專利名稱：一種基于三維水力聚焦的微混合裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于三維水力聚焦的微混合裝置，能將樣品溶液在三維角度聚焦成微米束，實現溶液的快速混合，廣泛用于生物大分子的動力學研究領域。
背景技術：
微流控芯片實驗室又稱微流控芯片(microfluidics)或芯片實驗室 (lab-on-a-chip)，指的是在一塊幾平方厘米的芯片上構建的化學或生物實驗室。這種分析系統(tǒng)尺寸微小，可以集成進樣、預處理、混合、反應、檢測等操作單元，從而讓分析時間大幅縮短，檢測分辨率/靈敏度顯著提高，同時消耗及成本也大幅降低?，F階段，微流控芯片已經涉及到的領域包括疾病診斷、藥物篩選、環(huán)境檢測、食品安全、司法鑒定、體育競技以及反恐、航天等事關人類生存質量的方方面面?？焖俣行У幕旌鲜腔瘜W或生物化學分析的前提。生化反應，如RNA或蛋白質的折疊過程通常發(fā)生在亞毫秒級別，若研究此類反應必須在微秒級時間內啟動它們。微混合器作為微流控芯片中一個重要組成部分，由于其能使溶液實現快速混合且所耗樣品在納升級，因此已經成為研究快速生化反應的一個有效工具。由于微通道中雷諾數一般較低(< 2300)，難于引起湍流，溶液的混合一般都基于擴散。根據擴散理論，擴散時間T = L2/D，其中L為通道的寬度，D為溶液的擴散系數。為達到1 μ s的混合時間，則樣品帶需被夾擠成30nm。為實現溶液的快速混合，Brody等人 (Brody, J. P. and Yager，P. (1996)Biotechnology at low Reynolds numbers，Biophys. J.，71，3430-3441)最早設計出基于水力聚焦的微裝置，使樣品帶溶液聚焦成 0. 1 μ m，混合時間為 10 μ S。其后又有大量科研學者將水力聚焦混合器裝置進行改進，使得混合時間縮短至 Ius (Yao, S. and Bakajin, 0. (2007) Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies ofProtein Folding Kinetics. Anal. Chem. 79,5753-5759)。該基于水力聚焦的微流控芯片是目前已報道的混合器中混合時間最短的微裝置，但其樣品帶只是從二維角度(XY平面)進行擠壓聚焦，在Z軸方向仍然沒有實現聚焦，即實現的是二維水力聚焦OD hydrodynamic focusing)。二維水力聚焦的不足之處在于，樣品帶的流速在Z軸方向并不均一，靠近通道壁的流速接近為零，遠小于Z軸中間面的流速，這種情況非常不利于對樣品進行真實的分析(如分析蛋白質等大分子在折疊過程中其折疊態(tài)隨時間的變化)。為解決二維水力聚焦所存在的問題，有人提出三維水力聚焦 (3D hydrodynamic focusing)的概念。Pabit等人在2002年較早設計了一種三維水力聚焦裝置(Pabit, S. and Hagen, S. (2002) Laminar-Flow Fluid Mixer for Fast Fluorescence Kinetics Studies, Biophys. J.，83，28724878)，即將直徑大小不同的兩毛管對接實現三維聚焦，但這種對接操作困難，且由于對樣品帶的側向夾流有限難以將樣品帶聚焦成納米級條帶。Gambin等人在2010年報道了一種用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料加工的三維水力聚焦微芯片(Gambin, Y. and Simonnet, C. (2010)Ultrafast microfluidic mixer with three-dimensional flow focusing for studies of biochemical kinetics, Lab Chip,
310，598-609)，其混合時間為 10ys。但是該裝置通道結構復雜，僅入口數量就有五個之多，給進樣過程帶來諸多麻煩，且會影響到實驗過程中聚焦樣品帶的穩(wěn)定性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有三維水力聚焦微裝置結構復雜，加工難度大且實驗操作過程繁瑣的缺點，提供一種結構簡單，加工簡易，三維聚焦效果好的微混合裝置。本發(fā)明的另一目的是提供上述微混合裝置的加工方法?！N三維聚焦微混合裝置，包括鍵合為一體的基片和蓋片，基片和蓋片上內表面加工有相同的微通道結構，所述微通道結構包括相連通的四通道，其中第一和第三通道作為邊路入口通道，第二通道作為中間入口通道，第四通道作為出口通道，中間入口通道與出口通道在同一直線上，兩邊路入口通道關于中間入口通道對稱，中間入口通道的高度低于另外三個通道。進一步地，所述中間入口通道與邊路入口通道的夾角小于90度。所述的三維聚焦微混合裝置的加工方法，包括雙層陽模加工步驟在硅片上同一位置處先后軟光刻兩層微通道結構，其中第一層微通道結構包括兩邊路入口通道、中間入口通道和出口通道，第二層微通道結構包括兩邊路入口通道和出口通道；基片和蓋片加工步驟利用所述雙層陽模分別加工PDMS基片和PDMS蓋片；基片與蓋片鍵合步驟將基片與蓋片的微通道結構相對進行鍵合。進一步地，在雙層陽模上勻上一層液態(tài)PDMS，再將蓋玻片貼于液態(tài)PDMS表面進行固化。本發(fā)明提出了一種三維水力聚焦效果的微混合裝置和加工方法，先加工出通道高度不一樣的雙層陽模結構，其后將具有相同微通道結構的PDMS基片與蓋片鍵合，從而得到邊路入口通道高度和中間入口通道高度不一樣的三維結構，可以實現邊路入口樣品對中間入口樣品的三維包裹，即形成三維聚焦。該裝置能實現樣品帶在XY方向被聚焦成亞微米水平，在^方向聚焦成微米水平。整個裝置結構簡單，加工簡易，三維聚焦效果好。該裝置在研究生物大分子折疊動力學領域具有廣泛的應用前景，并為溶液的三維聚焦提供了一種新的途徑。


圖1兩層通道結構尺寸示意圖，1 (a)為第一層通道結構示意圖，1 (b)為第二層通道結構示意圖，1(c)雙層通道平面結構示意圖。圖2雙層通道立體結構示意圖。圖3基片PDMS微通道加工示意圖。圖4水力聚焦微混合器夾流效果示意圖，4 (a)三維水力聚焦混合器XY平面上的夾流效果圖，4(b)不同夾流比下常規(guī)二維水力聚焦混合器的重建縱切面聚焦效果圖，4(c)不同夾流比下三維水力聚焦混合器的重建縱切面聚焦效果圖。圖5三維水力聚焦微混合器上化學發(fā)光實驗結果示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。一種三維聚焦微混合裝置，包括鍵合為一體的基片和蓋片，基片和蓋片內表面加工有相同的微通道結構。如圖3所示，所述微通道結構包括相連通的四通道，其中第一和第三通道1，3作為邊路入口通道，第二通道2作為中間入口通道，第四通道4作為出口通道， 中間入口通道與出口通道在同一直線上，兩邊路入口通道關于中間入口通道對稱，中間入口通道的高度低于另外三個通道。所述中間入口通道與邊路入口通道的夾角小于90度。上述三維聚焦微混合裝置的加工方法，包括雙層陽模加工步驟在硅片上同一位置處先后軟光刻兩層微通道結構，其中第一層微通道結構包括兩邊路入口通道、中間入口通道和出口通道，第二層微通道結構包括兩邊路入口通道和出口通道；基片和蓋片加工步驟利用所述雙層陽模分別加工PDMS基片和PDMS蓋片；基片與蓋片鍵合步驟將基片與蓋片的微通道結構相對進行鍵合。所述基片加工步驟具體為在雙層陽模上勻上一層液態(tài)PDMS，再將蓋玻片貼于液態(tài)PDMS表面，固化后將二者一起揭起即得到基片。下面給出一個實例的加工過程，具體為1.第一層SU-8陽模加工。先將SU-8甩于洗凈烘干的硅片上(700r 18s, 4500r60s)，前烘除去SU-8膠中的溶劑之后(65°C 15min,95°C 40min)，進行第一次光刻 (40s, 3. 5mJ/cm2)，然后置于熱平板上進行后烘(65°C 15min,95°C 40min)，之后經顯影液顯影后，再進行堅膜(135°C 120min)，即可得得到第一層陽模(高度為15 μ m)，其通道結構示意圖見圖la，兩邊路入口通道與中間入口通道的夾角為45度，其中A.邊路通道入口孔，半徑為40μπι;Β.邊路入口通道，寬為60 μ m;C.中間通道入口孔，半徑為40 μ m ;D.中間入口通道,寬為30μπι;Ε.出口通道，寬為60 μ m;F.出口孔，半徑為40 μ m。2.第二層SU-8陽模加工。得到第一層SU-8陽模結構后，在其上再進行第二次勻膠(700r 18s, 1500r 60s)、前烘(65 °C 15min，95°C 120min)、光刻(330s，lmj/cm2)。經過對準并曝光后，再進行后烘、顯影、堅模，即得到總高度為45 μ m的雙層陽模。第二層陽模通道具體結構見圖lb，其通道尺寸與第一層陽模通道對應位置的尺寸一致。雙層陽模結構的平面圖見圖lc，粗線條表示經第二次曝光后第一層和第二層通道重疊部分；圖2為雙層陽模的立體結構示意圖。第二次光刻在德國Karl-Suss MA6型光刻機上進行，其光刻具體操作過程為，先在顯微鏡下將掩膜上目標位置移至視野中央，然后卸載掩膜，將甩了第二次SU-8膠的硅片至于載物托盤上，將硅片上目標位置移至視野中央，使其與之前掩膜上的目標處在大致相同的位置。然后將掩膜重新裝上儀器，設定掩膜與硅片間的間隔(gap)為10 μ m，使托盤抬起， 讓掩膜與硅片靠近。經過顯微鏡聚焦后，通過前后、左右及旋轉調節(jié)桿讓掩膜上的目標與硅片上的目標達到精確對準，即可進行曝光。3.含有微通道的PDMS蓋片與基片制作。蓋片采用快速成型方法將微通道復制到 PDMS層上。即將PDMS與其固化劑按10 1混勻并除氣得到前聚體，將PDMS前聚體倒于陽模上，熱平板上65度固化4小時，將固化后的PDMS揭起、切邊并用外徑為0. 7mm的不銹鋼針管打上孔，此法得到的PDMS作為蓋片。基片的加工略有不同(見圖3)。其加工方法為將硅片(圖3中N所指為硅片)上的陽模(圖3中M所指為陽模)表面用三甲基氯硅烷蒸汽進行處理之后(該試劑可減小硅片和PDMS之間的吸附)，倒2gPDMS(圖3中P所指為PDMS)前聚體于陽模之上，在勻漿機上鋪平甩薄(700rl8s)，將洗凈的蓋玻片(圖3中Q 所指為蓋玻片)用等離子體清洗器處理(電壓800v，氧氣量600-800mL/min，2min)，然后用鑷子將蓋玻片被處理過的一面小心貼于PDMS上，用鑷子輕壓蓋玻片以排除產生的氣泡并讓蓋玻片盡量與硅片上的陽?？拷笾劣跓崞桨迳瞎袒?100°C lh)。固化完成后，用鉆石刃口刀片將蓋玻片和PDMS薄層一起小心剝起(剝離過程中可滴加乙醇于PDMS和硅片之間減小表面吸附力)。此法得到的PDMS薄層，其上有通道，且與蓋玻片緊貼在一起，被用作該裝置的基片。4.基片與蓋片鍵合。得到基片與蓋片后，將之一起至于等離子體清洗器中處理 (電壓800v，氧氣量600-800mL/min，2min)，讓有通道的一面朝上。取出處理后的基片與蓋片，將基片至于一次性培養(yǎng)皿中(等離子體處理過的表面朝上)，在蓋片被處理表面滴加幾滴超純水，在立式顯微鏡下進行精確對準。之后，將對準的基片和蓋片至于真空烘箱中，抽真空至-0.9個大氣壓，65°C 120min加熱。取出鍵合好的芯片，再插上連有聚四氟乙烯管的不銹鋼針管用于將外界溶液引入芯片之中。至此，三維水力聚焦微混合裝置得以制作完成。三維水力聚焦微混合裝置完成后，我們先用熒光素標記的多糖分子(分子量為 10,OOODa)作為樣品，采用微量注射泵從混合器中間入口通道通入，兩邊路入口通道所通溶液為超純水，改變邊路入口通道與中間入口通道的流速比，以共聚焦顯微成像系統(tǒng) (FV1000,Olympus, Japan)對通道Z軸方向上不同層面熒光進行圖像采集。圖4(a)為三維水力聚焦混合器在V邊路V中丨旬路Vw= 0. 063 0.001 0. O63 (單位mL/min)時，XY平面上的夾流效果圖，中間樣品帶的聚焦寬度為 400nm。作為對照，我們同時也在常規(guī)的三路水力聚焦混合器(二維聚焦)上進行了此實驗。在不同的流量比下Vtllffi，單位 mL/min)，將不同層面采集到的熒光圖像用Matlab軟件進行縱截面重建，其重建效果圖見圖4b，可見常規(guī)的三路水力聚焦混合器只能實現二維的聚焦，其重建縱截面熒光分布類似凹透鏡；而本發(fā)明所設計的三維水力聚焦混合器其重建縱截面熒光分布(圖4c)類似一個小橢圓，即樣品帶主要分布在通道正中央，實現了三維聚焦，其在XY平面樣品帶被聚焦的寬度約為400nm(圖如)，H平面樣品帶寬度為10 15 μ m(通道在H平面的總高度為 90 μ m)。其后，我們又采用luminol (魯米諾)-HRP (辣根過氧化物酶)化學發(fā)光體系對三維水力聚焦微混合器進行了評價，用微量注射泵將HRP從混合器中間入口通道通入，而發(fā)光劑(包括luminol，對碘苯酚，雙氧水)從兩邊路入口通道通入。通過改變邊路通道和中間通道的流速比，使中間樣品帶被夾擠成不同寬度，從而改變邊路通道溶液擴散至中間通道的時間(即混合時間)，最終導致化學發(fā)光反應發(fā)出的光強有所差異，其規(guī)律為夾流比越大中間樣品帶聚焦越細(即混合時間越短)，反應所發(fā)出的最大光強越大(見圖5，
邊路V中間路=0· 03 0· 00Θ，b· V邊路V中間路=0· 03 0. 006, c· V邊路V中間路=
0. 03 0.00；3)。
權利要求
1.一種三維聚焦微混合裝置，包括鍵合為一體的基片和蓋片，基片和蓋片上內表面加工有相同的微通道結構，其特征在于，所述微通道結構包括相連通的四通道，其中第一和第三通道作為邊路入口通道，第二通道作為中間入口通道，第四通道作為出口通道，中間入口通道與出口通道在同一直線上，兩邊路入口通道關于中間入口通道對稱，中間入口通道的高度低于另外三個通道。
2.根據權利要求1所述的三維聚焦微混合裝置，其特征在于，所述中間入口通道與邊路入口通道的夾角小于90度。
3.權利要求1所述的三維聚焦微混合裝置的加工方法，包括雙層陽模加工步驟在硅片上同一位置處先后軟光刻兩層微通道結構，其中第一層微通道結構包括兩邊路入口通道、中間入口通道和出口通道，第二層微通道結構包括兩邊路入口通道和出口通道；基片和蓋片加工步驟利用所述雙層陽模分別加工PDMS基片和PDMS蓋片；基片與蓋片鍵合步驟將基片與蓋片的微通道結構相對進行鍵合。
4.根據權利要求3所述的加工方法，其特征在于，所述基片加工步驟具體為在雙層陽模上勻上一層液態(tài)PDMS，再將蓋玻片貼于液態(tài)PDMS表面進行固化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于三維水力聚焦的微混合裝置，括鍵合為一體的基片和蓋片，基片和蓋片上內表面加工有相同的微通道結構，所述微通道結構包括相連通的四通道，其中第一和第三通道作為邊路入口通道，第二通道作為中間入口通道，第四通道作為出口通道，中間入口通道與出口通道在同一直線上，兩邊路入口通道關于中間入口通道對稱，中間入口通道的高度低于另外三個通道。本發(fā)明還提供了該裝置的加工方法。本發(fā)明實現樣品帶在XY方向被聚焦成亞微米水平，在YZ方向聚焦成微米水平，整個裝置結構簡單，加工簡易，三維聚焦效果好。
文檔編號B01F13/00GK102513011SQ20111037796
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權日2011年11月24日
發(fā)明者劉欣, 劉筆鋒, 劉超, 徐友志, 李穎 申請人:華中科技大學