專利名稱：：電音噴離子化方法和用于分子的大氣離子化設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及一種用于在大氣壓下從液體形成樣品材料例如分子，包括生物分子例如蛋白質(zhì)的氣態(tài)離子的設(shè)備和方法，更特別地涉及一種設(shè)備和方法，其中包含樣品材料或者分子的液體從毛細管的末端發(fā)射，該毛細管在其末端維持電位以建立電場，而超音速環(huán)形氣體噴射對準毛細管的末端以產(chǎn)生帶電荷的超細微粒，該超細微粒在大氣壓力下通過氣體的絕熱膨脹和液體的強烈蒸發(fā)形成材料或者分子的氣態(tài)離子。
背景技術(shù)：
：電噴離子化(ESI)質(zhì)譜1，2已經(jīng)迅速成為結(jié)構(gòu)生物化學領(lǐng)域的重要工具。該技術(shù)可以使折疊的蛋白質(zhì)離子化，有時對于在完整三維結(jié)構(gòu)中有小的改變的證據(jù)。所得離子可以隨后在氣相中使用現(xiàn)代質(zhì)譜工具進行研究。3-8不僅單一蛋白質(zhì)可以使用這種方法論進行研究，而且有時多種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配位體配合物也可以完整地離子化，盡管徹底研究的實例的數(shù)量要少得多。近來，這種如整個核多糖體9的配合物結(jié)構(gòu)的離子化已經(jīng)被證實。在氣相中蛋白質(zhì)配合物可以借助級聯(lián)的或者多步質(zhì)譜進行研究。10-12在這種步驟中，初始配合物可以經(jīng)受連續(xù)的離解過程，以揭示各個組分的分子量。與大多數(shù)其他技術(shù)不同，質(zhì)譜并不局限于檢測特定種類的分子配合物組分，例如用熒光蛋白標記或者否則使得對于分析方法可見的那些。蛋白質(zhì)和其他生物相關(guān)的大分子體系在生理學條件下通常表現(xiàn)出一種或者很少數(shù)量的構(gòu)造，這種構(gòu)造是對于承擔一種意義明確的生化功能的必要特征。通常認為液相結(jié)構(gòu)與在氣相中最穩(wěn)定的構(gòu)造不同。3，4，9，13-15因此，對于開發(fā)出成功的質(zhì)譜技術(shù)的主要要求是保持這些亞穩(wěn)態(tài)溶液結(jié)構(gòu)，而這要求最小化該離子的內(nèi)能以使得保持氣相解重疊率或者離解率盡可能低。這種任務(wù)通常通過在制備用于質(zhì)譜的溶液時避免變性條件和在儀器的源和大氣界面區(qū)域小心地調(diào)節(jié)壓力和透鏡電位值來實現(xiàn)。10，16這些工序的主要目的在于去溶劑化蛋白質(zhì)離子并引導它們進入質(zhì)譜的高真空區(qū)域而不影響保持高度有序結(jié)構(gòu)的非共價相互作用。這一目標通常通過在大氣界面中施加相對高壓和在整個透境系統(tǒng)施加低電位梯度來實現(xiàn)16。高氣壓提供了在儀器的第一真空區(qū)的高碰撞頻率，這保持離子在低溫下通過碰撞冷卻并同時促進有效離解。然而，因為溶液包封和離子構(gòu)造都是由非共價相互作用保持，經(jīng)常在保持完整結(jié)構(gòu)的條件和那些需要完全離解的條件之間得到妥協(xié)。此外，允許溫和地離解的儀器設(shè)定通常對于離子轉(zhuǎn)化效率不是最優(yōu)化的，因此儀器的靈敏度可能被嚴重降低。納米噴霧(nanospray)17，18是經(jīng)常被選用來取得溫和的離解的離子化方法，并同時也提供用于少量有價值的樣品的高離子化效率。不同于傳統(tǒng)的商業(yè)上可獲得的ESI離子源，18納米噴霧適合于生理pH下含水緩沖液并且由于其高的離子化效率該方法的樣品消耗量降低了一個或兩個數(shù)量級。高離子化效率和有效的離解是通常有助于低溶液流速的特性，已知低溶液流速降低初始產(chǎn)生的帶電荷液滴的尺寸。較小的初始液滴經(jīng)受較少的庫侖分裂和每個液滴蒸發(fā)較少的溶劑，這導致非揮發(fā)性基質(zhì)組分在產(chǎn)生實際氣態(tài)蛋白質(zhì)離子的最終納米液滴中的較低濃度。較小的初始液滴尺寸還加速離子形成并通過該方式液滴的較高份額將實際上被完全去溶劑化以提供對于質(zhì)量分析可用的離子。通常認為納米噴霧提供比ESI更好的離解效率。由于顯著較低的樣品流速，這種特性有助于從較小液滴中更有效地揮發(fā)溶液和在大氣界面上的較低溶劑蒸汽負載。該固有的良好離解效率不要求在大氣界面上施加苛刻的離解條件(高溫、高錐電壓等)，其進而增強了包括非共價配合物的易損生化實體的存活。盡管有這些優(yōu)點，納米噴霧質(zhì)譜強烈依賴于所用的納米噴霧尖端；從尖端到尖端的譜圖重現(xiàn)性弱。另外，尖端的幾何形狀在操作期間可能會由于弧燒或斷裂而改變。納米噴霧的另一難點在于在噴霧過程中缺少控制在實踐中噴霧不能調(diào)節(jié)，其僅能通過改變高電壓來打開和關(guān)閉。19，20通常要求高的流速和極端的pH值。在納米噴霧和傳統(tǒng)加壓流動(壓縮空氣輔助的電噴射)的情況下，絕對靈敏度不僅受到各個峰的寬度(單位為m/z)的影響，而且受到整個電子價態(tài)分布的形狀和寬度的影響。電子價態(tài)分布的形狀經(jīng)常用作確定離子化過程中蛋白質(zhì)的解折疊程度的分析工具。21-26在高電子價態(tài)下寬的電子價態(tài)分步通常伴隨著解折疊的結(jié)構(gòu)，而在低電子價態(tài)下窄的分布被處理為在氣相中的天然或者類似天然的折疊離子結(jié)構(gòu)的標志。由Kebarle等人最近開發(fā)出來的模型基于在蛋白質(zhì)分子上的可能帶電荷位點的相對表觀氣相堿度(GB)評價蛋白質(zhì)離子的最大電荷數(shù)26-29。這種模型描述了在電噴霧中通過在每一帶電荷位點上形成具有緩沖分子的質(zhì)子束縛配合物并接著離解這些配合物來由緩沖溶液形成蛋白質(zhì)離子。這些配合物離解的支化率取決于該緩沖分子(例如在銨緩沖液下為氨)的相對表觀GB相對于蛋白質(zhì)帶電荷位點的相對表觀GB。蛋白質(zhì)上特定位點的表觀GB值可以基于化學部分的固有GB值、蛋白質(zhì)分子的介電常數(shù)和電荷的空間分布進行確定，其中最后一個因素涉及蛋白質(zhì)離子的大小。所觀察的電荷狀態(tài)分布是這些因素的結(jié)果離解的溫度和發(fā)生在質(zhì)譜的大氣界面或在通過離子光學路徑期間的離子/分子反應(yīng)導致的任何進一步電價減少。原則上，噴霧過程和樣品的充電可以被分離，和初始帶電的液體可以在開始時通過不同的噴霧技術(shù)被細分散。這種方法通過壓縮空氣噴霧方法在商用ESI源中廣泛采用30，通常是為了粗略分散來自標準液相色譜的大量液體樣品。因為d～1/vg2，其中d是液滴的平均直徑，vg是在高氣體線速度和高氣體/液體質(zhì)量流速比下噴霧氣體的線速度，理論上可以取得能與納米噴霧相比的液滴大小。31盡管由緩沖到生理pH值的水溶液供應(yīng)的配合物樣品材料例如蛋白質(zhì)的完全離子化已經(jīng)達到了在質(zhì)譜的還原氣氛下能夠在大氣壓下采樣的程度，當材料為緩沖到生理pH值的水溶液中的蛋白質(zhì)時，氣態(tài)離子化樣品以產(chǎn)出該溶液的各種組分的基本上單一物質(zhì)在之前是未知的。對ESI的仔細研究確定實際上離子化液滴是通過現(xiàn)有技術(shù)方法制備的。在液滴被加熱和有時經(jīng)受多次碰撞后，造成蛋白質(zhì)樣品的某些解折疊，這導致不理想的寬電荷分布，在質(zhì)譜儀中該離子化液體進行采樣并完成蒸發(fā)。在質(zhì)譜外完全氣態(tài)離子化來自溶液的樣品材料在之前未能完成，盡管通過激光輔助噴霧離子化方法已經(jīng)在這一方向上取得了進步。32發(fā)明目的和發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供用于在大氣壓下從含所述材料的液體產(chǎn)生樣品材料的氣態(tài)離子的設(shè)備和方法。本發(fā)明的另一目的在于提供用于在液體中離子化樣品材料例如分子的離子發(fā)生器設(shè)備，該設(shè)備包括用于在一端接收液體而在另一端以液流發(fā)射該液體的樣品毛細管，用于在毛細管的一端提供電壓以建立電場的電壓源，和環(huán)繞該毛細管并與該毛細管保持間距以形成環(huán)狀間隙的外管，加壓氣體流過該環(huán)狀間隙以形成以超音速流動的環(huán)繞液體流的氣體噴射，形成超細帶電液滴，該液滴通過氣體的絕熱膨脹和液體蒸發(fā)在大氣壓下形成材料或分子的氣態(tài)離子。該設(shè)備還可以包括至少一個(i)將氣體流速相對于所輸送的液流速度超過超音速閾值的裝置，(ii)調(diào)節(jié)電位強度的裝置，(iii)調(diào)節(jié)第一毛細導管末端相對于第二毛細導管末端的位置的裝置和(iv)調(diào)節(jié)設(shè)備操作溫度的裝置。本發(fā)明提供了一種從溶液中的樣品材料產(chǎn)生基本上單一物質(zhì)的氣態(tài)離子的方法，該方法包括在電位下將該溶液輸送到相對于該液體至少以超音速移動的氣流中。提供了一種離子發(fā)生器設(shè)備，其包括用于接收具有在溶液中的材料樣品的液體并在另一端發(fā)射液流的毛細管，用于在該毛細管的另一端產(chǎn)生電場的裝置和用于在至少350m/s的速度下引導氣體的環(huán)狀噴射流經(jīng)第一毛細管的另一端，與發(fā)射流體為同一方向，由此產(chǎn)生帶電的超細液滴，該超細液滴通過氣體的絕熱膨脹和液體的強烈蒸發(fā)提供該樣品材料的氣態(tài)離子。具有可以在大氣壓下采樣離子的采樣端子的質(zhì)量分析儀被安置以接收由本發(fā)明的離子發(fā)生器形成的氣態(tài)離子并提供離子化樣品材料的質(zhì)量分析。附圖簡述當結(jié)合本發(fā)明附圖閱讀下面的描述時，將能夠更清楚地理解本發(fā)明圖1示意性示出了包含本發(fā)明的離子發(fā)生器設(shè)備的質(zhì)量分析體系。圖2示意性示出了本發(fā)明的離子發(fā)生器設(shè)備的一個實施方案的縱向橫截面。圖3牛蛋白激酶A催化亞單位(在10mM含水乙酸銨中為200nM，pH7.8)的(a)ESSI譜圖和(b)在線納米噴霧譜圖。圖4牛蛋白激酶A催化亞單位(在10mM含水乙酸銨中為200nM，pH7.8)在存在100μmATPMg鹽時的ESSI譜圖。該酶也在兩個位點經(jīng)受自發(fā)磷酸化，這導致在觀察到的m/z的進一步位移。圖5通過離子化10mM[Fe(bipyridl)2]2+并將一張紙暴露在該噴霧下記錄作為與噴霧尖端間距離的函數(shù)的ESSI噴霧的橫截面。噴霧參數(shù)1μL/min樣品流速，3L/minN2噴霧氣體，2kV噴霧電位。圖6作為噴霧電位的函數(shù)的母雞蛋白溶菌酶離子的(a)信號強度和(b)平均電荷，其中在ESSI和納米噴霧的情況下使用pH7.8的溶于10mM乙酸銨的0.01mg/mL溶菌酶。圖7作為噴霧氣體流速的函數(shù)的牛PKAc離子的(a)作為理論值的百分數(shù)的在半峰高處的峰寬，(b)總強度(峰面積)。圖8a-d牛細胞色素C的譜圖，0.01mg/ml在10mM含水乙酸銨中，在不同條件下獲得。圖9a-b作為噴霧尖端和大氣界面之間的距離的函數(shù)的母雞蛋白溶菌酶離子的平均電荷和峰寬。圖10a-b作為(a)NaCl濃度和(b)丙三醇濃度的函數(shù)的母雞蛋白溶菌酶離子的強度；(c)在相同體系中作為NaCl濃度的函數(shù)的基峰寬，其中對于ESSI實驗使用5μmID的尖端和對于納米噴霧實驗使用2μmID的尖端。圖11含有10mM乙酸銨(pH7.1)和6mMPIPES緩沖液的咪唑-3-丙三醇磷酸酯合酶(IGPS)-N-[5，-磷核酮糖基]-亞胺甲基]-5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸(1，特定抑制劑)混合物的ESSI譜圖。圖12(a)溶菌酶(100nM在10mM乙酸銨水溶液中，pH7.8)以30cm的間距噴霧的ESSI譜圖。(b)類似實驗，噴霧使得與哌啶飽和蒸汽壓相互作用。發(fā)明詳述提供了一種配備有可變電位和高速噴霧氣體的微型電噴霧33體系，并將該體系與非常完備的微型ESI和納米噴霧ESI技術(shù)進行比較。由于其利用類似于Hirabayashi的音速噴霧技術(shù)34，35的超音速氣體噴射，這種新方法稱為電-音(electro-sonic)噴霧離子化或者“ESSI”。這種新方法在低溫下產(chǎn)生超細的初始液滴(由噴霧氣體的絕熱膨脹和溶液的強烈蒸發(fā)造成)和隨后該方法對在生理條件下離子化的蛋白質(zhì)樣品得到窄峰形狀和窄電子價態(tài)分布。參見圖1，顯示了連接根據(jù)本發(fā)明的大氣壓電音噴離子化設(shè)備(ESSI)11以從附加裝置例如液相色譜12接收液體形式的樣品材料。現(xiàn)在詳細描述的電音噴離子化設(shè)備在大氣壓下形成樣品材料的氣態(tài)離子13并將其輸送到例如合適的質(zhì)量分析儀14。用于實施現(xiàn)在描述的實驗的質(zhì)量分析儀14的前端部分在圖1中示意性示出。圖示的前端部分是從ThermoFinniganCorporation，ModelLCQClassic購買的質(zhì)譜儀的前端部分。所述離子經(jīng)加熱的毛細管端子傳輸進入第一室16，該室保持較離子化源11的大氣壓低的壓力(大約1托)。由于壓力差，離子和氣體流經(jīng)加熱的毛細管17進入室16。毛細管的末端被管透鏡(tubelens)18環(huán)繞，該管透鏡提供了使離開該毛細管的離子束對分離器孔19聚焦的靜電場。所述離子隨后在高真空下經(jīng)過第二區(qū)域21并由離子導流器22引導通過第二分離器23進入質(zhì)量分析儀。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，該ESSI設(shè)備可以和任何類型的質(zhì)量分析儀一起使用，包括磁性區(qū)段、四級桿、飛秒、離子阱(2D和3D)、FT-ICR、軌道阱或它們的任意組合。此外，該源與任何類型的離子流動光譜儀兼容。現(xiàn)在具體參見圖2，該圖是電音噴離子化設(shè)備11的放大圖，所述設(shè)備包括具有螺紋端的T零件24。采樣毛細管26由套圈27支撐并沿著該零件在其上延伸。第二套圈28支撐第二毛細管或管29，該毛細管或管具有大于采樣毛細管26的外徑的內(nèi)徑，以提供采樣毛細管和外部毛細管或管之間的環(huán)狀間隙。采樣毛細管的末端31延伸超過外部毛細管的末端。超過外部毛細管的采樣毛細管的延伸量可以通過相對于外部毛細管移動采樣毛細管進行調(diào)節(jié)，反之亦然。在操作中調(diào)節(jié)所述距離以取得最佳操作條件。T零件的其他零件與氮氣罐或者其他氣體罐32經(jīng)高壓調(diào)節(jié)器33相連，該高壓調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)氣體進入T零件和通過環(huán)繞液體毛細管的環(huán)狀間隙離開的氣體壓力。每個套圈通過螺母擰入T零件進行夾持。根據(jù)本發(fā)明，典型的電音噴離子化設(shè)備的尺寸如下所述采樣毛細管-5-100μmID，0.15mmOD外部毛細管-0.025cmID，0.40mmOD液體毛細管尖端和外部毛細管尖端之間的距離-0.1-0.2mm施加到液體毛細管和液體上的電壓-±0-4kV氣壓-大約8-25巴樣品流速-0.05-50mL/分鐘毛細管的材料優(yōu)選是熔融二氧化硅，盡管也可以使用其他類型的材料，優(yōu)選的是采樣毛細管是傳導性的，由此電壓可以通過毛細管施加到所述尖端。外部毛細管可以是管或者其他合適的材料。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熔融二氧化硅是合適的。在根據(jù)本發(fā)明的操作中，對采樣毛細管施加電壓，由此在該毛細管的末端建立電場。使在液體中的樣品材料(例如包括生物分子例如蛋白質(zhì)的分子)流經(jīng)該毛細管并作為液體流從該毛細管的末端發(fā)射。所述氣壓經(jīng)調(diào)節(jié)使得在液體毛細管和外部毛細管之間的環(huán)狀間隙末端提供以大于350m/s、優(yōu)選330-1000m/s、更優(yōu)選400-700m/s的速度的環(huán)狀噴射，由此產(chǎn)生帶電的超細液滴或者微粒，這些超細液滴或微粒隨后經(jīng)受氣體的絕熱膨脹和液體的強烈蒸發(fā)以在大氣壓下提供樣品材料的氣態(tài)離子。所述的所有譜使用配備有類似于電音噴離子化設(shè)備的ESSI源(在圖1中示出)或者納米噴霧源的ThermoFinniganLCQClassic質(zhì)譜進行記錄。對液體樣品通過銅鱷魚夾施加0-4kV的電壓，該銅鱷魚夾固定到用于樣品注入的注入器的不銹鋼尖端上。實驗進行的溫度是室溫；然而，所述溫度范圍是從環(huán)境溫度到溶劑的沸點，即對于水來說是20℃-100℃。除非另外指出，所述離子源對質(zhì)譜儀14的大氣界面仔細校準以獲得最高的靈敏度和最窄的峰寬。典型的儀器參數(shù)總結(jié)于表1。表1用于LCQ儀器的儀器設(shè)定納米噴霧譜通過使用PicoTipTM的內(nèi)部直徑為1±0.5μm或2±0.5μm的電噴霧尖端(NewObjectiveInc.，Woburn，MA)獲得。溶菌酶、細胞色素c、醇脫氫酶、牛血清清蛋白、肌紅蛋白、脫輔基肌紅蛋白和胰島素從Sigma(StLouis，MO)購買，己糖激酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶從Worthington(Lakewood，NJ)獲得，蛋白激酶，催化亞單位(PKAc)由Promega(Madison，WI)獲得。PKAc是使用MicroconYM-10離心分離單元(Millipore，Billerica，MA)從350mMKH2PO4初始溶液置換200mM乙酸銨溶液的緩沖液。其他蛋白質(zhì)是簡單地溶于含水乙酸銨緩沖液。緩沖液的pH值經(jīng)添加1M氫氧化銨或者乙酸水溶液調(diào)節(jié)。牛蛋白激酶A催化亞單位(PKAc)的電子噴霧質(zhì)譜圖和用于對比目的的納米噴霧質(zhì)譜圖在接近生理溶液相條件下記錄(pH7.8，含水乙酸銨緩沖液)，分別在圖3a和3b中示出。在兩個譜圖間在觀察到的峰寬度和電子價態(tài)分布方面具有顯著區(qū)別。如在表2中所總結(jié)的，對于一些其他蛋白質(zhì)也觀察到類似的現(xiàn)象。在ESSI的情況下，對于豐富(相對豐度大于10％)的蛋白質(zhì)離子所觀察到的半高全寬(FWHM)值為由同位素分布計算得出的理論值的100-150％，而在納米噴霧離子化的情況下，典型的FWMK值比理論值高2-8倍。表2使用ESSI和納米噴霧(nS)的蛋白質(zhì)譜圖特性比較*由于儀器的高質(zhì)量限定沒有觀察到其他離子所述兩種離子化方法的比較的第二點是電子價態(tài)分布。取決于所研究的蛋白質(zhì)，使用ESSI所觀察到的電子價態(tài)分布與使用納米噴霧記錄到的電子價態(tài)分布相似或者更窄。在大多數(shù)情況下，在離子化時由于其他氣態(tài)離子沒有超過25％的相對豐度，單種電子價態(tài)在ESSI譜圖上占主導地位。在納米噴霧的情況下，不論是在我們的實驗中還是在文獻數(shù)據(jù)中，都僅在少數(shù)蛋白質(zhì)中觀察到相似的情況。相對于ESSI的情況下幾乎完全除去溶劑添加物，特定生物配合物的存活是優(yōu)異的。這一結(jié)果由圖4得以說明，圖中顯示，蛋白激酶A催化亞單位通過加入過量ATP/Mg鹽轉(zhuǎn)化為其ATP/Mg加合物(在兩個位點發(fā)生自發(fā)磷酸化)，導致在所觀察到的m/z值的進一步遷移。所得配合物使用ESSI完整地輸送到氣相中。應(yīng)注意，該配合物的存活率高于95％，而且高的ATP和Mg濃度在譜圖特性上沒有可觀察到的影響。對于其他蛋白質(zhì)配體配合物包括溶菌酶-六-N-乙?；?殼六糖(chitohexaose)，醇脫氫酶-NADH和己糖激酶-葡萄糖取得了類似的結(jié)果。ESSI和納米噴霧的特性特征示于表3。表3ESSI的分析性能與納米噴霧的比較盡管納米噴霧的絕對響應(yīng)因子較好，這兩種工藝的檢測限是可相比較的(對于相同的樣品，納米噴霧得到較高的信號強度但S/N比率相似)。響應(yīng)因子之間的差異與ESSI的噴霧發(fā)散有關(guān)，其數(shù)據(jù)在圖5中展示。使用0.5mm的采樣口(ThermoFinnigan加熱毛細管的標準值)，納米噴霧液滴的50-90％在最優(yōu)條件下進入儀器，而ESSI的采樣效率僅為5-25％。這可能通過使用具有不同幾何形狀的大氣界面來克服這種缺陷。在不同濃度下通過離子化蛋白質(zhì)溶液獲得響應(yīng)因子。在表3中顯示的檢測限值反映了對于最高豐度的蛋白質(zhì)離子觀察到信噪比為3∶1的蛋白質(zhì)濃度。在ESSI和納米噴霧的情況下高電壓(HV)下信號強度和譜圖特性的依賴型是顯著不同的(圖6a和圖6b)。因為噴霧形成和液滴充電是獨立的過程，ESSI離子源在任何電壓設(shè)定條件下產(chǎn)生離子，而在納米噴霧的情況下只有在特定開始電壓下噴霧是穩(wěn)定化的。能夠“調(diào)諧”電壓對于ESSI是一個顯著的實際優(yōu)勢。在0V下觀察到純的音速噴霧譜圖，而且通過在低電壓范圍增加電位，ESSI中的強度和譜圖特性(峰寬，平均電子價態(tài))急劇改變。在不存在電場的情況下多電荷離子的出現(xiàn)在之前沒有報導。在納米噴霧的閾值附近，ESSI信號穩(wěn)定，除了在強度上有微弱影響外，譜圖對于典型蛋白質(zhì)在0.8-4kV范圍內(nèi)是不依賴于電壓的。因為ESSI在整個電壓范圍內(nèi)產(chǎn)生可測量的離子電流，在這種情況下無需離子化的“點火”。ESSI的另一優(yōu)點在于不存在弧燒，這可能是因為氮氣的湍流阻止了電暈放電的形成。使ESSI最顯著地區(qū)別于其他電噴霧變型方案的因素在于氣體流速。ESSI峰寬和總信號強度對于噴霧氣體流速的依賴性示于圖7a和7b。峰寬隨著噴霧氣體流速的上升急劇下降，并收斂于理論值，即同位素包層的寬度?？梢钥闯觯鍖挼募眲∽兓l(fā)生在約0.35L/min的流速及以上，并在0.4L/min處變化最為劇烈。氣體速度通過將體積流速除以在大氣壓下環(huán)狀通道的橫截面積計算得到。在ESSI設(shè)備中通常獲得的數(shù)據(jù)1L/min代表943.14米/秒(m/s)。這種大于330m/s的流速適合實施本發(fā)明從而獲得尖銳的峰。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選速度范圍為400-700m/s?？倧姸?峰面積)隨著噴霧氣體流速升高而下降，盡管這種效果通過改善的峰形狀部分得以平衡。噴霧氣體流速的改變使初始液滴形成機理從純電噴霧向純氣動噴霧遷移。增加的氣體流速還通過氣體的絕熱膨脹改變了噴霧溫度并允許更有效的溶液蒸發(fā)。在譜圖特性上的改變伴隨著這兩個因素，而所觀察到的信號強度下降是因為離開加熱毛細管的離子的較高線速度。后一因素降低了管鏡透鏡-分離器體系的采樣效率。ESSI離子化的又一值得注意的特征是譜圖特性對于不同大氣界面設(shè)定的弱依賴性，包括溫度和電位梯度。在使用商用離子源的納米噴霧或者ESI的情況下，去溶劑化效率和電子價態(tài)分布受到這些參數(shù)的強烈影響。在使用ESI或納米噴霧離子化的情況下使用陡峭電位梯度(高管鏡透鏡或者錐電壓)時，如圖8a和b所示，平均電荷可能向較高值遷移。相應(yīng)的ESSI數(shù)據(jù)(圖8c和d)表現(xiàn)出較弱的影響。ESSI的譜圖特性顯示出對沿著軸的噴霧位置的強烈依賴性(圖9a和9b)。在尖端太靠近于進入錐道時發(fā)生質(zhì)譜峰變寬，并伴隨有大量溶劑進入質(zhì)譜儀，導致離子在儀器中再次溶劑化。這種解釋受到分辨率依賴于樣品流速的支持，這顯示在高樣品流速下去熔劑化程度同樣變差(在表1中列出的條件下＞50μL/min)。在較大距離時，完全去溶劑化經(jīng)常伴隨著平均電子價態(tài)的少量遷移，意味著離子的電荷下降發(fā)生在大氣壓范圍內(nèi)。多電荷蛋白質(zhì)離子在儀器的高壓區(qū)域與溶劑和緩沖液分子相互作用時經(jīng)受氫鍵鍵合的加合物形成和離解。由于從特定電荷位點的離子離解中性溶劑分子是可逆的過程而電荷降低則不是，盡管這些電荷位點具有高于任何其他種類的GB值，其將會經(jīng)受緩慢的電荷降低24，26。盡管存在這種電荷降低過程，蛋白質(zhì)溶液可以使用ESSI從大于3m(米)的距離噴霧，在通常情況下仍然得到具有S/N～30的信號。這種觀察開辟了用于在大氣壓下研究生物化合物的離子-分子反應(yīng)的新的可能性。ESSI的樣品流速與納米噴霧的樣品流速重疊；然而，后者的平均樣品消耗量通常較低，而這便于離線實驗。(使用10μmID噴霧毛細管和1μL注射器，ESSI的死體積仍為2-3μL，而納米噴霧譜可以輕易地從亞微升樣品體積進行記錄。)如表3所示，樣品流速的下限取決于噴霧毛細管的橫截面。這種現(xiàn)象表明在ESSI中阻止流速不斷降低的主要因素是從毛細管尖端蒸發(fā)溶劑。因為許多感興趣的分析物(蛋白質(zhì)和其他生物高分子)被假定為通過電荷殘留(CR)工藝離子化，液滴形成對于其離子化是必要的。蒸發(fā)可以通過降低液體在毛細管尖端的暴露面積而被抑制。在ESSI中樣品流速的上限已經(jīng)在常規(guī)HPLC洗提液流速的范圍內(nèi)，這意味著所述離子源可以在LC-MS界面中使用。使用含有不同濃度的氯化鈉和丙三醇的水溶液對ESSI技術(shù)對基體效應(yīng)的敏感度進行了測試。數(shù)據(jù)示于圖10a和10b。信號強度對NaCl濃度顯示，ESSI對無機鹽的敏感性與納米噴霧的敏感性相類似。然而，較之納米噴霧或者微噴霧ESI，ESSI對于高丙三醇濃度更不敏感。20％的丙三醇濃度似乎與納米噴霧不相容，這可能是因為樣品的高粘度，ESSI在高達70％的丙三醇含量下得到穩(wěn)定的信號。在某些情況下，比如溶菌酶，從純的基于丙三醇的緩沖溶液由ESSI離子化是成功的。ESSI也能良好地耐受高濃度(0.1-0.5M)的2-氨基-2-(羥甲基)-1，3-丙二醇(三羥甲基氨基甲烷(Trisbase))。這種特征與液滴的快速蒸發(fā)有關(guān)。因為初始液滴大小和液體/氣體比都小，蒸發(fā)發(fā)生在高比表面上并因此尤其是不可逆的。在這些條件下，甚至具有低蒸汽壓的物質(zhì)都可能蒸發(fā)。ESSI的三個主要優(yōu)點是有效地消除峰變寬(圖3)，在多電荷折疊蛋白質(zhì)離子的情況下窄的、通常是單峰電子價態(tài)分布，有效離子化蛋白質(zhì)配合物的能力(見下文)。在電噴霧質(zhì)譜儀中記錄蛋白質(zhì)離子的峰變寬是眾所周知、然而相對較少研究的現(xiàn)象。這通常歸因于離子在大氣界面中的去溶劑化不足或者歸因于緩沖鹽在蛋白質(zhì)離子的電荷位點上聚集。(在此不考慮不揮發(fā)組分例如金屬鹽或者碳水化合物的影響，因為這些干擾通?？梢酝ㄟ^緩沖液置換或者透析容易地消除。)在兩種情況下共價或者離子簇存在于蛋白質(zhì)離子的某些位點。為了消除這些額外的物質(zhì)，可以改變?nèi)芤合嗟慕M成或者系統(tǒng)的平均內(nèi)能。然而，如果實驗的主要目標是研究來自生理來源的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)配合物的折疊構(gòu)造，兩種替代方案都存在嚴重的局限性。溶劑或者溶劑pH值的改變誘發(fā)溶液中蛋白質(zhì)解折疊或者沉淀，而在大氣界面的前端真空區(qū)域內(nèi)的高電位梯度或者高離子源溫度在電噴霧納米液滴中誘發(fā)類似的過程。不完全去溶劑化的氣態(tài)蛋白質(zhì)離子的進一步激發(fā)也可能涉及感興趣的結(jié)構(gòu)的解折疊或者離解。因此，大多數(shù)這類研究被強制在低解析度條件下實施。在圖3和11和表2中的結(jié)果明確表明，ESSI避免了作出這種妥協(xié)的要求。圖11顯示，ESSI高效地從蛋白質(zhì)配合物產(chǎn)生離子并由此表現(xiàn)出其由單電子價態(tài)占主導地位的極窄的峰的特性。應(yīng)注意在該圖中出現(xiàn)的另一優(yōu)點。在某些條件下，例如在此所用的條件，一些蛋白質(zhì)碎片是變性的；這些蛋白質(zhì)分子不能與配體結(jié)合而形成配合物且它們作為在一些不同電子價態(tài)中的一系列變寬的峰出現(xiàn)，用星號標記。這種在ESI譜圖中常見的特征也能在ESSI譜圖中觀察到。剩余的蛋白質(zhì)離子可以并確實形成配合物和它們作為單富配合物峰。區(qū)分天然和變性的蛋白質(zhì)的能力是ESSI的另一優(yōu)點。在ESSI中電子價態(tài)分布對大氣界面設(shè)定的弱依賴性強烈表明，ESSI和ESI(或者納米噴霧)的主要區(qū)別在于氣態(tài)離子形成發(fā)生的位置。在傳統(tǒng)電噴霧技術(shù)的情況下，被檢測高分子離子的形成發(fā)生在儀器的大氣界面-離子引導區(qū)。在ESSI中，這一過程似乎發(fā)生在儀器的大氣壓區(qū)域。為了提供這一假設(shè)的其他證據(jù)，使用ESSI噴霧溶菌酶(100fm/μL)，且所述噴霧暴露于強堿哌啶。如圖12a和12b所示，平均電子價態(tài)從7遷移到6，并觀察到大量的加合物形成。在液相中僅以1mM濃度存在的哌啶(pKa＝11.8)成功地抑制了溶菌酶的離子化。這些結(jié)果明確顯示氣態(tài)蛋白質(zhì)離子已經(jīng)存在于大氣壓區(qū)域。由于在大氣壓下ESSI產(chǎn)生完全去溶劑化的高分子離子，這種特征向用戶提供了在高壓下對這些離子改性的能力。這些改性包括基于移動性、離子/分子反應(yīng)性、碰撞碎裂性的不同的分離和其他工藝。大氣壓操作離子的主要優(yōu)點是這些過程的熱力學性質(zhì)。ESSI顯示出兩個現(xiàn)象，這使得其區(qū)別于其他的電噴霧離子化方法，即折疊蛋白質(zhì)體系的高去溶劑化效率和觀察到占主導地位的一種電子價態(tài)。良好的去溶劑化效率可能與小的初始液滴大小相關(guān)，后者是由超音速噴霧氣體和從小液滴的高比表面快速溶劑蒸發(fā)造成的。因為高的噴霧氣體流速和這使得重新溶劑化速率低，蒸發(fā)發(fā)生在溶劑分壓低的環(huán)境中。這有助于解釋下面的事實在蛋白質(zhì)溶于生理pH范圍的含水緩沖液的情況下，在ESSI譜圖中觀察到單一電子價態(tài)。噴霧氣體的絕熱膨脹和溶劑的強烈蒸發(fā)造成的噴霧的低溫有助于保持這些分子的原始結(jié)構(gòu)。折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有精確限定數(shù)量的嵌入電荷(buriedcharge)，其能夠在其表面攜帶特定數(shù)量的電荷。后一數(shù)字通過表面上的堿性位點的表觀氣相堿度(GB)值相對于溶劑/緩沖液的氣相堿度(GB)來確定。因為去溶劑化發(fā)生在高壓下，該體系可以被假定為處于熱力學平衡形式，使得這些GB值為可確定的量，所述可確定的量嚴格限定了蛋白質(zhì)分子的表面電荷容量。容易理解的是在包含一個單一蛋白質(zhì)分子的最終液滴上電荷的數(shù)量將高于蛋白質(zhì)分子的電荷容量。因此，在完全去溶劑化期間，某些電荷被離解的緩沖液或者溶劑離子或者作為帶電荷的簇被帶走。結(jié)果是去溶劑化的蛋白質(zhì)離子被充電直到其容量，而進一步的電荷降低是可忽略的，因為溶劑或者緩沖液分子的分壓足夠低。電噴霧和使用超音速噴霧氣體的組合產(chǎn)生了一種新的電噴霧變型方案-電音噴離子化-具有將該方法區(qū)別于其他基于電噴霧或者音速噴霧的方法的獨特特征。結(jié)果是具有一些獨特分析優(yōu)點和一些缺點的新方法。該技術(shù)的分析性能，包括樣品消耗量或靈敏度，與其說能與傳統(tǒng)ESI相比較，不如說能夠與廣泛應(yīng)用的納米噴霧離子化技術(shù)相比較。此外，ESSI顯示出比納米噴霧更好的重現(xiàn)性和更穩(wěn)定。與納米噴霧相反，ESSI的主要參數(shù)(樣品流、噴霧氣流、高電壓)可以任意改變，這提供了在譜圖特性上的更多控制。ESSI最顯著的特征是去溶劑化的程度和觀察到的極窄的電子價態(tài)分布。這些特征是特別重要的，因為它們意味著折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的離子化。這些現(xiàn)象被假定為與離子形成的位置向儀器的大氣壓區(qū)域遷移相關(guān)。這使得ESSI成為允許蛋白質(zhì)分子完全去溶劑化而不損失三級結(jié)構(gòu)和允許保持特定非共價結(jié)構(gòu)的有希望的方法。類似的，多電荷蛋白質(zhì)離子的連續(xù)電荷降低逐漸發(fā)生；各個電荷下降步驟根據(jù)各個電荷位點的不同質(zhì)子親和力(PA)值被分離產(chǎn)生所觀察到的窄電荷位點分布。由于這些特征，本發(fā)明可以成功地允許甚至更加復雜和脆弱的結(jié)構(gòu)從溶液輸送到氣相，使得可以通過質(zhì)譜儀進行更加完全的生化系統(tǒng)研究。參考文獻(1)ElectrosprayIonizationforMass-SpectrometryofLargeBiomolecules.Fenn，J.B.；Mann，M.；Meng，C.K.；Wong，S.F.；Whitehouse，C.M.Science1989，246，64-71.(2)ElectrosprayIonization-PrinciplesandPractice.Fenn，J.B.；Mann，M.；Meng，C.K.；Wong，S.F.；Whitehouse，C.M.MassSpectrometryReviews1990，9，37-70.(3)ProbingConformational-ChangesinProteinsbyMass-Spectrometry.Chowdhury，S.K.；Katta，V.；Chait，B.T.JournaloftheAmericanChemicalSociety1990，112，9012-9013.(4)Evaluationofheat-inducedconformationalchangesinproteinsbynanoelectrosprayFouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry.Fligge，T.A.；Przybylski，M.；Quinn，J.P.；Marshall，A.G.EuropeanMassSpectrometry1998，4，401-404.(5)DynamicproteincomplexesInsightsfrommassspectrometry.Hemandez，H.；Robinson，C.V.JournalofBiologicalChemistry2001，276，46685-46688.(6)Proteinfoldingandinteractionsrevealedbymassspectrometry.Last，A.M.；Robinson，C.V.CurrentOpinioninChemicalBiology1999，3，564-570.(7)PeptideandProtein-AnalysisbyElectrosprayIonizationMass-SpectrometryandCapillaryElectrophoresisMass-Spectrometry.Loo，J.A.；Udseth，H.R.；Smith，R.D.AnalyticalBiochemistry1989，1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