？刹捎玫诙愃频内?2，使用移液管44或相似裝置移去胚胎。移液管也可用來嵌入胚胎。在圖5(b)中，在通道14末端處的懸掛滴46用來嵌入和移去胚胎。通過表面張力保持懸掛滴46。在胚胎嵌入之后，在該點可添加流體，或通過裝置中的流體流動吸入胚胎?？晒┻x擇的是，裝置可傾斜，以促使胚胎離開懸掛滴46。在圖5(c)中，與通道14直接連通的漏斗形孔48用來嵌入和移去胚胎。漏斗形幫助移液管44或相似裝置定位。小直徑孔48處的表面張力將防止流體漏出，但通道14中的壓力必須不超過征服表面張力并導致流體漏出這一點。嵌入的胚胎將沉入通道14中，同時當胚胎接近孔時將流體從孔中抽出即可移去胚胎。當然，圖5所示的技術均可相互結合或與傳統技術相結合，以便將胚胎嵌入給定處理裝置和從其中移去。另外，可用移動蓋或翼片作為抗污染和/或蒸發(fā)的保護裝置覆蓋阱42或孔48。
現在參考圖6(a)和6(b)，圖中示出了根據本發(fā)明的胚胎培養(yǎng)裝置50。培養(yǎng)裝置50中的流體培養(yǎng)基流在培養(yǎng)基入口52和培養(yǎng)基出口54之間的任一方向流動。裝置包括若干陷阱或隔室56。如圖6(b)最佳所見，陷阱56包括被淺區(qū)58分隔的深區(qū)。入口52和出口54之間的流體流過淺區(qū)，并且經過深區(qū)，以便在深區(qū)隔室56中前后移動胚胎。胚胎經過通道孔60嵌入和移去，其中通道孔60可通過圖5(a)至5(c)中的任何優(yōu)選方法形成。在裝置50中，本領域的普通技術人員會這樣想到，胚胎可在隔室56中前后移動，以便模擬生物學旋轉，可與培養(yǎng)基中的其它胚胎享有相同的培養(yǎng)基條件，并且可容易地移去和嵌入。雖然圖6(a)和6(b)示出的是頂部裝載實施例，以便將胚胎放置在間隔中，但裝置也可在底部裝載的情況下工作，基本上與圖6(a)和6(b)中所示相反。在這種底部裝載布置中，胚胎仍保持在深部分但不經過淺部分。替代實施例可包括代替淺收縮部的缺口，在此胚胎不能經過缺口，但流體流可在其間產生，并且缺口的深度可與胚胎保持隔室的深度相同。
如圖3(a)所示的樣機裝置已生產出并經過了試驗。出于完整性的原因，這里描述了典型的樣機。本領域的技術人員可以理解，通過任何其它傳統的微制造技術，可完成制造樣機的方式。本領域的技術人員還估計，生產裝置的制造可顯著不同，并且樣機裝置的具體數字尺寸和條件不對本發(fā)明的保護范圍起限制作用。
在典型的樣機通道中，1Pa/mm的壓力梯度導致培養(yǎng)基以約10- 10m3/s(100nl/s)數量級的流量流動，平均速度是1至2mm/s。在這些流動條件下；胚胎沿著通道底部滾動；流體將在通道的相同區(qū)域中以1/3至1/2范圍的速度運動。通過向連接到通道末端的阱處施加壓力，胚胎可輸送到(和保留在)包括培養(yǎng)隔室和恢復阱的特定位置。胚胎填充在通道的重要位置，因此大大改變培養(yǎng)基的流動。培養(yǎng)基經過通道的流動為層流。
樣機微流控通道的網絡已在如圖3(a)所示的裝置中制出在3英寸<100>的硅片中蝕刻溝槽，然后粘合玻璃覆層以形成通道。通過在彈性體中采用微模制技術已制造出包括微流控通道的裝置。其它塑料和技術也可能合適，包括例如熱塑材料的注模。典型的通道網絡包括幾個分支微流控通道，該通道在靠近裝置的中心處交叉。長度范圍從1.5至2.5cm的分支在頂部為160至200μm深，250至350μm寬。生產樣機裝置的第一步包括使用傳統的照相平版印刷技術在氮化硅(SiN)覆層上做圖案。用氫氧化鉀(KOH)溶液各向異性蝕刻微流控通道?；蛞詡鹘y方式采用碳化物補強鉆頭，或采用超聲波在玻璃覆層中鉆孔。使用UV可固化環(huán)氧樹脂(NOA 61，Norland Products，Inc.New Brunswick，NJ)將玻璃覆層粘到晶片上，或在450℃環(huán)境中使用500V將Pyrex(派萊克斯耐熱玻璃)7740覆層陽極化粘合到晶片上。在陽極化粘合前，利用緩沖氧化物浸蝕劑(BOE)可去掉氮化物涂層。在通道網絡的每個分支的端部，或者利用環(huán)氧樹脂(快粘5分鐘環(huán)氧樹脂，或5小時固化環(huán)氧樹脂膠；均由GC Electronics，Rockford，IL制造)，或者利用硅有機粘合劑(由紐約Waterford的通用電氣公司制造的RTV 108和RTV 118，或DowCornign Corp.，Midland，MI生產的Sylgard牌184)，將玻璃阱粘合到玻璃覆層上。
在樣機裝置中，象圖2(a)(“窄”)和2(b)(“淺”)的那些收縮部已制出并已經過試驗。利用單一掩膜和蝕刻操作可構造如圖2(a)所示的“窄”收縮部的通道。如圖2(b)所示，具有“淺”收縮部的通道需要兩個掩膜和兩個蝕刻操作。
對樣機裝置中除5分鐘環(huán)氧樹脂外的所有元件材料作試驗，以便測量胚胎的生物相容性。在使用本發(fā)明時，本領域的技術人員可以理解，可從備選材料中選擇那些用于樣機裝置的材料，但生物相容性必須總是建立在已有的數據和/或測試上。雖然許多材料已知與某些細胞相容或有毒，但在調查微制造技術中所用的材料與胚胎的相容性方面幾乎沒有做什么工作。所選材料也可根據哺乳動物的類型而改變，其中被處理的特定胚胎來自該哺乳動物。
在樣機試驗中，雙細胞老鼠的胚胎(B6SJL/F2)隨機分配，并且在基質上培養(yǎng)，在培養(yǎng)基M16(Sigma，St.Louis，MO)中具有牛血清白蛋白(BSA；4mg/ml；Sigma)，覆蓋有礦物油(Sigma)。所有胚胎均在37℃下5％CO2空氣環(huán)境中培養(yǎng)96小時。每24小時測試胚胎的發(fā)育率。針對每種材料將胚胎中達到胚泡階段的百分比與對比組的百分比相比。達到胚泡階段的老鼠胚胎在胚胎轉移前的最后可能階段可能沒有發(fā)育的障礙。不能保證沒有副作用，除非胚胎也轉移給受者老鼠，并且一直監(jiān)控到后代出生，出于實用和經濟原因在胚泡階段共同總結試驗。多數被測材料證明與老鼠胚胎相容，包括硅片，SiN涂層，NOA 61和RTV 118。一些材料，例如5分鐘環(huán)氧樹脂尚未被測試，因為它僅用于理論裝置中，以證明本發(fā)明的機械和流體原理，不可能用于產品裝置中。
我們進行試驗，以測試樣機裝置的幾個方面。不同試驗需要帶不同通道結構的裝置。在所有試驗中，鹵素燈泡經光纖照亮通道，這可以在立體顯微鏡下觀察到。量筒和秒表用來確定流率。因為流體不可壓縮，通道任何部分中的平均流體速度正是流率除以橫截面面積。
給定流率的胚胎運動速度的測量發(fā)生在簡單的直線通道中，該通道29mm長，162μm深和160-380(底-頂)μm寬。壓力梯度變化，并且在每個設定下測量胚胎速度。通道填滿磷酸鹽緩沖劑鹽(PBS)，有和沒有BSA。培養(yǎng)基的長頸瓶連接通道。通過調整長頸瓶的高度，使用微米頭轉化階段，壓力差最終調節(jié)到0.05Pa內。通過在試驗之間接管使壓頭至零，從而使長頸瓶相互連接。微制樣機裝置在過氧化氫/氫氧化銨/去離子水溶液中清潔，并且在進行試驗前新移液管尖粘有環(huán)氧樹脂。在使用BSA之前進行所有使用PBS而無BSA的試驗。一旦通道填滿培養(yǎng)基，老鼠的胚胎就放置在通道入口處的入口阱中。
我們進行試驗，以觀察通道尺寸和形狀對胚胎傳輸的影響。對這些試驗來說，一個裝置構造有一個長的連續(xù)通道，該通道具有11個部分，每個部分都具有如下四個深度之一140，164，194和210μm。在每種深度下，通道具有2或3個不同寬度。在晶片的表面處測得的寬度其范圍從275至480μm。在最窄部分，胚胎被幾何收縮，以便V形-槽上運動，而在其它區(qū)域中則沿著具有平坦-底部的通道運動。觀察運動速度和旋轉特性，并且比較不同部分。
在收縮部處對胚胎的觀察發(fā)生在幾個裝置中，該收縮部為窄和淺型收縮部。胚胎實際直接引導到特定收縮部處。通過添加或減少流體改變每個阱中培養(yǎng)基的高度，調整通道網絡的每個分支中的壓力梯度。壓力頭調整1至8mm(10至80Pa)。
正當胚胎放置在培養(yǎng)基中沉在容器底部時，置于微流控通道中的胚胎沉積在底部。在所有試驗中，當培養(yǎng)基流動時，胚胎轉動并且在流動方向上沿著通道底部滑動。通常它們還保持與通道的其中一個側壁接觸。在培養(yǎng)基(磷酸鹽緩沖劑鹽)中無任何表面活性劑的最初試驗中，胚胎出現轉動而不會沿著通道底部滑動。在培養(yǎng)基容納有BSA(4mg/ml)的后來的試驗中，胚胎滑動或轉動，同時沿著底部滑動。
試驗揭示，在通道中的胚胎的運動速率依賴于培養(yǎng)基速度。在圍繞它們的流體的速度低于50μm/s時，有時它們粘在通道底部。對PBS和PBS/BSA這兩種培養(yǎng)基來說，0.16Pa/mm的壓力梯度驅動流體以大約380μm/s的平均速度經過通道。胚胎以187-250μm/s(380μm/s的49至66％)轉動。當培養(yǎng)基更快流動時，胚胎更快轉動，并在轉動時滑動。已觀察到此時胚胎運動的實際速度和從一個胚胎到下一個胚胎的粘性變化的趨勢與在相同通道中同一時間、在幾乎相同的路線中運動的胚胎會快25％。在所觀察到的范圍中，150至1000μm/s的速度與壓力梯度呈線性關系。
試驗結果表明，通道尺寸和形狀的作用與由原因推出結果的預測匹配。對給定的流率來說，平均流體速度和胚胎速度在有較小橫截面的通道中較大。相反，對給定的壓力梯度來說，平均流體速度和胚胎速度在具有較大橫截面面積的通道中較大。在這兩種情況下，胚胎在V形-槽上比在具有平坦-底部的通道上運動得更慢。胚胎在V形-槽中比在平坦-底部通道上還更可能楔入并且粘附。
電滲流動下的流體還導致胚胎在通道中轉動。由于存在壓力驅動的滴流流動，胚胎沿著通道底部以近似10μm/s轉動。接通電壓導致老鼠胚胎沿著通道底部以快于20μm/s，至少30μm/s的速度向著有負極的阱轉動。使電壓極性反向，胚胎以近似10μm/s的速度在相反方向上轉動。不使用例如BSA的表面活性劑，所以只有少量或根本無滑動。如果用來移動胚胎，必須在仔細控制的條件下施以電輔助，以避免對培養(yǎng)基進行不希望的加熱。
采用Fluent/UNS 4.2(Fluent Inc.，Lebanon，新罕布什爾州)建立計算流體動態(tài)模型，并且采用Quickfield(Tera Analysis Inc.，Tarzana，加拿大)對具有恒定橫截面面積的樣機微流控通道進行2-維有限元分析，驗證所觀察的流率和流動模型。胚胎模型建立成為一個剛性球體。前面已說過在典型的條件下胚胎沒有出現變形。為了分析層流，將通道的1或2mm部分嚙合(mesh)成10000至30000個四角形元件。一旦驗證，采用計算機模型來確定流動速度變化圖，設計具有較低壓降的收縮部，以觀察收縮部處滯留的胚胎上的力，并且分析相似通道中的電驅動流動。但是，將胚胎與通道阱的粘接和胚胎的變形結合分析將明顯變得更復雜，并且我們并不期望那樣做。
如上所述，在胚胎速度的直通道試驗中，在0.16Pa/mm的壓力梯度下，培養(yǎng)基具有380μm/s的平均速度。有限元分析確定在這些條件下中心線速度是815μm/s。當在通道中運動時，胚胎正切于底部和一個壁?？紤]100μm直徑的圓正切通道的底和一個壁。流體經過該圓運動的平均速度在胚胎不存在時是480μm/s。但是，胚胎僅以187-250μm/s轉動，在PBS和PBS/BSA培養(yǎng)基中都會快39-52％。速度變化圖促進胚胎向前和沿著壁滾動，這證實了目測觀察?？偠灾?，胚胎轉動速度為流體在相同區(qū)域的橫截面中流動的速度的1/3至1/2。
收縮部大大增加了通道中的流體阻力。標準分析公式可幫助估計阻力，但收縮部的截面形狀隨位置變化。在設計有掩膜并且蝕刻晶片之前分析收縮部的三維模型。從有限元分析獲得的信息導出最佳尺寸的收縮部。采用可根據裝置的幾何形狀確定各自的大小的淺收縮部折衷了對小的流體阻力和堅固的結構的需求。典型的收縮部具有20μm的最小深度。
對在陷阱處的胚胎布局的研究表明，約10-8至10-7N數量級的橫向力迫使胚胎向側面移動，并且在入口斜面處離開側面而進入淺收縮部。
試驗揭示了微流控傳輸的幾個有趣的特性，例如胚胎之間的速度變化并且趨于沿著通道底部轉動、經常正切側壁等。但是，試驗確實揭示了幾個其他重要的論點。電滲流動對幫助胚胎移動是有用的，并且可幫助形成用于胚胎處理和受精的栓子。流體流動的電控制必須仔細管理，因為高壓可以幾種途徑傷害胚胎。即使通道部分中胚胎離開了電場，施加的能量也會加熱培養(yǎng)基(焦耳加熱)使其超過生理溫度，并且電解產物改變了PH值。注意胚胎需要約0.029滲摩(Osmol)，即相對高的傳導性。而且，EOF在有表面活性劑的通道中降解，但胚胎在有例如BSA表面活性劑的培養(yǎng)基中更好。
通過如圖3(a)所示的重力供送裝置或通過泵產生流體壓力的裝置提供電輔助微流控自由傳輸具有重要的優(yōu)點。培養(yǎng)基可容易地隨時間改變，以便適合發(fā)育中的胚胎的改變需求。逐漸改變培養(yǎng)基的成分避免了經常伴隨從具有不同培養(yǎng)基的一個皮氏培養(yǎng)皿到第二個皮氏培養(yǎng)皿傳輸而突然地改變環(huán)境而產生施加到胚胎上的應力。本發(fā)明的胚胎的微流控處理比用移液管傳輸物理更嚴格，并且明顯比包括某些刺穿外膜的傳統實際操作的許多技術損傷少。
可以預料，在如圖3(a)所示的處理裝置中對流體流動進行控制，進而控制胚胎的定位將通過大型自動裝置中的程序控制儀器來處理。在本發(fā)明的胚胎處理裝置內的傳感條件基礎上可采用結合報警和警告的裝置。在相似方式中，本發(fā)明的處理裝置采用傳統監(jiān)控胚胎的儀器。本領域普通技術人員將基本上認識到，微流控胚胎處理裝置因此形成一基本構件模塊，許多有用的裝置都基于此，并且這些裝置將結合到本發(fā)明的實質中。
一些特定裝置已表明了胚胎和卵母細胞的操作、試驗和處理。微流控通道的特定幾何形狀示意描述在圖7(a)和7(b)中，并說明能從卵母細胞上去除堆積物。所述幾何形狀是微流控通道的一系列逐漸收縮部分，它們位于彎曲部分中。雖然圖7(a)和7(b)具有彎曲的收縮部，但收縮部不是必須彎曲的。收縮部的內表面最好具有齒狀或鋸齒狀的突起，以便在其經過時幫助切割堆積物。系列中的最后部分具有隔開一定距離的突起，以便避免損壞卵母細胞，前面部分具有間隔逐漸變小的突起，以便在流體壓力下迫使卵母細胞經過收縮部時切割周圍堆積物部分。在圖7(a)中，多個收縮部(彎曲部分)的每一個都分別具有等距的突起，同時先前部分的下游部分采用更小間隔。也可以構造成單一一部分，其中該部分中的突起逐漸靠近在一起，以便達到相同的目的，即在多個位置處更深地切割堆積物而不損壞胚胎。圖7(a)和7(b)所示的幾何形狀用于從牛的卵母細胞中移去堆積物。在樣機裝置中，微流控通道的直部分是500微米寬。所述裝置使用了五個收縮部。第一并且是最大的部分包括一些突起，這些突起的間隔從300微米逐漸減少到第五收縮部的50微米寬。前四個收縮部在堆積物卵母細胞復合體經過時沿著流體流施力切割(已觀察到“mohawk(溜冰之一種花式)”切割)堆積物。在第五收縮部處一半堆積物被吸走。流體反向流動幾次，以便重新定位卵母細胞，直到另一半堆積物經過最后的收縮部被抽掉。這樣，適當尺寸的收縮部和幾何形狀可用來定位和限制胚胎和周圍的結構。
移去堆積物的完整樣機裝置在圖8(a)和(b)中描述，而圖8(c)-(f)說明了采用圖8(a)和8(b)所示樣機從卵母細胞去掉堆積物過程中使用的步驟。聚丙烯阱粘在裝載端口，以提供圖8(a)中所示的入口處的較大的流體儲存池。丙烯酸注射器連接組件退出端口，這樣標準的注射器或其他配件可連接到裝置。注射器允許手工壓力控制，或注射器泵可用作精確的流體控制器，普列克絲玻璃和PDMS原型允許用于胚胎貫穿通道網絡的定位，并且在試驗期間使卵母細胞在期望位置處停靠。另外，樣機裝置提供完整的視覺通路(對胚胎分析很重要)，能夠快速形成模型，并容易與未來的分析傳感器構成一體。通過使用漏斗形入口阱(圖8(b)中的流入)簡化了在裝置中裝載卵母細胞。漏形模制成在通道的入口處該漏斗半的尖部與通的頭部相連。這種寬漏斗結構允許卵母細胞復合體容易嵌入。卵母細胞典型地沉入漏斗底部。傾斜阱引導復合體進入在漏斗底部的通道入口。該裝載方法簡化了處理過程，因為它不需要精確的橫向定位。為了將堆積物細胞處理成允許完全去除堆積物的結構，合成物經過兩個收縮區(qū)(圖8(c))。這些變窄的區(qū)域迫使堆積物在卵母細胞的前后形成兩個主塊，如圖8(d)中所示。兩個收縮的堆積物制約區(qū)(圖8(a))分別是200和150μm寬。堆積物受到損壞，并且在限制區(qū)中集攏，然后流到移去端口(見圖8(d)-8(f)))，該端口包括在原型裝置的微流控通道中的彎曲處彼此九十度放置的兩個微小通道。端口允許堆積物進入(圖8(e)和8(f))，但端口對于卵母細胞來說太小。使用流體流動控制，首先通過一個端口，然后通過另一個端口，從卵母細胞上吸走堆積物。
本發(fā)明的流控通道也用來通過分析胚胎的機械特性實現胚胎健康評價的新穎方法。特定的機械特性證明，區(qū)分健康胚胎包括病人胚胎的表面特性和變形特性。胚胎在變形到沒有永久損壞的一點后趨于恢復其形狀，這被認為是健康的指示器，因為胚胎主動地保持其形狀。胚胎通過它們的薄膜有選擇地運輸離子，并且透明帶的蛋白質恒定地重定位它們自己，以抵抗外力。離子和其他基質/代謝物運進和運出胚胎細胞是胚胎健康的功能。不健康的胚胎運輸離子的能力降低，并且在變形到避免永久損壞的點后恢復其形狀的相應能力降低。壓力的控制和能夠在收縮部處定位保證了胚胎能夠在控制避免健康胚胎永久變形的情況下變形。已實施的變形試驗保持壓力梯度低于0.1Pa/m(1mm的水/cm)，并且流速等于或低于每秒幾毫米。
圖9(a)-9(d)示出了用作胚胎生存能力的指示器的胚胎變形評價。收縮部的尺寸確定為胚胎經過時由于流體壓力而變形。健康的胚胎能在經過收縮部后較好地恢復圖9(d)所示的形狀。替代地，胚胎可在收縮部變形，該收縮部的尺寸防止其通過。在收縮部變形一段時間后，流體反向流動，反向和停止流動，或停止流動，使胚胎能恢復其形狀。
通過對微流控通道提供的壓力進行精確控制還能夠估計胚胎與通道阱的靜摩擦，因為健康的胚胎更有粘性。這樣，當與不健康的胚胎比較時，健康的胚胎可定量測量到，它更緩慢地下降到通道。可供選擇的是，可類似地比較運動的距離，在相同的流動和壓力條件下健康胚胎運動更短的距離。
通過應用本發(fā)明的微流控通道的裝置能更好地進行胚胎的流體分析。從本發(fā)明的微流控通道培養(yǎng)裝置的下游通道收集流體。根據按照本發(fā)明形的裝置，收集到的流體已流經胚胎，因為本發(fā)明的裝置避免了出現停滯的條件，并且微流控通道的尺寸使得通道中的流體經過胚胎附近。當下游流體被收集時，可能會期望添加相同量的上游流體，以便保持壓力和微流控裝置中的流動，由此可收集流體樣本?？删幊痰淖⑸淦鞅每捎脕砣サ袅黧w樣本，并且輸入額外的上游流體?？晒┻x擇的是，可收集胚胎的所有下游流體，然后例如采用化學或光學分析來分析該流體。
本發(fā)明的系統可用于完整的卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育而無需嚴格的操作技術。由于能夠控制流體和定位胚胎，因而提供了卵母細胞成熟，與精液接觸，然后模擬生物學發(fā)育的機會，所有這些都在本發(fā)明的單一裝置中完成。成熟(IVM)，受精(IVF)和發(fā)育(EC)需要不同的介質，精子獲能成熟和沖洗過程。使用微流控通道的本發(fā)明的系統允許這些條件的快速改變和精確控制，允許在幾小時或幾天的時間中改變流體培養(yǎng)基的成分，以便模擬分泌物和成長因子在女性生殖道中的累積和胚胎移動到生殖道的不同部分。可以控制培養(yǎng)基，以便使其緩慢地流經每個胚胎(或卵母細胞)以提供新鮮供送的營養(yǎng)劑。例如每小時一次的周期性流動與連續(xù)流動相比，將能夠有限度地建立有益的自動分泌和副分泌因子，同時不會使無用的產物積累。所有現有的IMF，IVF和EC技術可在本發(fā)明的簡單裝置中運用，這樣不必在順序進行的IMF，IVF和EC過程或各個過程的任何一個期間處理或轉移給定的卵母細胞。
本發(fā)明的系統可減少多精入卵率，使用較少的精蟲數量，并接合游動技術以選擇最具活力的精子。在典型的人類IVF過程中，在0.5至1.0ml的培養(yǎng)基滴液中，卵被50,000至100,000個精子包圍。該數量可減少，因為微流控通道提供使精子和卵母細胞結合到一起的流動控制。
在家畜的IVF中，多精入卵率較高，例如豬約為40-70％。根據本發(fā)明，微流控通道導致精子非?？拷涯讣毎涍^，例如約30μm。另外，可通過控制培養(yǎng)基流動率來控制精子靠近卵母細胞的時間間隔。替代地，根據本發(fā)明定位的?？柯涯讣毎杀３址浅？拷容^小的精子流體包的嵌入點，在減少多精入卵的機會的同時提供了靠近卵母細胞的精子的高濃度。分離的栓子或彈丸可傳遞一至幾個精子，以建立對輸卵管中的狀態(tài)的狀況模擬，在那里任一時刻都有少量精子。該能力以及用于定位胚胎的具有T-交叉點或其他物理或有效的收縮通道允許將一至幾個精子傳遞至卵細胞附近，以減少多精入卵。另外，胚胎數量級的通道的幾何形狀能夠增加卵細胞和精子之間的接觸。精子和側壁的“彈起”增加了精子和卵細胞之間的有效接觸。
低溫貯藏是另一項技術，該技術有利于根據本發(fā)明對胚胎的定位和精確控制圍繞胚胎的流體環(huán)境?？梢韵蛟诒景l(fā)明的裝置中定位或移動的胚胎傳遞低溫，之后可反向應用低溫貯藏工序。然后，如上所述，流體的改變可用來促成成熟，受精和發(fā)育。
以上已展示和描述本發(fā)明的各種實施例，但應理解，其他的修改、替代和替換顯然是本領域的普通技術之一。這些修改、替代和替換可以在不背離由權利要求限定的本發(fā)明的實質和范圍的情況下可做出。
本發(fā)明的各種特征在權利要求中提出。
權利要求
1.一種評價胚胎的方法，該方法的步驟包括將胚胎放在一個大約胚胎級別的流體通道中；在流體通道中形成流體流；和當胚胎處于該流體通道內時，評價胚胎的特性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述形成流體流的步驟使胚胎在流體通道內移動，所述評價胚胎特性的步驟包括測量胚胎在流體通道內移動的速度。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述形成流體流的步驟使胚胎在流體通道內移動，所述評價胚胎特性的步驟包括測量胚胎在流體通道內移動的距離。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述評價步驟包括在流體通道內的胚胎下游的流體通道中獲得流體樣品，以及對流體樣品進行化學分析。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述流體通道包括收縮部，該收縮部的尺寸為可使胚胎在經過時變形，所述評價步驟評價在胚胎經過收縮部后恢復其形狀的趨勢。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述流體通道包括收縮部，該收縮部的尺寸可防止胚胎通過，所述形成流體流的步驟形成流體流，以便使胚胎移動到收縮部，然后通過流體壓力略微變形一段較短的時間，所述評價步驟評價在胚胎變形一段較短的時間后恢復其形狀的趨勢。
7.一種處理胚胎的方法，其步驟包括將胚胎放在一個大約胚胎級別的流體通道中；在流體通道中形成流體流；和當胚胎定位在該流體通道內時，處理胚胎以改變胚胎的特性。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述流體通道包括一系列收縮部，該收縮部包括彼此的間距逐漸減小的若干突起，所述處理步驟包括在流體通道中操縱流體流，以便使胚胎經過一個或多個收縮部，并去除堆積物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于一系列收縮部中的最后一個收縮部的尺寸能夠阻礙胚胎通過，所述處理步驟包括操縱流體通道中的流體流，以便使胚胎經過一系列收縮部中其它一些收縮部，然后當胚胎定位在一系列收縮部中的最后一個收縮部時，操縱流體流，以便吸掉堆積物。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于流體通道包括其尺寸為可防止胚胎通過的收縮部，所述處理步驟包括改變流體通道中的流體，以便使酸性溶液流過定位于收縮部的胚胎，以去掉透明帶。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于通過改變流體通道中的流體，以便使酸性溶液流過位于收縮部的兩個胚胎，以去掉透明帶，然后改變流體通道中的流體，以便在兩個胚胎上促進嵌合體培養(yǎng)，從而，所述處理步驟用來形成嵌合體。
12.一種微流控胚胎處理裝置，它包括一種胚胎輸送網絡(32，50)，該胚胎輸送網絡具有生物培養(yǎng)基，以便使嵌入其中的胚胎移動，所述輸送網絡包括大約胚胎級別的胚胎流體通道(14)和用于將流體輸入該輸送網絡內的開口(36，52)。
13.根據權利要求12所述的裝置，其特征在于還包括在兩個流體通道的交叉處形成的輸送線路的t形匯合處(14b)，和用于在一個單獨的流體通道位置將流體輸入輸送網絡中的第二開口。
14.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于還包括在所述流體通道內形成的阱(14a)，它用來在所述流體通道內在預定的流速期間，保持胚胎，并允許在所述流體通道內，在小于所述預定流速的期間使胚胎排出。
15.一種微流控胚胎受精裝置，它包括一種胚胎輸送網絡(32，50)，該胚胎輸送網絡具有生物培養(yǎng)基，以便使嵌入其中的胚胎移動，所述輸送網絡包括大約胚胎級別的胚胎流體通道(14)，以及用于將流體輸入該輸送網絡內的開口(36，52)；和在兩個流體通道的交叉處形成的輸送網絡中的T形匯合處(14b)，以及用于在一個單獨的流體通道位置將精子流體輸入輸送網絡中的第二開口。
全文摘要
用于處理和定位胚胎的微流控胚胎級別的通道(14)，該通道提供以改進的方式評價和處理胚胎的機會。流體流用來在微流控通道內移動和定位胚胎，通道的幾何形狀可用于將胚胎置于特定位置。評價作為生存能力的預測器的胚胎表面特性和柔順性(變形)。微流控通道提供精調壓力的機會，以便在略小于公知的損傷胚胎的力下進行不同的評價。在相同的壓力梯度下的微流控通道中的胚胎滾動的距離和速度的測量提供的信息是，健康的胚胎移動更慢或移動距離較短，因為它們與通道壁具有更大的靜摩擦。
文檔編號G01N33/48GK1441652SQ01812654
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月8日 優(yōu)先權日2000年5月12日
發(fā)明者戴維·J·畢比, 伊恩·K·格拉斯哥, 馬修·B·惠勒, 亨利·澤林格 申請人:伊利諾伊大學受托管理委員會