專利名稱：：具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種懸浮編碼微塊陣列芯片。特別是涉及一種能夠制備出滿足生物免疫檢測的微量化、并行化及高通量化的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：近年來，微機電系統(tǒng)(MEMS)、集成電路(IC)技術(shù)、納米技術(shù)、分子生物學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域取得了無可爭議的進(jìn)步和突破，將這些技術(shù)結(jié)合起來形成功能強大的片上系統(tǒng)，為生物探測開創(chuàng)了新的突破口，生物芯片正符合這種強大的片上系統(tǒng)。生物芯片是近年來在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中嶄露頭角的一項新技術(shù)，它通過使用半導(dǎo)體工業(yè)中的微加工和微電子技術(shù)，以及其他相關(guān)的技術(shù)，將現(xiàn)在龐大的分立式生物化學(xué)分析系統(tǒng)縮微到半導(dǎo)體芯片中，從而具有處理高速度、分析自動化、和高度并行處理能力的特點。生物芯片能制作成具有不同用途的全功能縮微芯片實驗室，并具有下述一些主要優(yōu)點，即分析的全過程自動化、生產(chǎn)成本低、分析速度可獲得幾千或幾萬倍的提高；同時，所需樣品及化學(xué)藥品的量可獲得幾百或幾千倍的減少、極高的樣品并行處理能力、儀器體積小、重量輕、便于攜帶。生物芯片從形態(tài)上可分為兩大類固相陣列芯片和懸浮陣列芯片。懸浮陣列又稱為懸浮生物芯片或液相芯片，這種技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期美國Luminex公司開發(fā)出的被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)。該系統(tǒng)能夠在一個試管或微孔中利用少量的樣本同時進(jìn)行ioo種不同的免疫分析。這種獨特設(shè)計使得它擁有常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測方法所不具備的特點重復(fù)性好、通量大、靈活性好、靈敏度高、操作簡便、液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測物的反應(yīng)。但它也有很多不足采用兩種不同的紅色熒光素分子，按一定比例把微球染色達(dá)到生物探針編碼，這種微球編碼方式控制起來相對困難；這種有機染料的熒光信號往往會很快暗下來(即光漂白)，即熒光壽命短；兩種染料的熒光(兩種顏色)需要2種激光加以激發(fā)，造成設(shè)備昂貴、體積較大，數(shù)據(jù)處理費時；檢測時，直觀可視性差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種應(yīng)用納米熱壓印技術(shù)制備出滿足生物免疫檢測的微量化、并行化及高通量化的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法。制備方法包括如下步驟1)選用5片相同的硅片清洗、烘干，具體是依次進(jìn)行如下的過程去離子水抓SC1抓去離子水抓SC2抓去離子水抓HF溶液抓去離子水抓N2氣吹干，其中SC1:15%NH3.H20+15%H202+70%H20，體積比SC2:15%HCl+15%H202+70%!120，體積比DHF:HF:H20=1:IO，體積比；2)涂PMMA膠在硅片上懸涂10X的質(zhì)量濃度的PMMA/苯乙醚溶液，厚度用SPM測得為2iim，懸涂后，取下硅片放在170°C的烘箱中烘焙30min，使PMMA徹底固化；3)熱壓印采用的壓力為40Bar，壓印溫度為190°C，比壓印膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg=120°C高出7(TC，壓力和溫度同時加載時間為4-6min，脫模時溫度為90°C;4)利用氧等離子體反應(yīng)離子刻蝕，調(diào)整膠的厚度為1020nm;5)真空蒸鍍鈦80100nm和金5060nm，其中鈦作為粘附及犧牲層；6)真空蒸鍍鎳1015nm作為粘附層；7)真空蒸鍍銅12001250nm;8)電子束蒸發(fā)鎳3050nm;9)真空蒸鍍金5060nm;10)去膠剝離，懸浮微塊陣列芯片釋放。所述的硅片為4英寸硅片。步驟2所述的涂PMMA膠厚度均勻性誤差小于1%。步驟4所述的刻蝕參數(shù)為腔體壓力為35mTorr，射頻功率為15W，02流量為15sccm，在此條件下刻蝕速率為46-50nm/min。應(yīng)用方法，包括有如下步驟采用如下步驟進(jìn)行懸浮編碼微塊陣列芯片熒光標(biāo)記；1)清洗金塊利用無水乙醇清洗金塊3次，最后分散在無水乙醇中；2)由11巰基羧酸在金塊上形成單分子層利用巰基與金原子強有力的結(jié)合力，在金塊表面沉積一層MUA的單分子層，為下面生物大分子的標(biāo)記提供羧基基團(tuán)；3)生物大分子標(biāo)記金塊采用碳二亞胺為交聯(lián)劑，采用鼠IgG為陽性對照標(biāo)記，雞IgG為陰性對照標(biāo)記；4)熒光檢測分別向鼠IgG標(biāo)記的金塊和雞IgG標(biāo)記的金塊中加入所要檢測的物質(zhì)，熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果。步驟2所述的在金塊上形成單分子層的具體是先配置5mM的MUA無水乙醇溶液，將清洗干凈的金塊分散在MUA的無水乙醇溶液中，室溫浸泡24小時后，利用無水乙醇清洗3步驟3所述的標(biāo)記金塊是將MUA化的金塊浸泡在1.5mL的10yg/mL的陽性對照標(biāo)記鼠IgG和陰性對照標(biāo)記雞IgG中，再向所述體系加入50iiL的EDC水溶液，室溫反應(yīng)2小時后，利用PBS洗滌3次，最后分散在0.01M的PBS緩沖溶液中保存。步驟4所述的熒光檢測具體是分別向鼠IgG標(biāo)記的金塊和雞IgG標(biāo)記的金塊中加入0.lmg/mL的10yLFITC-羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)30min后，PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果。本發(fā)明的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法，制備簡單，制備出的芯片具有超順磁特性，從而為生物修飾及生物磁分離創(chuàng)造了條件。因采用納米熱壓印技術(shù)可以很容易實現(xiàn)大量的微通孔，所以本發(fā)明實現(xiàn)的地址數(shù)理論上可以成千上萬，以熒光作為探針，結(jié)合微塊金表面可以很容易實現(xiàn)生物分子修飾的懸浮陣列技術(shù)，最終可滿足生物免疫檢測的微量化、并行化及高通量化。圖1是利用熒光顯微鏡觀測到的已進(jìn)行免疫檢測的懸浮微塊芯片的效果圖，其中a、c、e、g為陽性控制組，b、d、f、h為陰性控制組；圖2是懸浮微塊的版圖3是納米熱壓印過程示意圖其中:(a)懸膠;(b)壓印;(C)脫膜;(d)反應(yīng)離子刻蝕;(e)分別淀積金屬鈦/金/鎳/銅/鎳/金；(f)去膠、剝離；圖4是制備出的懸浮微塊陣列芯片；圖5是懸浮微塊陣列芯片的振動樣品磁強計(VSM)測試譜圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法做出詳細(xì)說明。本發(fā)明的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法，采用微電子工業(yè)中的納米熱壓印技術(shù)，在微塊表面刻蝕出微通孔標(biāo)記的數(shù)字符號，實現(xiàn)了微塊的生物探針編碼，極大的降低檢測成本。應(yīng)用時，針對不同檢測物的核酸(互補鏈)或蛋白(如抗原抗體)以共價方式結(jié)合到特定編碼的微塊上，再加入被檢測物(被測物可以是血清中的抗原、抗體或酶等)。在懸液中的微塊與被檢測物特異性地結(jié)合，借助熒光顯微鏡可以很清晰、直觀的觀察到微塊表面微通孔標(biāo)記的數(shù)字符號，達(dá)到對微金屬塊的生物探針解碼。利用這種編碼技術(shù)實現(xiàn)的地址數(shù)理論上可以成千上萬，因為地址的多少取決于微塊表面微通孔數(shù)的多少，而采用熱壓印技術(shù)可以很容易實現(xiàn)微通孔的低成本、大批量的制備。這種將熒光探針結(jié)合到微塊金表面可以很容易實現(xiàn)生物分子修飾的懸浮陣列技術(shù)，最終可滿足生物免疫檢測的微量化、并行化及高通量化。圖2本發(fā)明的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的模具尺寸示意圖，懸浮微塊陣列芯片的壓印圖形可以是隨意的，但為了編碼方便，我們采用數(shù)字型的圖形，即以13個圓孔組成的數(shù)字"8"為圖形參考，其中每個圓孔都有兩種編碼方式，以我們這13個圓孔組成的數(shù)字"8"為圖形參考的話，懸浮微塊陣列芯片就有213種編碼方式，假設(shè)每一種微塊分別接一種特異性的生物抗體探針的話，那么通過這種編碼方式的懸浮微塊陣列芯片可以一次檢出213種待檢測的特異性生物抗原物質(zhì)?？紤]大多檢測時并不需要一次檢出那么多種待檢測物，我們以四種編碼的懸浮微塊陣列芯片為代表進(jìn)行制備，它們分別為"0塊"、"1塊"、"2塊"、"3塊"，所以制作了4種標(biāo)記圖形0，1，2，3。如圖3所示，本發(fā)明所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法，包括如下步驟1)選用5片相同的硅片清洗、烘干，本發(fā)明選用硅片為4英寸硅片，具體是依次進(jìn)行如下的過程參考半導(dǎo)體工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(硅)濕法清洗工藝(RCA清洗工藝，由美國無線電公司的W.Kern和D.Puotinen于20世紀(jì)60年代提出)，并根據(jù)我們的實際需要采取所需的清洗工藝，如表1。在這里所指的清洗并不是僅僅去除表面的自然氧化層、顆粒雜質(zhì)、金屬離子、有機雜質(zhì)，而是指去除不利于后續(xù)工藝步驟的表面狀態(tài)(親水性和疏水性)。表l采用的清洗方案<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注SCl(15%NH3.H20+15%H202+70%!120，體積比)SC2(15%HCl+15%H202+70%!120，體積比)DHF(HF:H20=1:IO，體積比)2)涂P薩膠在4英寸硅片上懸涂10%的質(zhì)量濃度(WT)的PMMA/苯乙醚溶液。厚度用SPM測得為2ym。均勻性誤差不大于1%。懸涂后，取下硅片放在17(TC的烘箱中烘焙30min，以使PMMA徹底固化。3)熱壓印(Ml)采用的壓力為40Bar，壓印溫度為190°C，比壓印膠(PMMA，Mw=350，000)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg=120°C)高7(TC，壓力和溫度同時加載時間為5min左右，脫模時溫度為90°C。4)利用氧等離子體反應(yīng)離子刻蝕(02RIE)調(diào)整膠的厚度為1020nm，本發(fā)明的實施例采用厚度為15nm;刻蝕參數(shù)為腔體壓力為35mTorr，射頻功率為15W，02流量為15sccm，在此條件下刻蝕速率大約為48nm/min。5)真空蒸鍍鈦80lOOnm和金5060nm，其中鈦作為粘附及犧牲層，本發(fā)明的實施例采用真空蒸鍍鈦100nm、金50nm;6)真空蒸鍍鎳1015nm作為粘附層，本發(fā)明的實施例采用真空蒸鍍鎳15nm;7)真空蒸鍍銅12001250nm，本發(fā)明的實施例采用真空蒸鍍銅1250nm:8)電子束蒸發(fā)鎳3050nm，本發(fā)明的實施例采用電子束蒸發(fā)鎳50nm:9)真空蒸鍍金5060nm，本發(fā)明的實施例采用真空蒸鍍金50nm;10)去膠剝離，懸浮微塊陣列芯片釋放。按照上述步驟成功制備了具有磁性和抗體雙重靶向功能的懸浮微塊陣列芯片如圖4所示。其超順磁特性如圖5所示，從圖5的VSM測試譜圖中可以看出，室溫下測得的懸浮微塊陣列芯片，具有一條閉合的磁滯曲線，即磁化曲線和退磁曲線重合，且剩磁力和矯頑力在儀器精度允許范圍內(nèi)均為零，而且沒有任何磁滯現(xiàn)象出現(xiàn)，即表現(xiàn)出超順磁特性，從而為生物修飾及生物磁分離創(chuàng)造了條件。本發(fā)明的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的應(yīng)用方法，包括有如下步驟采用如下步驟進(jìn)行懸浮編碼微塊陣列芯片熒光標(biāo)記；1)清洗金塊利用無水乙醇清洗金塊3次，最后分散在無水乙醇中；2)由11巰基羧酸(MUA)在金塊上形成單分子層利用巰基與金原子強有力的結(jié)合力，在金塊表面沉積一層MUA的單分子層，為下面生物大分子的標(biāo)記提供羧基基團(tuán)。具體是，先配置5mM的MUA無水乙醇溶液，將清洗干凈的金塊分散在MUA的無水乙醇溶液中，室溫浸泡24小時后，利用無水乙醇清洗3次，再用0.01M的PBS緩沖溶液清洗3次，最后分散在0.01M的PBS緩沖溶液中。3)生物大分子標(biāo)記金塊采用碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑，鼠IgG為陽性對照標(biāo)記，雞IgG為陰性對照標(biāo)記；采用EDC(碳二亞胺)為交聯(lián)劑。具體是，將MUA化的金塊浸泡在1.5mL的10yg/mL的鼠IgG(陽性對照)和雞IgG(陰性對照)中，再向上述體系加入50iiL的EDC水溶液(40mM)，室溫反應(yīng)2小時后，利用PBS洗滌3次，最后分散在0.01M的PBS(含0.5%BSA)緩沖溶液中保存。4)熒光檢測分別向鼠IgG標(biāo)記的金塊和雞IgG標(biāo)記的金塊中加入10iiLFITC-羊抗鼠IgG(0.lmg/mL)，室溫反應(yīng)30min后，PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示，其中a、c、e、g為陽性控制組，b、d、f、h為陰性控制組。上述試劑11巰基羧酸(MUA)Aldrich95%;EDC，上海吉爾生化有限公司；鼠IgG、雞IgG、FITC-羊抗鼠IgG均購自北京鼎國。權(quán)利要求一種具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)選用5片相同的硅片清洗、烘干，具體是依次進(jìn)行如下的過程去離子水枛SC1枛去離子水枛SC2枛去離子水枛HF溶液枛去離子水枛N2氣吹干，其中SC115％NH3.H2O+15％H2O2+70％H2O，體積比SC215％HCl+15％H2O2+70％H2O，體積比DHFHF∶H2O＝1∶10，體積比；2)涂PMMA膠在硅片上懸涂10％的質(zhì)量濃度的PMMA/苯乙醚溶液，厚度用SPM測得為2μm，懸涂后，取下硅片放在170℃的烘箱中烘焙30min，使PMMA徹底固化；3)熱壓印采用的壓力為40Bar，壓印溫度為190℃，比壓印膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg＝120℃高出70℃，壓力和溫度同時加載時間為4-6min，脫模時溫度為90℃；4)利用氧等離子體反應(yīng)離子刻蝕，調(diào)整膠的厚度為10～20nm；5)真空蒸鍍鈦80～100nm和金50～60nm，其中鈦作為粘附及犧牲層；6)真空蒸鍍鎳10～15nm作為粘附層；7)真空蒸鍍銅1200～1250nm；8)電子束蒸發(fā)鎳30～50nm；9)真空蒸鍍金50～60nm；10)去膠剝離，懸浮微塊陣列芯片釋放。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法，其特征在于，所述的硅片為4英寸硅片。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法，其特征在于，步驟2所述的涂PMMA膠厚度均勻性誤差小于1%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法，其特征在于，步驟4所述的刻蝕參數(shù)為腔體壓力為35mTorr，射頻功率為15W，02流量為15sccm，在此條件下刻蝕速率為46-50nm/min。5.—種采用權(quán)利要求1制備的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，包括有如下步驟采用如下步驟進(jìn)行懸浮編碼微塊陣列芯片熒光標(biāo)記；1)清洗金塊利用無水乙醇清洗金塊3次，最后分散在無水乙醇中；2)由11-巰基羧酸在金塊上形成單分子層利用巰基與金原子強有力的結(jié)合力，在金塊表面沉積一層MUA的單分子層，為下面生物大分子的標(biāo)記提供羧基基團(tuán)；3)生物大分子標(biāo)記金塊采用碳二亞胺為交聯(lián)劑，采用鼠IgG為陽性對照標(biāo)記，雞IgG為陰性對照標(biāo)記；4)熒光檢測分別向鼠IgG標(biāo)記的金塊和雞IgG標(biāo)記的金塊中加入所要檢測的物質(zhì)，熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，步驟2所述的在金塊上形成單分子層的具體是先配置5mM的MUA無水乙醇溶液，將清洗干凈的金塊分散在MUA的無水乙醇溶液中，室溫浸泡24小時后，利用無水乙醇清洗3次，再用0.01M的PBS緩沖溶液清洗3次，最后分散在0.01M的PBS緩沖溶液中。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，步驟3所述的標(biāo)記金塊是將MUA化的金塊浸泡在1.5mL的10yg/mL的陽性對照標(biāo)記鼠IgG和陰性對照標(biāo)記雞IgG中，再向所述體系加入50L的EDC水溶液，室溫反應(yīng)2小時后，利用PBS洗滌3次，最后分散在0.01M的PBS緩沖溶液中保存。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的應(yīng)用方法，其特征在于，步驟4所述的熒光檢測具體是分別向鼠IgG標(biāo)記的金塊和雞IgG標(biāo)記的金塊中加入0.lmg/mL的10iiLFITC-羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)30min后，PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果。全文摘要一種具有磁性的懸浮編碼微塊陣列芯片的制備方法及應(yīng)用方法。制備方法1)選用5片相同的硅片清洗、烘干；2)涂PMMA膠；3)熱壓印；4)利用氧等離子體反應(yīng)離子刻蝕，調(diào)整膠的厚度為10～20nm；5)真空蒸鍍鈦80～100nm和金50～60nm，鈦作為粘附及犧牲層；6)真空蒸鍍鎳10～15nm作為粘附層；7)真空蒸鍍銅1200～1250nm；8)電子束蒸發(fā)鎳30～50nm；9)真空蒸鍍金50～60nm；10)去膠剝離，懸浮微塊陣列芯片釋放。應(yīng)用方法1)清洗金塊；2)由11-巰基羧酸在金塊上形成單分子層；3)生物大分子標(biāo)記金塊；4)熒光檢測。本發(fā)明制備出的芯片具有超順磁特性，從而為生物修飾及生物磁分離創(chuàng)造了條件。文檔編號B81C1/00GK101693514SQ20091030875公開日2010年4月14日申請日期2009年10月23日優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日發(fā)明者吳元慶,姚素英,徐江濤,高靜,高鵬申請人:天津大學(xué);