本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種在酶促ssdna合成循環(huán)中電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其在陣列化酶促ssdna合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、酶促脫氧核糖核酸單鏈（ssdna）合成是一種基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal?deoxynucleotidyl?transferase，tdt酶）的新一代dna合成技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)dna合成方法，酶促ssdna合成因?yàn)樗迷噭┒际巧锟山到饫没蛱烊淮嬖诘某煞?，故而更加綠色環(huán)保。且酶促ssdna合成反應(yīng)全程無(wú)需使用強(qiáng)酸性試劑，不會(huì)發(fā)生脫嘌呤等副反應(yīng)，故而具有合成更長(zhǎng)ssdna分子的潛力。

2、類(lèi)似于傳統(tǒng)的化學(xué)dna合成技術(shù)，近年來(lái)所發(fā)展的酶促ssdna合成也采用了固相合成的策略以方便每一步反應(yīng)后除去可溶性雜質(zhì)，但比起化學(xué)合成所需的偶合-蓋帽-氧化-脫保護(hù)的四步反應(yīng)，一般酶促ssdna合成簡(jiǎn)化至操作更加簡(jiǎn)便的兩步反應(yīng)：1.偶合反應(yīng)：利用tdt酶將單個(gè)有終止合成功能的堿基連接于引發(fā)鏈的3’端以實(shí)現(xiàn)單堿基的偶合；2.脫保護(hù)反應(yīng)：也即3’端有終止合成功能的堿基的活化。如此兩步循環(huán)，最終完成酶促ssdna合成。如cn117126903a公開(kāi)一種酶促ssdna合成方法，所述酶促ssdna合成方法包括：將引發(fā)鏈偶聯(lián)到金屬電極表面得到固相載體；利用所述固相載體進(jìn)行合成反應(yīng)和電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)；不斷重復(fù)進(jìn)行所述合成反應(yīng)與所述電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)，合成目標(biāo)序列。

3、相比于化學(xué)合成中所用各類(lèi)原料都可以利用成熟的化學(xué)工業(yè)大規(guī)模合成，酶促合成中所用的酶只能通過(guò)生物工程發(fā)酵、提取，因而合成單個(gè)堿基的偶合成本居高不下。為此，高通量的固相合成就十分必要：將成千上萬(wàn)條不同的待合成序列中有同樣堿基偶合需求的位置一起反應(yīng)，那么成本就可均攤在所有序列中，實(shí)現(xiàn)合成成本成千上萬(wàn)倍的下降，但技術(shù)難點(diǎn)在于如何同時(shí)控制活化所有有共同堿基偶合需求的序列，而且不干擾其他無(wú)需求序列的終止基團(tuán)。然而，現(xiàn)有的酶促ssdna合成技術(shù)中，（如文獻(xiàn)acs?catalysis?2022?vol.12?issue?5?pages?2988-2997中所述）脫保護(hù)一步的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)將ssdna浸泡于含有亞硝酸鈉的酸性溶液，也即亞硝酸（hno2）溶液中，通過(guò)式（1）中的化學(xué)反應(yīng)將ssdna?3’端的氨氧基轉(zhuǎn)化為羥基，但此操作無(wú)法實(shí)現(xiàn)選擇性地脫去某一特殊序列的氨氧基保護(hù)，因而也就無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量的酶促ssdna合成。

4、???式（1）。

5、綜上所述，如何實(shí)現(xiàn)高通量酶促ssdna合成是目前亟需解決的問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法及其應(yīng)用，對(duì)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上進(jìn)行精確控制，使得ssdna鏈的延伸在且僅在指定電極附近發(fā)生，以期實(shí)現(xiàn)電化學(xué)控制的高通量酶促ssdna合成。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法，所述電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法包括：

4、將3’端修飾有氨氧基（-onh2）的ssdna置于脫保護(hù)溶液中進(jìn)行電化學(xué)處理，通過(guò)電極反應(yīng)使所述脫保護(hù)溶液生成脫保護(hù)物質(zhì)，使ssdna3’端發(fā)生脫保護(hù)；所述脫保護(hù)溶液含有羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物中至少一種。

5、本發(fā)明中，設(shè)計(jì)全新的脫保護(hù)方法，通過(guò)電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)羥胺類(lèi)化合物的氧化反應(yīng)在工作電極附近產(chǎn)生脫保護(hù)物質(zhì)包括亞硝酸或氮氧正離子，再使生成的亞硝酸與電極附近的ssdna的3’端堿基上-onh2反應(yīng)生成一氧化二氮與羥基，完成脫保護(hù)反應(yīng)。與此同時(shí)，擴(kuò)散到工作電極區(qū)域以外的亞硝酸被溶液中的羥胺類(lèi)化合物淬滅，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上進(jìn)行精確控制。

6、可以理解，本發(fā)明中基于羥胺的電化學(xué)氧化產(chǎn)生脫保護(hù)物質(zhì)，具有類(lèi)似功能的羥胺相關(guān)化合物均適用于本發(fā)明。

7、可選地，所述羥胺鹽包括以nh3oh+作為正離子的離子型化合物等。

8、可選地，所述以nh3oh+作為正離子的離子型化合物包括鹽酸羥胺、硫酸羥胺、醋酸羥胺或磷酸羥胺等中至少一種。

9、可選地，所述羥胺衍生物包括甲基羥胺和/或甲基羥胺鹽等。

10、可選地，所述甲基羥胺鹽包括以menh2oh+作為正離子的離子型化合物等。

11、可選地，所述以menh2oh+作為正離子的離子型化合物包括甲基羥胺鹽酸鹽、甲基羥胺硫酸鹽、甲基羥胺磷酸鹽或甲基羥胺醋酸鹽等中至少一種。

12、可選地，所述脫保護(hù)溶液中羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物的濃度各自獨(dú)立為0.01~4mol/l（如0.02、0.03、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5或3.5?mol/l等）。

13、可選地，所述脫保護(hù)溶液還含有保持溶液ph在1~5之間的緩沖成分，可以理解，本領(lǐng)域具有類(lèi)似功能的緩沖成分均適用本發(fā)明，例如乙酸和硫酸鈉等。

14、可選地，所述脫保護(hù)溶液中乙酸的濃度為0~1?mol/l（例如可以是0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8或0.9?mol/l等），硫酸鈉的濃度為0~1?mol/l（例如可以是0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8或0.9?mol/l等）。

15、可選地，所述電化學(xué)處理的方法包括循環(huán)伏安法、方波伏安法、單電位階躍計(jì)時(shí)電流法或多步階躍電位掃描法中至少一種。

16、可選地，所述電化學(xué)處理的時(shí)間為0~120?min，但不為0，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、20、50、80、90、100、110、115、118或119?min等。

17、可選地，所述電化學(xué)處理的電壓范圍為<2?v，包括但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.1、1.2、1.5、1.8v等，優(yōu)選為0.9~1.3?v。

18、可選地，所述電化學(xué)處理在三電極體系下進(jìn)行，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極。

19、可選地，所述工作電極和對(duì)電極各自獨(dú)立地選自鉑電極、金電極、銅電極、鈦電極、鎳電極或鈀電極中任意一種。

20、可選地，所述參比電極選自ag/agcl電極或飽和甘汞電極。

21、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法包括：

22、將3’端修飾有氨氧基的ssdna置于含有羥胺、羥胺鹽或羥胺衍生物中至少一種的脫保護(hù)溶液中，在三電極體系下進(jìn)行電化學(xué)處理，電壓范圍＜2?v，通過(guò)電極反應(yīng)使所述脫保護(hù)溶液中生成亞硝酸，使ssdna3’端發(fā)生脫保護(hù)。

23、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法在酶促ssdna合成中的應(yīng)用。

24、第三方面，本發(fā)明提供一種酶促ssdna合成方法，所述酶促ssdna合成方法包括：

25、將引發(fā)鏈偶聯(lián)到固相載體表面，利用3’-onh2-dntp進(jìn)行合成反應(yīng)，利用第一方面所述的電化學(xué)控制脫保護(hù)的方法進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，重復(fù)所述合成反應(yīng)和脫保護(hù)反應(yīng)，循環(huán)直至合成目標(biāo)序列。

26、可以理解，本發(fā)明關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)可控的脫保護(hù)過(guò)程，而具體的合成反應(yīng)過(guò)程可根據(jù)本領(lǐng)域通用方法進(jìn)行，無(wú)需特殊限制。

27、可選地，所述合成反應(yīng)具體包括：

28、將偶聯(lián)引發(fā)鏈的后的固相載體置于dna酶促合成反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)；所述dna酶促合成反應(yīng)液含有3’-onh2-dntp、tdt酶、鈷離子（co2+）、緩沖劑（如7＜ph＜8的緩沖溶液，包括pbs等）和水。

29、可選地，將引發(fā)鏈偶聯(lián)到固相載體表面進(jìn)一步包括對(duì)所述固相載體進(jìn)行活化處理后進(jìn)行引發(fā)鏈偶聯(lián)。所述活化處理包括用活化化合物對(duì)所述固相進(jìn)行處理，可以理解，本領(lǐng)域通用的活化處理方法以及偶聯(lián)方法均適用于本發(fā)明。

30、可選地，所述活化化合物包括羧基活化偶聯(lián)物以及碳二亞胺類(lèi)羧基活化劑中的至少一種?？蛇x地，所述羧基活化偶聯(lián)物包括n-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽和n-羥基琥珀酰亞胺中的至少一種?？蛇x地，所述碳二亞胺類(lèi)羧基活化劑包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和二環(huán)己基碳二亞胺中的至少一種?？蛇x地，所述偶聯(lián)包括令經(jīng)過(guò)活化處理的固相載體在鏈霉親和素偶聯(lián)液中浸泡，而后再在引發(fā)鏈偶聯(lián)液中浸泡，得到偶聯(lián)后固相載體。可選地，所述鏈霉親和素偶聯(lián)液包括濃度為0.5~1?mg/ml的鏈霉親和素?？蛇x地，所述引發(fā)鏈偶聯(lián)液包括濃度為的1~4?nmol/ml的引發(fā)鏈。

31、可選地，所述引發(fā)鏈包括5’端生物素標(biāo)記的dna序列。

32、可選地，所述酶促ssdna合成方法還包括對(duì)經(jīng)所述合成反應(yīng)和脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的固相載體進(jìn)行解離反應(yīng)，得到解離產(chǎn)物。

33、可選地，所述酶促ssdna合成方法還包括以所述解離產(chǎn)物為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目標(biāo)電泳條帶并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。

34、進(jìn)一步地，在進(jìn)行所述解離反應(yīng)之前，進(jìn)一步包括：將經(jīng)所述合成反應(yīng)與電化學(xué)脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的固相載體進(jìn)行末端切割，并浸入到polya合成反應(yīng)液中進(jìn)行polya合成反應(yīng)，以令引發(fā)鏈的3’端合成polya片段；更進(jìn)一步地，所述polya合成反應(yīng)液包括無(wú)保護(hù)的datp單體、tdt酶、緩沖液以及水。

35、可選地，所述解離反應(yīng)包括：將所述合成反應(yīng)與所述脫保護(hù)反應(yīng)循環(huán)后的所述固相載體浸入到純水中，在80℃~100℃的溫度條件下反應(yīng)得到解離產(chǎn)物。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、（1）本發(fā)明設(shè)計(jì)末端堿基脫保護(hù)方法，采用電化學(xué)控制脫保護(hù)的步驟，僅通過(guò)通/斷電即可實(shí)現(xiàn)在且僅在工作電極附近將羥胺或其衍生物氧化為亞硝酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基保護(hù)基的脫保護(hù)，使得在時(shí)間和空間上精確控制脫保護(hù)反應(yīng)簡(jiǎn)單易行；

38、（2）本發(fā)明的末端堿基脫保護(hù)方法，在進(jìn)行羥胺或其衍生物的電化學(xué)氧化為亞硝酸時(shí)，所生成的亞硝酸可以被電解液本體中大量的羥胺類(lèi)化合物淬滅生成一氧化二氮，此淬滅反應(yīng)可以有效抑制脫保護(hù)活性物質(zhì)（亞硝酸）的擴(kuò)散，確保電化學(xué)控制的脫保護(hù)僅于工作電極加電期間、在工作電極附近有較高亞硝酸濃度的區(qū)域發(fā)生，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)反應(yīng)在時(shí)間和空間上的精確控制，使得dna鏈的延伸在且僅在指定電極附近發(fā)生；

39、（3）本發(fā)明通過(guò)控制加電方式、加電時(shí)間、脫保護(hù)試劑及其濃度，能夠有效抑制電化學(xué)生成亞硝酸過(guò)程中的副反應(yīng)（如ph升/降以及生成一氧化氮、二氧化氮、硝酸根等），提高電化學(xué)脫保護(hù)的效率；

40、（4）本發(fā)明可將工作電極由單一電極轉(zhuǎn)換為在二維平面或三維空間排布的電極陣列，通過(guò)選擇性控制各電極開(kāi)關(guān)，即能實(shí)現(xiàn)僅在導(dǎo)通電極附近對(duì)dna鏈延伸，也即實(shí)現(xiàn)高通量的酶促ssdna合成。