專利名稱：：一種測(cè)定氯代甲酸9-芴甲酯純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及液相色譜分析方法，具體涉及氯代甲酸9-芴甲酯的液相色譜分析方法。氯代甲酸9-芴甲酯(簡(jiǎn)稱Fmoc-Cl)是一種無(wú)色或淺黃色針狀晶體，熔點(diǎn)61.563°C，分子式C15HC102，分子量258.5，結(jié)構(gòu)式為氯代甲酸9-芴甲酯分子中含有活潑的氯原子，是有機(jī)合成的重要原料。它廣泛地應(yīng)用于提供羰基的有機(jī)合成，可以和醇、醛、胺、酰胺、羧酸、酚、羥胺等反應(yīng)，還可以用作氯化劑、脫水劑、烴化劑、保護(hù)劑和活化劑。目前，氯代甲酸9-芴甲酯主要用作肽合成和抗血栓類(lèi)藥物的中間體，國(guó)外對(duì)其合成和應(yīng)用的研究報(bào)道較多。在多肽合成中傳統(tǒng)的BOC(叔丁氧基)固相合成法易出現(xiàn)肽鏈斷裂現(xiàn)象，產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，尤其不適于合成含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定氨基酸的肽類(lèi)。由于Fmoc-Cl是堿敏感保護(hù)基，F(xiàn)moc基團(tuán)又有大的空間位阻，在合成氨基酸過(guò)程中，可以很好地保護(hù)碳鏈增長(zhǎng)，反應(yīng)結(jié)束后又易于脫去?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)采用新型Fmoc(芴甲氧羰基)固相合成法，具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、產(chǎn)率高及應(yīng)用面廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，F(xiàn)moc固相合成法在國(guó)外被廣泛用于合成具有各種性能的多肽，許多生物大分子如活性酶、生長(zhǎng)因子、人工蛋白等已被成功地合成。目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有公開(kāi)資料介紹Fmoc-Cl的分析方法，與其相關(guān)的技術(shù)資料也少見(jiàn)報(bào)道。上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院的周祖新、顧建生在"雙光氣法合成氯甲酸9-芴甲酯"的文章中提到產(chǎn)物的純度采用液相色譜分析，但沒(méi)有披露具體方法，更沒(méi)有披露釆用何種類(lèi)型的高效液相色譜柱及其具體操作條件。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用高效液相色譜法測(cè)定氯代甲酸9-芴甲酯
背景技術(shù)：
的方法純度的方法。發(fā)明概述一種用高效液相色譜法測(cè)定氯代甲酸9-芴甲酯的方法，其特征在于固定相為反相鍵合固定相；流動(dòng)相為水和/或有機(jī)溶劑，為便于分離在所述流動(dòng)相中加入一定量的緩沖溶液；檢測(cè)器采用多波長(zhǎng)可變紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。所述反相鍵合固定相選自十八烷基鍵合相硅膠、辛垸基鍵合相硅膠和氰基鍵合相硅膠。優(yōu)選反相C18鍵合柱，色譜柱的尺寸為長(zhǎng)1050cm，內(nèi)徑3.56mm，優(yōu)選內(nèi)徑為4.6mm。流動(dòng)相為水和/或有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑選自乙腈、四氫呋喃、環(huán)己烷、正己烷、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。當(dāng)選擇有機(jī)溶劑為流動(dòng)相時(shí)，為改善其極性以獲得最好的分離度，可在其中配入一定比例的水。流動(dòng)相較佳為乙腈和四氫呋喃。本發(fā)明方法中用于流動(dòng)相的緩沖劑選自檸檬酸-檸檬酸鈉、醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鈉、醋酸、磷酸、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、甘氨酸-鹽酸，其濃度為0.1-5%。本發(fā)明方法使用的固定相其柱溫為20-60°C，流動(dòng)相的流速為0.8-1.5ml/min;進(jìn)樣量4-20nl;檢測(cè)波長(zhǎng)為220-370nm。分析時(shí)間以1至40分鐘為宜，最優(yōu)的分析時(shí)間控制在IO分鐘之內(nèi)。發(fā)明詳述1.分離模式的確定色譜法是測(cè)定物質(zhì)純度常用的分析方法，其中以氣相色譜法和高效液相色譜法為主。本發(fā)明采用高效液相色譜法而不用氣相色譜法的構(gòu)思是考慮氯代甲酸9-芴甲酯不穩(wěn)定易分解不能用氣相色譜法分析。高效液相色譜法采用液體做流動(dòng)相，無(wú)需高溫，它不僅可以分析氯代甲酸9-芴甲酯產(chǎn)品的純度，還可以分析其中間產(chǎn)物，擴(kuò)大了它的使用范圍，提高了通用性。高效液相色譜法中常用的有液固色譜法、液液色譜法、鍵合相色譜法、親和色譜法和體積排阻色譜法。在分離模式的選擇上，本發(fā)明者考慮到氯代甲酸9-芴甲酯屬于有一定極性的多環(huán)芳烴，具有比較大的容量因子(k')值，還考慮了各種方法中柱效、分離選擇性、固定液穩(wěn)定性及檢測(cè)器靈敏度的優(yōu)劣，從而選用鍵合相色譜法?；瘜W(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。它的色譜柱柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好，幾乎對(duì)各種類(lèi)型的有機(jī)化合物都有良好的選擇性。根據(jù)鐔合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。一般地，極性較小的化合物在正相中流出較快，而極性較大的化合物在反相中流出較快?？紤]到氯代甲酸9-芴甲酯的極性較大，因此選用反相鍵合液相色譜法檢測(cè)氯代甲酸9-芴甲酯純度是適宜的。2.解決氯代甲酸9-芴甲酯遇水分解的問(wèn)題對(duì)于這類(lèi)不穩(wěn)定易水解的樣品常用的方法是采用衍生法。即柱前衍生或柱后衍生，但衍生法手續(xù)繁瑣、衍生劑價(jià)格昂貴，不是理想的測(cè)定方法。通過(guò)大量試驗(yàn)探索，采用在液相色譜法的流動(dòng)相中加入緩沖劑，既能防止氯代甲酸9-荷甲酯在水中分解，又不影響其在液相色譜柱內(nèi)的分離效果。試驗(yàn)證明在水相中加入一定量的檸檬酸-檸檬酸鈉、醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鈉、醋酸、磷酸、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、甘氨酸-鹽酸等是可行的，最優(yōu)濃度為0.1-5%。3.優(yōu)化分離條件優(yōu)化的目的是使樣品中的組分以最滿意的分離度、最短的分析時(shí)間、最低的流動(dòng)相消耗、最大的檢測(cè)靈敏度獲得完全的分離。選用的流動(dòng)相要求粘度低、紫外吸收弱、不與樣品發(fā)生作用，使用方便。反相色譜法一般使用的流動(dòng)相有甲醇、乙腈、四氫呋喃等。因氯代甲酸9-芴甲酯與甲醇發(fā)生反應(yīng)，本發(fā)明使用的流動(dòng)相可以選自水、乙腈、四氫呋喃、環(huán)己垸、正己垸、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。為改善流動(dòng)相的極性以獲得最好的分離度，可在有機(jī)相中再配入一定比例的tK。通過(guò)調(diào)節(jié)流速和進(jìn)樣量使樣品達(dá)到了很好的分離度，分析時(shí)間以1至40分鐘為佳，最優(yōu)的分析時(shí)間控制在10分鐘之內(nèi)。整個(gè)分析過(guò)程快速、準(zhǔn)確，易操作。4.檢測(cè)器及相關(guān)條件的選擇液相色譜檢測(cè)器很多，常用的有紫外-可.見(jiàn)檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)器等。本發(fā)明的構(gòu)思是選用多波長(zhǎng)可變紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。它具有可變波長(zhǎng)，可對(duì)同一物質(zhì)搜索最大吸收波長(zhǎng)，特別適合未知樣品分析方法開(kāi)發(fā)。另外，它的噪音小，基線穩(wěn)定(±0.75xl0'5AU)，有利于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.色譜柱的選擇選擇色譜柱時(shí)主要考慮了以下幾個(gè)問(wèn)題通用性好，適合分離各種化合物；分離酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)不拖尾；柱壓低，柱效高；良好的重現(xiàn)性；經(jīng)久耐用，性能穩(wěn)定；價(jià)格合理。本發(fā)明者通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)十八垸基鍵合相硅膠或辛烷基鍵合相硅膠或氰基鍵合相硅膠比較適合用于本發(fā)明的測(cè)定方法中。較好的為采用反相C18鍵合柱。尺寸為長(zhǎng)1050cm，內(nèi)徑45mm，最優(yōu)內(nèi)徑為4.6mm。選用的這種鍵合柱具有以下特點(diǎn)固定相不易被流動(dòng)相洗脫、無(wú)需飽和色譜柱、易進(jìn)行梯度洗脫、柱平衡快、使用極性范圍寬、選擇性唯一、柱容量大、溶質(zhì)不易污染柱子等。6.定量方法的確定本發(fā)明采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，即按如下式(1)進(jìn)行計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，X1:氯代甲酸9-芴甲酯的純度，％X標(biāo)標(biāo)樣的純度，％;A1:試樣中Fmoc-Cl組分的峰面積；A2:標(biāo)樣中Fmoc-dl組分的峰面積；m1:試樣的質(zhì)量，g;m2:標(biāo)樣的質(zhì)量，g。外標(biāo)法的最大優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需樣品中所有組分都被檢測(cè)到，只需對(duì)欲分析的組分做校正。采用這種定量方法可以解決待測(cè)樣品中某些組分不出峰和各組分在某一波長(zhǎng)下響應(yīng)因子不一樣帶來(lái)的誤差。因此該定量方法不僅可以分析高純度樣品，還可以分析中間純度的樣品，其應(yīng)用領(lǐng)域比其他定量方法要廣得多。試劑，其特征在于第三步測(cè)定過(guò)程；通過(guò)將本^r測(cè)試劑lml與含有金屬離子的水溶液4ml進(jìn)行混合，振蕩均勻作為樣品l,采用分子熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定值a;取本制劑與lml與4ml純凈水混和，振蕩均勻作為樣品2，采用分子熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定值為b;計(jì)算a/b，然后用a/b值與各響應(yīng)金屬離子標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)曲線值進(jìn)行對(duì)照，獲得其中水溶液中金屬離子的信息。二鈉-檸檬酸、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸(分析純)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相和溶液用水均為二次蒸餾水。操作步驟1、配制標(biāo)樣溶液稱取Fmoc-Cl標(biāo)樣25mg(稱準(zhǔn)至O.lmg)于潔凈干燥的100mL容量瓶中，用有機(jī)相流動(dòng)相做溶劑(色譜純)稀釋至刻度，用超聲波脫氣溶解10分鐘，混合搖勻后作為分析標(biāo)樣。2、配制待測(cè)樣品溶液稱取Fmoc-Cl試樣25mg(稱準(zhǔn)至O.lmg)于潔凈干燥的100mL容量瓶中，用有機(jī)相流動(dòng)相做溶劑(色譜純)稀釋至刻度，用超聲波脫氣溶解10分鐘，混合搖勻后作為分析用試樣。3、進(jìn)樣分析待色譜條件穩(wěn)定后，用50wL微量注射器，依次注入標(biāo)樣、試樣進(jìn)行分析。待完全分離后，經(jīng)化學(xué)工作站分別得到標(biāo)樣、試樣的色譜譜圖和相應(yīng)的積分面積。4、定量采用高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定氯代甲酸9-芴甲酯的峰面積，由外標(biāo)法定量或面積百分比定量。外標(biāo)法定量是待測(cè)樣品中氯代甲酸9-芴甲酯純度(X》，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按式(1)計(jì)算。實(shí)施例198.6%純度氯代甲酸9-芴甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定色譜條件流動(dòng)相為乙腈:水(0.1%醋酸-醋酸鈉)=卯:10;色譜柱選用ZorbaxC18，填料粒度5pm，柱長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑4.6mm;流速1.0ml/min;柱溫30。C;檢測(cè)波長(zhǎng)262nm;進(jìn)樣量5pl。按上面的操作步驟，準(zhǔn)確稱取25.13mgFmoc-Cl標(biāo)樣，置于100ml潔凈干燥的容量瓶中，用色譜級(jí)乙腈稀釋至刻度，用超聲波脫氣10分鐘，充分搖勻后進(jìn)樣。待儀器條件穩(wěn)定后連續(xù)進(jìn)樣3次，取3次面積的平均值作為標(biāo)樣計(jì)算的面積(A2)。標(biāo)樣積分面積數(shù)據(jù)見(jiàn)表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>平均峰面積(A2)12544.2氯代甲酸9-芴甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品圖見(jiàn)圖1。實(shí)施例2高純度試樣的測(cè)定色譜條件同實(shí)施例l。按上面的操作步驟，準(zhǔn)確稱取27.44mgFmoc-Cl試樣，置于100ml潔凈干燥的容量瓶中，用色譜純乙腈稀釋至刻度，用超聲波脫氣10分鐘，充分搖勻，進(jìn)樣。得到試樣中氯代甲酸9-芴甲酯的面積A產(chǎn)13757.2，根據(jù)式(1)計(jì)算1375722513X,=98.6X1J/J/.Zx99.0312544.227.44該氯代甲酸9-芴甲酯試樣的純度是99.03%。高純度氯代甲酸9-芴甲酯樣品圖見(jiàn)圖2。實(shí)施例3中間樣品純度測(cè)定除了流動(dòng)相采用乙腈:水(0.1%醋酸-醋酸鈉)=80:20(v/v)之外，其它色譜條件同實(shí)施例2。按上面的操作步驟，準(zhǔn)確稱取25.50mgFmoc-Cl試樣，置于100ml潔凈干燥的容量瓶中，用色譜純乙腈稀釋至刻度，用超聲波脫氣10分鐘，充分搖勻，進(jìn)樣。得到試樣中氯代甲酸9-芴甲酯的面積A產(chǎn)11560.8，根據(jù)公式(1)計(jì)算Xl=98.6xii^X翌=89.55,12544.225.50分析結(jié)果是該Fmoc-Cl試樣純度為89.55%(w%)。氯代甲酸9-芴甲酯中間樣品圖見(jiàn)圖3。.實(shí)施例4色譜條件流動(dòng)相為四氫呋喃:水(0.1%檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸)=70:30;色譜柱選用IntersilODS-3C18，填料粒度5nm，柱長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑4.6mm;流速1.0ml/min;柱溫30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)278nm;進(jìn)樣量5pl。取一定量Fmoc-Cl試樣，置于100ml潔凈干燥的容量瓶中，用色譜級(jí)四氫呋喃稀釋至刻度，用超聲波脫氣10分鐘，充分搖勻。儀器條件穩(wěn)定后進(jìn)樣。待所有物質(zhì)都出峰后終止檢測(cè)器，得出所有物質(zhì)相應(yīng)的面積。通過(guò)面積百分比方法知試樣中Fmoc-Cl含量是76.28%。該Fmoc-Cl試樣的譜圖見(jiàn)圖4。實(shí)施例5色譜條件流動(dòng)相為四氫呋喃:水(0.1%磷酸氫二鈉-檸檬酸)=90:10;色譜柱選用IntersilODS-3C18，填料粒度5pm，柱長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑4.6mm;流速l.Oml/min;柱溫30。C;檢測(cè)波長(zhǎng)278nm;進(jìn)樣量5^1。取一定量Fmoc-Cl合成粗試樣，置于100ml潔凈干燥的容量瓶中，用色譜級(jí)四氫呋喃稀釋至刻度，用超聲波脫氣10分鐘，充分搖勻。儀器條件穩(wěn)定后進(jìn)樣。待所有物質(zhì)都出峰后終止檢測(cè)器，得出所有物質(zhì)相應(yīng)的面積。通過(guò)面積百分比方法知試樣中Fmoc-Cl含量是53.84。/。。該Fmoc-Cl試樣的譜圖見(jiàn)圖5。實(shí)施例6精密度和回收率試驗(yàn)色譜條件同實(shí)施例l。將樣品配制成濃度為0.1451mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成濃度為0.1522mg/ml，進(jìn)樣量5^1，連續(xù)測(cè)樣10次，得到此方法的加標(biāo)回收率為98.0-103.5%，對(duì)實(shí)施例3中樣品進(jìn)行了6次連續(xù)測(cè)定，統(tǒng)計(jì)誤差得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.6%。權(quán)利要求1.一種用高效液相色譜法測(cè)定氯代甲酸9-芴甲酯的方法，其特征在于固定相為反相鍵合固定相；流動(dòng)相為含緩沖劑的水和/或有機(jī)溶劑；檢測(cè)器采用多波長(zhǎng)可變紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述反相鍵合固定相選自十八烷基鍵合相硅膠、辛烷基鍵合相硅膠和氰基鍵合相硅膠。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反相鍵合固定相為反相C18鍵合柱，柱長(zhǎng)1050cm，內(nèi)徑45mm。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自乙腈、四氫呋喃、環(huán)己烷、正己垸、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自乙腈和四氫呋喃。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述抑制劑選自檸檬酸-檸檬酸鈉、醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鈉、醋酸、磷酸、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、甘氨酸-鹽酸，其濃度為0.1-5%。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述固定相的柱溫為20-60°C，流動(dòng)相的流速為0.8-1.5ml/min。8.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法的進(jìn)樣量為4-20pl;檢測(cè)波長(zhǎng)為220-370nm。全文摘要本發(fā)明提供一種用高效液相色譜法分析氯代甲酸9-芴甲酯純度的方法。本方法采用的固定相為反相鍵合固定相；流動(dòng)相為含緩沖劑的水和/或有機(jī)溶劑；檢測(cè)器采用多波長(zhǎng)可變紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。該方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉且準(zhǔn)確性高，可作為氯代甲酸9-芴甲酯合成及提純過(guò)程中的純度檢測(cè)，并適用于各種純度的氯代甲酸9-芴甲酯樣品。文檔編號(hào)B01J20/287GK101231271SQ20071003671公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日發(fā)明者燁夏,張秀云,陳葉飛申請(qǐng)人:寶山鋼鐵股份有限公司