本發(fā)明涉及化工分離領(lǐng)域，尤其涉及一種高效分離生物大分子的方法及所用碟片式螺旋管柱管柱。

背景技術(shù)：

逆流色譜技術(shù)是近30年發(fā)展起來的一種基于液液分配的色譜分離技術(shù)，其原理是利用多層纏繞的螺旋管分離柱在行星運(yùn)動時產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩種液體在分離柱中保留其中的一相(固體相)，再利用恒流泵向分離柱連續(xù)輸入另一相(流動相)。使得待分離的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，溶質(zhì)按分配系數(shù)的不同，被依次洗脫。這種儀器的優(yōu)點在于能夠完全避免傳統(tǒng)柱色譜柱中固體填料的死吸附，具有分離量大、樣品無損耗和回收率高等優(yōu)點。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域。

現(xiàn)有的逆流色譜儀按運(yùn)動方式可以分為j型同步逆流色譜儀和正交軸色譜儀。其中正交軸色譜儀由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒有商業(yè)化。目前商業(yè)化的逆流色譜儀均為j型同步逆流色譜儀，其分離柱結(jié)構(gòu)由繞管柱和繞制在其上的聚四氟乙烯管組成(圖1)，將一根聚四氟乙烯管從繞管柱的一端以平鋪方式一圏緊靠一圏,螺旋繞制到繞管柱的，繞滿第一層再在第一層基礎(chǔ)上，重疊于第一層上返回繞制第二層，按此類推，直到繞滿繞管柱。

生物大分子例如多糖、蛋白肽類等化合物通常極性很大，易溶于水。而雙水相是一種常用于分離大分子化合物的溶劑系統(tǒng)。具有高黏度、低界面張力特性，圖1所示的分離柱結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)動過程中產(chǎn)生的綜合力場已不足以使雙水相建立起良好的單向性流體動力平衡，使得雙水相在管柱里的固定相保留率很低，不能很好地與生物大分子樣品進(jìn)行混合，進(jìn)而造成分離柱效降低。因此現(xiàn)有的j型同步逆流色譜儀及其分離柱不適合生物大分子的分離。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種高效分離生物大分子的方法。針對j型同步逆流色譜儀的缺陷，對其原有的管柱結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改進(jìn)，完美解決了現(xiàn)有分離柱不能很好地保留雙水相的問題，實現(xiàn)了短時間內(nèi)高效分離生物大分子的技術(shù)效果。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種高效分離生物大分子的方法，其采用包括內(nèi)部具有多個平壓腔體，且相鄰平壓腔體之間的空間呈角度排列的聚四氟乙烯管，以及將所述聚四氟乙烯管呈漸進(jìn)式阿基米德螺線方式垂直纏繞在管柱上，疊加形成的多個片層結(jié)構(gòu)疊加的碟片式螺旋管柱的逆流色譜裝置實現(xiàn)，包括：

將生物大分子混合樣品送入所述聚四氟乙烯管中進(jìn)行進(jìn)樣洗脫，在所述聚四氟乙烯管的多個呈角度相鄰的平壓腔的作用下，使其中的生物大分子能夠高效率地與流動相、固定相之間充分混合、傳質(zhì)；

隨著所述碟片式螺旋管柱的自傳與逆流色譜裝置的公轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的由小及大的β值，所述碟片式螺旋管柱能夠同時形成漸進(jìn)式阿基米德力與旋轉(zhuǎn)向心力，并通過碟片式結(jié)構(gòu)疊加，因而使得分離系統(tǒng)的固定相有較多保留，使生物大分子成分被快速分離、洗脫，收集后得到高純度的生物大分子。

其中，所述由小及大的β值為0.3-0.8。

本發(fā)明所稱的β值是本領(lǐng)域常用的術(shù)語，是指線圈自轉(zhuǎn)半徑與線圈公轉(zhuǎn)半徑的比值。

其中，所述將待分離的生物大分子樣品進(jìn)行進(jìn)樣洗脫之前，包括：

將待分離生物大分子溶解到雙水相分離體系中，設(shè)置所述逆流色譜裝置的洗脫參數(shù)，當(dāng)所述逆流色譜平衡后，再將待分離的生物大分子樣品注入儀器，進(jìn)行洗脫。

其中，所述聚四氟乙烯管的相鄰平壓腔的空間排列角度為0-180°。

優(yōu)選地，所述排列角度為0°-90°

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述排列角度為30°-90°。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述排列角度為45°-70°。

尤其是，所述在管柱上形成的多個片層結(jié)構(gòu)的聚四氟乙烯管只有一條，保證了洗脫的連續(xù)性，以及分離質(zhì)量。

其中，所述聚四氟乙烯管的內(nèi)徑為1.0-5.0mm。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述聚四氟乙烯管的的內(nèi)徑為1.6mm。

其中，所述壓痕形成的平壓腔的長度為5-20mm，優(yōu)選地為15mm。

作為優(yōu)選地，所述壓痕形成的平壓腔的高度為1-4mm，進(jìn)一步優(yōu)選地高度1mm。

其中，所述管柱包括：

與所述逆流色譜裝置連接的管柱支撐；

設(shè)置于管柱支撐上的用于使所述聚四氟乙烯管形成多個片層結(jié)構(gòu)的多個平行擋板；以及位于相鄰的所述擋板之間，用于纏繞放置所述ptfe管形成的片層結(jié)構(gòu)的定位槽。

其中，所述片層結(jié)構(gòu)的層數(shù)為5-17層。

其中，所述一個片層結(jié)構(gòu)上聚四氟乙烯管纏繞在管柱上的圈數(shù)為5-12圈。

其中，所述多個片層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的螺距為2-5mm。

其中，所述生物大分子為分子量為多糖或肽類化合物。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明再提供一種高效分離生物大分子的高速逆流色譜柱管柱，其特征在于，包括：

其內(nèi)部具有多個平壓腔且相鄰平壓腔之間的空間呈角度排列的聚四氟乙烯管；

使所述聚四氟乙烯管呈漸進(jìn)式阿基米德方式纏繞，并在其垂直方向疊加形成多個片層結(jié)構(gòu)的管柱。

其中，所述聚四氟乙烯管的相鄰平壓腔的空間排列角度為0-180°。

優(yōu)選地，所述排列角度為0°-90°

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述排列角度為30°-90°。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述排列角度為45°-70°。

尤其是，所述在管柱上形成的多個片層結(jié)構(gòu)的聚四氟乙烯管只有一條，保證了洗脫的連續(xù)性，以及分離質(zhì)量。

其中，所述聚四氟乙烯管的內(nèi)徑為1.0-5.0mm。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述聚四氟乙烯管的的內(nèi)徑為1.6mm。

其中，所述壓痕形成的平壓腔的長度為5-20mm，優(yōu)選地為15mm。

作為優(yōu)選地，所述壓痕形成的平壓腔的高度為2-4mm，進(jìn)一步優(yōu)選地高度1mm。

其中，所述管柱包括：

與所述逆流的色譜裝置連接管柱支撐；

設(shè)置于管柱支撐上的用于使所述聚四氟乙烯管疊加形成多個片層結(jié)構(gòu)的多個平行擋板；以及位于相鄰的所述擋板之間，用于纏繞放置所述聚四氟乙烯管形成的片層結(jié)構(gòu)的定位槽。

其中，所述片層結(jié)構(gòu)的層數(shù)為5-17層。

其中，所述一個片層結(jié)構(gòu)上聚四氟乙烯管纏繞在管柱上的圈數(shù)為5-12圈。

其中，所述多個片層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的螺距為2-5mm。

特別是，所述生物大分子為分子量為多糖或肽類化合物。

特別是，所述管柱用于j型高速逆流色譜儀。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明還提供一種高效分離生物大分子的高速逆流色譜儀，其具有上述的管柱結(jié)構(gòu)。

特別是，所述高速逆流色譜儀適用于八種洗脫模式，包括l-i-t、l-i-h、l-o-t、l-o-h、u-i-t、u-i-h、u-o-t和u-o-h。其中l(wèi)和u分別表示雙水相的下相和上相，i和o分別表示從管柱片層的內(nèi)層和外層進(jìn)樣，t和h分別表示“ptfe管的進(jìn)樣從尾端到首端，和聚四氟乙烯管的進(jìn)樣從首端到尾端的洗脫模式。

有益效果：

1、本發(fā)明提供的分離生物大分子的方法，采用包括內(nèi)部具有多個壓痕形成的平壓腔體且相鄰平壓腔體之間呈空間角度排列的聚四氟乙烯管，樣品在平壓腔體的管路里面會產(chǎn)生翻轉(zhuǎn)，使高粘度的生物大分子在管路中更加充分、徹底地與固定相、流動相混合，解決了生物大分子不能在雙水相中很好的混合及保留的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明提供的分離生物大分子的方法，采用了可將聚四氟乙烯管呈漸進(jìn)式阿基米德方式纏繞的管柱，使β值分布、疊加產(chǎn)生一個漸進(jìn)式阿基米德力，能夠使雙水相的固定相得到較多的保留，提高了生物大分子的分離效率，縮短分離時間。

3、本發(fā)明提供的分離方法及裝置可以通過調(diào)整聚四氟乙烯管的總體積，纏繞圈數(shù)、管柱層數(shù)，甚至一個平壓腔體積或螺距距離來控制分離時間和分離效果，使用方便，適用范圍廣。

附圖說明

圖1是現(xiàn)有技術(shù)中的管柱結(jié)構(gòu)；

圖2是本發(fā)明提供的碟片式螺旋管柱結(jié)構(gòu)示意圖，圖2a為逆流色譜主機(jī)；圖2b為聚四氟乙烯管在管柱上以阿基米德螺旋方式纏繞形成的呈碟片式結(jié)構(gòu)；圖2c為管柱支撐；圖2d為聚四氟乙烯管壓痕形成的平壓腔的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中，1、管柱，11、呈角度排列的相鄰平壓腔；2、聚四氟乙烯管，21、管柱支撐，22、平行擋板，23、定位槽。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖，下列實施例中未注明具體結(jié)構(gòu)的，通常采用常規(guī)結(jié)構(gòu)，未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照文獻(xiàn)常規(guī)條件。

實施例1碟片式螺旋管柱

如圖2所示，本發(fā)明提供的碟片式螺旋管柱包括：聚四氟乙烯管1；和使所述聚四氟乙烯管以一定螺距方式，呈漸進(jìn)式阿基米德方式纏繞，并在其垂直方向使聚四氟乙烯管形成多個片層結(jié)構(gòu)的管柱2。

進(jìn)一步地，聚四氟乙烯管1內(nèi)部具有多個呈角度排列的平壓腔11。

進(jìn)一步地，所述管柱包括：與所述逆流的色譜裝置連接管柱支撐21；設(shè)置于管柱支撐上的用于使所述聚四氟乙烯管形成多個片層結(jié)構(gòu)的多個平行擋板22；以及位于相鄰的所述擋板之間，用于纏繞放置所述聚四氟乙烯管形成的片層結(jié)構(gòu)的定位槽23。

其中，所述管柱為圓柱形。

其中，所述聚四氟乙烯管是由市售的聚四氟乙烯管經(jīng)過壓制獲得。

本發(fā)明巧妙地將聚四氟乙烯管呈碟片式地以阿基米德螺旋螺旋方式纏繞在管柱支撐上，由于管柱支撐上的聚四氟乙烯管的多層排列中的每層排列都以阿基米德螺旋方式纏繞，因此每層的阿基米德螺旋纏繞都產(chǎn)生由小及大的β值，當(dāng)待分離樣品經(jīng)過管柱的每層纏繞都會在由小及大的β值范圍內(nèi)發(fā)生分配，即在小β值的柱體系時，中間溶劑的流體動力學(xué)特征同親水性溶劑相近，能使疏水性溶劑體系的單向性流體動力學(xué)分布反向；反之，在大β值的柱體系時，中間溶劑的流體動力學(xué)特征同疏水性溶劑相近，導(dǎo)致親水性溶劑體系的單向性流體動力學(xué)分布反向。因此，每一次經(jīng)過多層的分配后，分離時間被極大地縮短，相對于傳統(tǒng)的聚四氟乙烯纏繞方式的分離時間，縮短了一倍以上的時間。

此外，本發(fā)明同時巧妙地將常用的聚四氟乙烯管進(jìn)行了處理，使聚四氟乙烯管內(nèi)部形成多個平壓腔體，且相鄰平壓腔之間呈角度排列，當(dāng)待分離樣品流經(jīng)聚四氟乙烯管中的每個平壓腔中都會產(chǎn)生方向變化，促使待分離樣品中的形成生物大分子與流動相之間充分混合、傳質(zhì)，使生物大分子較多的保留在流動相中，極大的提高了分離效率。

將本發(fā)明采用了處理的聚四氟乙烯管，以本發(fā)明的纏繞方式纏繞在管柱支撐上，不僅打破了現(xiàn)有技術(shù)中的分離時間記錄，還將現(xiàn)有技術(shù)的分離效果提高了3倍以上，取得了非常顯著的技術(shù)效果，為本領(lǐng)域技術(shù)做出了極大的貢獻(xiàn)，市場效益巨大。

實施例2

采用內(nèi)徑1.6毫米的聚四氟乙烯管制得本發(fā)明的管線，總體積300ml。管柱支撐半徑為8厘米，β值＝0.2-0.5，平壓腔長度為3毫米，寬度為2毫米，高度為1毫米，所述相鄰平壓腔體的空間角度為45°。管路螺距為2.4毫米，每層纏繞5圈，總共5層的上述實施例1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行多糖分離、分析，多糖具體分離操作方法如下：

以peg1000/k2hpo4/kh2po4(14％peg1000,16％k2hpo4，和14％k2hpo4,wt％)作為雙水相分離系統(tǒng)。20mg葡聚糖t10(分子量1萬)、20mg葡聚糖t50(分子量5萬)溶解于5ml上相與下相混合液中作為分離樣品。以上相作為固定相，下相為流動相，管柱轉(zhuǎn)速500rpm。采用“l(fā)-i-h”洗脫模式，洗脫流速為2.0ml/min。系統(tǒng)平衡好以后，將分離樣品進(jìn)樣洗脫。每10ml收集1管，采用硫酸苯酚法在490nm檢測，確定多糖成分是否洗脫下來；采用激光多角度檢測器確定被洗脫的多糖分子量，統(tǒng)計并計算分離時間、葡聚糖t50的理論塔板數(shù)、葡聚糖t50的理論塔板數(shù)、分離度，計算結(jié)果如表1所示。

實施例3

采用內(nèi)徑1.6毫米的聚四氟乙烯管制得本發(fā)明的管線，管柱支撐半徑為10厘米，β值＝0.3-0.6。平壓腔距離為10毫米，寬度為2毫米，高度為1毫米，所述相鄰平壓腔體的空間角度為45°。管路螺距為3.6毫米，每層纏繞8圈，總共15層的上述實施例1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行多糖分離分析，多糖具體分離操作方法同實施例2。

實施例4

采用內(nèi)徑3.0毫米的聚四氟乙烯管制得本發(fā)明的聚四氟乙烯管，總體積500ml。管柱支撐為10厘米，β值＝0.3-0.6，平壓腔長度為5毫米，寬度為2毫米，高度為1毫米，所述相鄰平壓腔體的空間角度為45°。管路螺距為3.6毫米，每層纏繞12圈，總共17層的上述實施例1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行多糖分析，多糖具體分離操作方法同實施例2，洗脫速度為5.0ml/min，其他參數(shù)相同。

實施例5

儀器結(jié)構(gòu)與參數(shù)與實施例1完全相同，用于分離二肽。以正丁醇–乙酸–水(4:1:5,v/v/v)作為分離系統(tǒng)。25mg色氨酸-酪氨酸、100mg纈氨酸-酪氨酸二肽混合物溶解于10ml上相與下相混合液中作為分離樣品。以上相作為固定相，下相為流動相，轉(zhuǎn)速500rpm。采用“l(fā)-i-h”洗脫模式，洗脫流速為2.0ml/min。系統(tǒng)平衡好以后，分離樣品進(jìn)樣洗脫。每10ml收集1管，采用硫酸苯酚法在490nm檢測，確定多糖成分是否洗脫下來；采用激光多角度檢測器確定被洗脫的多糖分子量，統(tǒng)計并計算分離時間、dextrant50的理論塔板數(shù)、dextrant50的理論塔板數(shù)、分離度，計算結(jié)果如表1所示。

對比例1

所述相鄰平壓腔體的空間角度為90°，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例2

除采用常規(guī)的聚四氟乙烯管外，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例3：

除采用每層纏繞3圈，總共3層外，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例4：

除采用每層纏繞15圈，總共17層外，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例5：

除采用管柱為傳統(tǒng)圓柱形結(jié)構(gòu)(見圖1)外，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例6：

除采用管柱為圓柱形結(jié)構(gòu)(見圖1)、聚四氟乙烯管為傳統(tǒng)的沒有經(jīng)過處理的聚四氟乙烯外，其它結(jié)構(gòu)及具體分離方法均與實施例2相同，測得結(jié)果如表1所示。

對比例7：

除采用管柱為圓柱形結(jié)構(gòu)(見圖1)、聚四氟乙烯管為傳統(tǒng)的沒有經(jīng)過處理的聚四氟乙烯外，其它結(jié)構(gòu)及具體二肽的分離方法均與實施例5相同，測得結(jié)果如表1所示。

表1分離效果表(n＝5)

*實施例5與對比例7的樣品為色氨酸-酪氨酸和纈氨酸-酪氨酸，其他樣品為葡聚糖t10和葡聚糖t50。

從表1的數(shù)據(jù)可見，通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的逆流色譜儀管柱能夠在較短的時間(82-99分鐘)產(chǎn)生較好的多糖分離效果(分離度1.53-2.59)，在105分鐘可以產(chǎn)生較好的二肽分離效果(分離度1.51)。

根據(jù)表1中實施例3和實施例4可以看出，不同平壓腔長度、不同層數(shù)及圈數(shù)都會對分離效果產(chǎn)生影響，但是相對于現(xiàn)有技術(shù)的管柱(例如對比例5)的分離時間顯著縮短，而分離度顯著提高。

將表1中實施例2與對比例1的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，只使用本發(fā)明的管柱結(jié)構(gòu)，雖然采用本發(fā)明的帶有平壓腔的聚四氟乙烯管，但是空間平壓腔角度為90°雖然分離時間僅需要89min，但是其分離度只有0.85，僅為本發(fā)明實施例2的一80％。

將表1中實施例2與對比例2的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，只使用本發(fā)明的管柱結(jié)構(gòu)，而不采用本發(fā)明的帶有平壓腔的聚四氟乙烯管，分離時間為117min，其分離度只有0.56，僅為本發(fā)明實施例2的一半。

將表1中實施例2與對比例3、對比例4比較可知，改變每層的圈數(shù)與纏繞的層數(shù)也會影響分離時間與分離效果，圈數(shù)及層數(shù)過少或過多都不會得到本發(fā)明的技術(shù)效果，例如對比例3僅纏繞3層，每層3圈，其分離時間雖然只要74min，但是分離度只有0.34，而對比例4纏繞17層，每層15圈其分離度相較于對比例2雖然有所提高，達(dá)到0.66，但是其分離時間長達(dá)115min，可見，在一定的聚四氟乙烯容積范圍內(nèi)，設(shè)置不同纏繞層數(shù)及每層的圈數(shù)對分離效果及分離效率是有幫助的，超過一定限度，則不會提高分離效果及效率。

將表1中實施例2與對比例5的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，將本發(fā)明的聚四氟乙烯管應(yīng)用于傳統(tǒng)的管柱，雖然分離度可以達(dá)到0.84，但是其分離時間長達(dá)222min，是本發(fā)明實施例2所用時間的2.4倍。

將表1中實施例2與對比例6的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，采用傳統(tǒng)的分離柱，其分離時間長達(dá)218min，分離度只有0.77，但是，是本發(fā)明實施例2所用時間的2.36倍。

將表1中實施例5與對比例7的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，采用傳統(tǒng)的分離柱，其分離二肽時間長達(dá)201min，分離度只有0.83，但是，是本發(fā)明實施例5所用時間的1.9倍。

本發(fā)明的特點在于：

1、采用內(nèi)部具有多個平壓腔體，且相鄰平壓腔體之間呈空間角度排列的聚四氟乙烯管；

2、采用具有使所述聚四氟乙烯管形成多個片層結(jié)構(gòu)的圓環(huán)狀擋板，以及位于相鄰的擋板之間，用于纏繞放置所述聚四氟乙烯管形成片層結(jié)構(gòu)的定位槽的管柱支撐結(jié)構(gòu)；

3、將聚四氟乙烯管以阿基米德螺旋螺旋方式在管柱上進(jìn)行多層纏繞的纏繞方式。

上述特點是本發(fā)明人基于大量聚四氟乙烯管結(jié)構(gòu)、管柱結(jié)構(gòu)以及聚四氟乙烯管在管柱上的纏繞方式等多方面進(jìn)行的實驗研究和驗證才得以實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果，本申請采用上述特點打破了傳統(tǒng)的分離方法及管柱結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了高效率分離生物大分子的技術(shù)目的，分離效率是現(xiàn)有技術(shù)的三倍以上。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。