專利名稱：在線單生物分子檢測芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于單生物分子檢測的芯片，尤其是一種將樣品注樣、分離、反應(yīng)和檢測在一個芯片上完成的單生物分子檢測芯片的制作方法。
背景技術(shù)：
從分子水平上快速有效地檢測單個生物分子，特別是檢測細(xì)胞表面所特有的一些生物分子，如受體研究相應(yīng)的生物學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系等，對分子生物學(xué)的研究及其在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)上的應(yīng)用具有重要意義，它不僅有助于我們研究生物大分子(蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、多糖和糖復(fù)合物、指類、激素等)和結(jié)構(gòu)(特別是三維結(jié)構(gòu))、性質(zhì)、生物合成的調(diào)控過程，從而研究DNA分子的堿基排序，理解基團(tuán)的結(jié)構(gòu)、組織和表示基團(tuán)(如tRNA)的高級結(jié)構(gòu)、了解RNA與蛋白質(zhì)相互識別和作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及動力學(xué)行為等而且為疾病的早期診斷(如病毒感染、腫瘤發(fā)生的早期細(xì)胞蛻變等)提供了一種有效方法。
然而，這些已有的單分子檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在以下一些不足(1)目標(biāo)分子必須事先進(jìn)行選擇和分離，這樣勢必降低單分子的檢測速度，難以推廣到臨床上的在線檢測；(2)近場光纖對目標(biāo)分子的定位是單分子檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中最費時、費力的操作，如果目標(biāo)分子的濃度本身就低，再加上光纖定位困難，將直接影響單分子檢測的效率和結(jié)果。
三、技術(shù)內(nèi)容1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的就是提供一種在一個芯片上將反應(yīng)器、過濾器集成在一起，以實現(xiàn)樣品注樣、分離、反應(yīng)和檢測在一個芯片上完成的在線單生物分子檢測芯片的制作方法。
2、技術(shù)方案本發(fā)明的在線單生物分子檢測芯片的制作的方法為(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形狀的微米級的微管道網(wǎng)絡(luò)，(a)對基片表面進(jìn)行改性處理，由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕?b)用LB膜技術(shù)在基片表面組裝厚度為幾百納米的抗蝕層，對抗蝕層進(jìn)行前烘處理；(c)膜、曝光；(d)用甲基異丁基甲酮和異丙醇的混合物顯影；(e)對抗蝕層進(jìn)行后烘處理；(f)用腐蝕液刻蝕溝槽。(2)在檢測區(qū)內(nèi)組裝具有分子識別與相互作用的單分子層，(a)基片表面進(jìn)行羥基化處理；(b)基片清洗、干燥；(c)將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解與純苯溶劑相混合形成稀溶液，再將基片置于該稀溶液中，在基片表面形成具有分子識別與相互作用的單分子層，(d)取出基片漂洗、干燥。對基片表面進(jìn)行改性處理的方法是將基片置于六甲基二硅烷中，對抗蝕層進(jìn)行前烘處理的溫度為80～100℃，時間為10～30分鐘，掩膜、曝光時的電子束能量為15～25KV，曝光劑量為5×10-5～2×10-6C/cm2，甲基異丁甲酮和異丙醇的混合比例為1∶1，對抗蝕層進(jìn)行后烘處理的溫度為120～140℃，時間為10～30分鐘，用腐蝕液刻蝕溝槽的寬度和深度均為10～15微米，基片表面進(jìn)行羥基化處理的方法是將基片置于60～90℃的濃硫酸～重鉻酸鉀洗液中5～6小時，純苯溶液的制作方法是將無水CaCl3加入苯溶液中12小時以上，然后蒸餾提純，得到純苯溶劑，將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解在純苯溶液中形成的稀液在濃度為10～30摩爾/升。
3、技術(shù)效果①由該方法制作的檢測芯片由于樣品注樣、分離、反應(yīng)和檢測高度集成在一個芯片下，使得在實際應(yīng)用中對生物分子的檢測效率大大提高；②分子組裝結(jié)合光刻制作限域圖形，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的精確定位；③芯片投入批量生產(chǎn)后，由于它的低成本，可以作為一次性使用品，可以在生物分子學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域獲得更加廣泛的應(yīng)用。
④這種制作方法在具備一定的裝置前提下，實施起來容易，預(yù)期芯片制作成品率98％以上。
⑤這種制作方法的提出，對傳統(tǒng)的單分子檢測方法起到革命性的推動作用，在這種制作框架下，人們還可以發(fā)展一些功能更全、更新的各種檢測芯片。
具體實施例方式
實施例第一步基于微光電系統(tǒng)(MEMS)制造技術(shù)，在硅基片上制出微米量級的微管道網(wǎng)絡(luò)。
(1)對基片表面進(jìn)行改性處理，用六甲基二硅烷(HMDS)溶液經(jīng)旋涂法涂布于硅片表面，在140℃左右加熱數(shù)分鐘，形成疏水性的有機(jī)單分子層，以增強(qiáng)光刻膠與基片表面的粘附性；(2)用LB膜技術(shù)在基片表面組裝厚度為幾百納米的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)抗蝕層，再對抗蝕層進(jìn)行前烘處理，溫度為100℃，時間為30分鐘；(3)掩模、曝光，電子束能量選為15KV，曝光劑量為5×10-5C/cm；(4)用甲基異丁基甲酮和異丙醇的1∶1混合物在20℃下顯影2分鐘；
(5)后烘溫度120～140℃，時間為30分鐘；(6)用腐蝕液在30℃下，以刻蝕速度100nm/min的速度刻蝕深度和寬度10～15μm的溝槽。
第二步在檢測區(qū)域內(nèi)組裝具有分子識別與相互作用的單分子層，用于生物分子的精確定位。
(1)在硅片表面首先進(jìn)行羥基化處理，將硅片置于70℃的濃硫酸-重鉻酸鉀洗液中6小時；(2)取出基片用蒸餾水漂洗5～6次，再用超純水漂洗5～6次；(3)在100℃下干燥30分鐘；(4)將無水CaCl3加入苯溶液中12小時，然后蒸餾提純，得到純的苯溶劑；(5)將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解在苯溶劑中，配成20mol/L的稀溶液；(6)將基片置于硅烷藕聯(lián)劑溶劑中，室溫下放置數(shù)小時，在基片上形成具有分子識別與相互作用的單分子層；(7)取出基片依次用苯和丙酮漂洗7～8次，讓其在清潔的器皿中自然干燥。
權(quán)利要求
1.一種在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于制作的方法為(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形狀的微米級的微管道網(wǎng)絡(luò)，(a)對基片表面進(jìn)行改性處理，由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕?b)用LB膜技術(shù)在基片表面組裝厚度為幾百納米的抗蝕層，對抗蝕層進(jìn)行前烘處理；(c)掩膜、曝光；(d)用甲基異丁基甲酮和異丙醇的混合物顯影；(e)對抗蝕層進(jìn)行后烘處理；(f)用腐蝕液刻蝕溝槽；(2)在檢測區(qū)內(nèi)組裝具有分子識別與相互作用的單分子層，(a)在基片表面進(jìn)行羥基化處理；(b)取出基片清洗、干燥；(c)將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解與純苯溶劑混合形成稀溶液，再將基片置于該稀溶液中，在基片表面形成具有分子識別與相互作用的單分子層；(d)取出基片漂洗、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于對基片表面進(jìn)行改性處理的方法是將基片置于六甲基二硅烷中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于對抗蝕層進(jìn)行前烘處理的溫度為80-100℃，時間為10～30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于掩膜、曝光時的電子束能量為15～25KV，曝光劑量為5×10-5～2×10-6c/cm2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于甲基異丁甲酮和異丙醇的混合比例為1∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于對抗蝕層進(jìn)行后烘處理的溫度為120～140℃，時間為10～30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于用腐蝕液刻蝕溝槽的寬度和深度均為10～15微米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于基片表面進(jìn)行羥基化處理的方法是將基片置于60～90℃的濃硫酸～重鉻酸鉀洗液中5～6小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于純苯溶液的制作方法是將無水CaCl3加入苯溶液中12小時以上，然后蒸餾提純，得到純苯溶劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在線單生物分子檢測芯片的制作方法，其特征在于將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解在純苯溶液中形成的稀溶液濃度為10～30摩爾/升。
全文摘要
在線單生物分子檢測芯片的制作方法是一種將樣品注樣、分離、反應(yīng)和檢測在一個芯片上完成的單生物分子檢測芯片的制作方法,其制作方法為:(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形狀的微米級的微管道網(wǎng)絡(luò)。(a)對基片表面進(jìn)行改性處理,由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?(b)用LB膜技術(shù)在基片表面組裝厚度為幾百納米的抗蝕層,對抗蝕層進(jìn)行前烘處理;(c)掩膜、曝光;(d)用甲基異丁基甲酮和異丙醇的混合物顯影;(e)對抗蝕層進(jìn)行后烘處理;(f)用腐蝕液刻蝕溝槽;(2)在檢測區(qū)內(nèi)組裝具有分子識別與相互作用的單分子層。(a)在基片表面進(jìn)行羥基化處理;(b)取出基片清洗、干燥;(c)將帶有功能基團(tuán)的硅烷藕聯(lián)劑溶解與日俱增純苯溶劑混合形成稀溶液,再將基片置于該稀溶液中,在基片表面形成具有分子識別與相互作用的單分子層;(d)取出基片漂洗、干燥。
文檔編號G01N33/53GK1342904SQ0113411
公開日2002年4月3日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者顧寧, 張海黔, 馬明, 虞偉, 陳功 申請人:東南大學(xué)