一種降解土壤pah污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑及用其修復(fù)土壤的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑及用其修復(fù)土壤的方法。該復(fù)合酶制劑由下述方法制得：漆酶粗制品酶液50～60%（V/V），錳過氧化物酶粗制品酶液20～30%（V/V），木素過氧化物酶粗制品酶液10～20%（V/V）及可溶性淀粉5～10%（W/V）攪拌混合均勻，噴霧干燥，控制成品含水量為3～6%，無菌封裝，即得。本發(fā)明具有處理簡單，見效周期短，效果顯著的特點(diǎn)，通過三種酶的協(xié)同作用可高效降解土壤中的PAH污染物，經(jīng)檢測，其對土壤PAH污染物的降解率高達(dá)70～80%，可實(shí)現(xiàn)污染土壤的高效脫毒及修復(fù)。
【專利說明】一種降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑及用其修復(fù)土壤的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于土壤修復(fù)領(lǐng)域，具體涉及一種可降解土壤PAH污染物的復(fù)合酶制劑及用其修復(fù)土壤的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤是組成環(huán)境的四大要素，在自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用。醉著工業(yè)化、城市化和農(nóng)業(yè)高度集約化的發(fā)展，工業(yè)三廢、農(nóng)用化肥、農(nóng)藥、重金屬/化學(xué)品造成的污染越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤質(zhì)量每況愈下，嚴(yán)重影響了生態(tài)安全和人體健康。土壤污染物主要有無機(jī)污染物和有機(jī)污染物，無機(jī)污染物包括重金屬污染和放射性元素污染等，有機(jī)污染物包括有機(jī)農(nóng)藥污染、除草劑污染、多環(huán)芳烴污染(PAH)污染、人工合成染料污染、石油污染、PCB污染等。
[0003]針對上述土壤污染的處理措施一般有:工程措施修復(fù)、物理化學(xué)修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。前三種修復(fù)存在成本高或易造成二次污染等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)修復(fù)是利用生物技術(shù)治理污染土壤的一種新技術(shù)，利用生物技術(shù)處理受污染土壤及降解吸附有毒污染物的方式日益受到人們的重視，成為污染土壤修復(fù)研究的熱點(diǎn)。
[0004]多環(huán)芳烴(PAH)是煤、石油、木材、煙草、有機(jī)高分子化合物等有機(jī)物不完全燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔铮ㄟ^大氣沉降而富集到土壤，是重要的環(huán)境和食品污染物。迄今已發(fā)現(xiàn)有200多種PAH，其中有相當(dāng)部分具有致癌性，如苯并芘，苯并蒽等。局部的PAH污染主要?dú)w咎于人類的工業(yè)活動:廢棄的老加油站、使用雜酚油和蒽油的木材防腐工廠、具有高濃度PAH的石油部分蒸餾物。最近幾十年來。由于PAH在人類和微生物中的生物轉(zhuǎn)化過程中會形成致癌物質(zhì)，因此它們引起的環(huán)境污染受到越來越多的重視。
[0005]目前有兩類微生物可被用于PAH的氧化和礦化——土壤細(xì)菌和白腐真菌，土壤細(xì)菌只能降解低分子量的PAH，而白腐真菌能氧化更稠的PAH，達(dá)6個芳環(huán)和水溶性的PAH，并降低毒性，白腐真菌對PAH降解的初始反應(yīng)被認(rèn)為是其細(xì)胞外木質(zhì)素降解酶木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶共同作用的結(jié)果?，F(xiàn)有生物修復(fù)處理受PAH污染的土壤一般是直接接種培養(yǎng)白腐真菌，使其分泌胞外木質(zhì)素降解酶、錳過氧化物酶和漆酶以降解這類污染物，但該方法中真菌培養(yǎng)易受外環(huán)境條件影響，往往生長不良，見效周期短，效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有土壤PAH污染物降解技術(shù)存在的缺陷，本 申請人:經(jīng)過研究改進(jìn)，提供了一種降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，該修復(fù)復(fù)合酶制劑由下述方法制得:將漆酶粗制品酶液50?60% (V/V)，錳過氧化物酶粗制品酶液20?30% (V/V)，木素過氧化物酶粗制品酶液10?20% (V/V)及可溶性淀粉5?10% (W/V)攪拌混合均勻，噴霧干燥，控制成品含水量為3?6%，無菌封裝，即得；所述漆酶粗制品酶液酶活> 10萬U/L，所述錳過氧化物酶粗制品酶液酶活> 10萬U/L，所述木素過氧化物酶粗制品酶液酶活> 3000U/L，所述可溶性淀粉為AR級。
[0007]其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:
[0008]所述漆酶粗制品酶液由保藏編號為CCTCC NO:M2010235的密孔菌屬菌株P(guān)ycnoporus sp.SYBC-L3通過液體攪拌發(fā)酵制得。
[0009]所述錳過氧化物酶粗制品酶液和木素過氧化物酶粗制品酶液由保藏編號為CGMCCNO:5.0776的黃抱原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium通過液體攬拌發(fā)酵制得。
[0010]所述攪拌混合在封閉式恒溫攪拌器內(nèi)進(jìn)行，攪拌速度50?IOOrpm,攪拌時間45?60min，溫度 25 ?30O。
[0011]所述噴霧干燥通過噴霧干燥器實(shí)現(xiàn)，參數(shù)設(shè)定為進(jìn)口溫度160?180°C，出口溫度60?70°C，霧化器頻率40?50Hz，料液泵頻率5?6Hz。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述修復(fù)復(fù)合酶制劑修復(fù)土壤的方法:.將所述修復(fù)復(fù)合酶制劑按質(zhì)量體積比1:100?200的比例溶解于pH4.0的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，攪拌均勻，再噴灑于污染PAH的土壤上使其滲透至污染底層，即可實(shí)現(xiàn)土壤的高效脫毒和修復(fù)。
[0013]其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:
[0014]所述檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液為現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0015]本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果:
[0016]本發(fā)明精選一株高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株P(guān)ycnoporus sp.SYBC-L3以及一株高產(chǎn)猛過氧化物酶和木素過氧化物酶的黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium,通過液體攪拌發(fā)酵提取獲得漆酶、錳過氧化物酶和木素過氧化物酶的粗制品酶液。其中，木素過氧化物酶(LiP)，錳過氧化物酶(MnP)是一類過氧化物酶，能催化非酚類芳香族化合物(包括芳烴類污染物)的降解；漆酶是一類多酚氧化酶，對許多非酚類物質(zhì)如蒽，苯并芘，多環(huán)芳烴等具有高度的進(jìn)攻性，能高效氧化降解這類污染物。本發(fā)明將上述三種粗制品酶液按特定比例復(fù)配制成復(fù)合酶制劑并直接用于受PAH污染的土壤修復(fù)，具有處理簡單，見效周期短，效果顯著的特點(diǎn)，通過三種酶的協(xié)同作用可高效降解土壤中的多環(huán)芳烴(PAH)污染物，經(jīng)檢測，其對土壤PAH污染物的降解率高達(dá)70?80%，可實(shí)現(xiàn)污染土壤的高效脫毒及修復(fù)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0018]以下實(shí)施例1?實(shí)施例3所用粗制品酶液制備方法如下:
[0019]漆酶粗制品酶液:取購自CCTCC的密孔菌屬菌株P(guān)ycnoporus sp.SYBC_L3(保藏編號:CCTCC NO:M2010235)經(jīng)斜面培養(yǎng)，菌種活化，一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)(種子培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%)及發(fā)酵罐攪拌發(fā)酵(發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):麥芽糖12，豆柏 6，CuSO4.5Η200.4，KH2PO4I, Na2HPO40.2，MgS04.7Η200.5，MnSO4.H2O0.034)，發(fā)酵液真空抽濾，濾液經(jīng)超濾濃縮得濃縮漆酶粗制品酶液，漆酶酶活經(jīng)DMP法檢測酶活達(dá)10萬U/L以上。
[0020]猛過氧化物酶粗制品酶液:取購自CGMCC的黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium (保藏編號=CGMCC NO:5.0776)經(jīng)斜面培養(yǎng)，菌種活化，一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)(種子培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%)及發(fā)酵罐攪拌發(fā)酵(發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，酒石酸銨 10，KH2P042, MgS04.7Η200.5，MnSO4.H2Ol,CaCl2.2Η200.I，微量元素溶液(g/L): (NaCl2, FeSO4.7Η200.2，CoCl20.2，ZnSO4.7Η200.2，CuSO4.5Η200.2，KAl (SO4)2.12Η200.02，H3BO30.02，Na2MoO4.2Η200.04) 7ml, Tween-800.5)，發(fā)酵液真空抽濾，濾液經(jīng)超濾濃縮得濃縮錳過氧化物酶粗制品酶液，錳過氧化物酶酶活經(jīng)氧化Mn2+法檢測酶活達(dá)10萬U/L以上。
[0021]木素過氧化物酶粗制品酶液:取購自CGMCC的黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium (保藏編號:CGMCC NO:5.0776)經(jīng)斜面培養(yǎng),菌種活化,一級種子培養(yǎng),二級種子培養(yǎng)(種子培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%)及發(fā)酵罐攪拌發(fā)酵(發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 12，酒石酸銨 0.3，ΚΗ2Ρ042.5，MgS04.7Η200.7，黎蘆醇 0.5,VB10.001，微量元素溶液(g/L): (MnSO4.H2O0.5，NaClI，F(xiàn)eSO4.7Η200.1，CoCl20.2，CaCl2.2Η201.5，ZnSO4.7Η200.I ,CuSO4.5Η200.1，KAl (SO4) 2.12Η200.01 ,H3BO30.0LNa2MoO4.2Η200.01) 70ml,Tween-801 )，發(fā)酵液真空抽濾，濾液經(jīng)超濾濃縮得濃縮木素過氧化物酶粗制品酶液，木素過氧化物酶酶活經(jīng)氧化藜蘆醇法檢測酶活達(dá)3000U/L以上。
[0022]所采用可溶性淀粉為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品(AR級)。
[0023]以下實(shí)施例所用各儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)備。
[0024]實(shí)施例1修復(fù)復(fù)合酶制劑I
[0025]制備:
[0026](I)液化溶解:稱取漆酶粗制品酶液60% (V/V )，錳過氧化物酶粗制品酶液30% (V/V)，木素過氧化物酶粗制品酶液10% (V/V)及可溶性淀粉5% (W/V)，并加入封閉式恒溫攪拌器內(nèi)，攪拌速度IOOrpm,攪拌時間60min,溫度30°C,直至固形物完全溶解為止。
[0027](2)噴霧干燥:將步驟(I)所得復(fù)合酶液通過噴霧干燥器噴霧干燥，主要參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)口溫度180°C，出口溫度65°C，霧化器頻率50Hz，料液泵頻率5.5Hz，控制干燥后酶粉成品含水量為3%。
[0028](3)無菌封裝:將步驟(2)所制干燥酶粉送入自動無菌包裝機(jī)內(nèi)進(jìn)行無菌封裝，即得。
[0029]應(yīng)用:
[0030](I)先各配制0.lmol/L的檸檬酸溶液及0.lmol/L的磷酸二氫鈉溶液，再將檸檬酸溶液倒入磷酸二氫鈉溶液中，同時測PH值，直至pH值為4.0為止，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0031](2)將上述復(fù)合酶制劑成品以1:100 (W/V)的比例加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中溶解攪拌均勻，直至酶粉完全溶解為止。
[0032](3)將上述溶解的復(fù)合酶液噴灑于受PAH污染的土壤上直至污染底層，但不能滲透出復(fù)合酶液。一周后取樣檢測，測得受污染將土壤中PAH含量降解率達(dá)80% (參照IS018287-2006PAH多環(huán)芳烴檢測方法)。
[0033]實(shí)施例2修復(fù)復(fù)合酶制劑2
[0034]制備:
[0035](2 )液化溶解:稱取漆酶粗制品酶液55% (V/V)，錳過氧化物酶粗制品酶液30% (V/V)，木素過氧化物酶粗制品酶液15% (V/V)及可溶性淀粉10% (W/V)，并加入封閉式恒溫攪拌器內(nèi)，攪拌速度IOOrpm,攪拌時間45min,溫度25°C,直至固形物完全溶解為止。
[0036](2)噴霧干燥:將步驟(I)所得復(fù)合酶液通過噴霧干燥器噴霧干燥，主要參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)口溫度170°C，出口溫度60°C，霧化器頻率40Hz，料液泵頻率5Hz，控制干燥后酶粉成品含水量為4%。
[0037](3)無菌封裝:將步驟(2)所制干燥酶粉送入自動無菌包裝機(jī)內(nèi)進(jìn)行無菌封裝，即得。
[0038]應(yīng)用:
[0039](I)先各配制0.lmol/L的檸檬酸溶液及0.lmol/L的磷酸二氫鈉溶液，再將檸檬酸溶液倒入磷酸二氫鈉溶液中，同時測pH值，直至pH值為4.0為止；
[0040](2)將上述復(fù)合酶制劑成品以1:150 (W/V)的比例加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中溶解攪拌均勻，直至酶粉完全溶解為止。
[0041](3)將上述溶解的復(fù)合酶液噴灑于受PAH污染的土壤上直至污染底層，但不能滲透出復(fù)合酶液。一周后取樣檢測，測得受污染將土壤中PAH含量降解率達(dá)75% (參照IS018287-2006PAH多環(huán)芳烴檢測方法)。
[0042]實(shí)施例3修復(fù)復(fù)合酶制劑3
[0043]制備:
[0044](3 )液化溶解:稱取漆酶粗制品酶液55% (V/V)，錳過氧化物酶粗制品酶液25% (V/V)，木素過氧化物酶粗制品酶液20% (V/V)及可溶性淀粉10% (W/V)，并加入封閉式恒溫攪拌器內(nèi)，攪拌速度80rpm,攪拌時間55min,溫度25°C,直至固形物完全溶解為止。
[0045](2)噴霧干燥:將步驟(I)所得復(fù)合酶液通過噴霧干燥器噴霧干燥，主要參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)口溫度160°C，出口溫度70°C，霧化器頻率45Hz，料液泵頻率6Hz，控制干燥后酶粉成品含水量為5%。
[0046](3)無菌封裝:將步驟(2)所制干燥酶粉送入自動無菌包裝機(jī)內(nèi)進(jìn)行無菌封裝，即得。
[0047]應(yīng)用:
[0048](I)先各配制0.lmol/L的檸檬酸溶液及0.lmol/L的磷酸二氫鈉溶液，再將檸檬酸溶液倒入磷酸二氫鈉溶液中，同時測pH值，直至pH值為4.0為止；
[0049](2)將上述復(fù)合酶制劑成品以1:200 (W/V)的比例加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中溶解攪拌均勻，直至酶粉完全溶解為止。
[0050](3)將上述溶解的復(fù)合酶液噴灑于受PAH污染的土壤上直至污染底層，但不能滲透出復(fù)合酶液。一周后取樣檢測，測得受污染將土壤中PAH含量降解率達(dá)72% (參照IS018287-2006PAH多環(huán)芳烴檢測方法)。
[0051]綜上所述，將本發(fā)明修復(fù)復(fù)合酶制劑直接應(yīng)用于PAH污染土壤，PAH降解率高達(dá)70?80%，能實(shí)現(xiàn)污染土壤的高效脫毒及修復(fù)，處理方法簡單，見效周期短，效果顯著。
[0052]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例?？梢岳斫?，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，其特征在于由下述方法制得:將漆酶粗制品酶液50~60% (V/V)，錳過氧化物酶粗制品酶液20~30% (V/V)，木素過氧化物酶粗制品酶液10~20% (V/V)及可溶性淀粉5~10% (W/V)攪拌混合均勻，噴霧干燥，控制成品含水量為3~6%，無菌封裝，即得；所述漆酶粗制品酶液酶活> 10萬U/L，所述錳過氧化物酶粗制品酶液酶活> 10萬U/L，所述木素過氧化物酶粗制品酶液酶活> 3000U/L，所述可溶性淀粉為AR級。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，其特征在于:所述漆酶粗制品酶液由保藏編號為CCTCC NO:M2010235的密孔菌屬菌株P(guān)ycnoporus sp.SYBC-L3通過液體攪拌發(fā)酵制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，其特征在于:所述錳過氧化物酶粗制品酶液和木素過氧化物酶粗制品酶液由保藏編號為CGMCC NO:5.0776的黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium通過液體攪拌發(fā)酵制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，其特征在在于:所述攪拌混合在封閉式恒溫攪拌器內(nèi)進(jìn)行，攪拌速度50~IOOrpm,攪拌時間45~60min,溫度25 ~30?。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述降解土壤PAH污染物的修復(fù)復(fù)合酶制劑，其特征在在于:所述噴霧干燥通過噴霧干燥器實(shí)現(xiàn)，參數(shù)設(shè)定為進(jìn)口溫度160~180°C，出口溫度60~70°C，霧化器頻率40~50Hz料液泵頻率5~6Hz。
6.—種利用權(quán)利要求1~3任一項所述修復(fù)復(fù)合酶制劑修復(fù)土壤的方法,其特征在于:將所述修復(fù)復(fù)合酶制劑按質(zhì)量體積比1:100~200的比例溶解于pH4.0的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，攪拌均勻，再噴灑于污染PAH的土壤上使其滲透至污染底層，即可實(shí)現(xiàn)土壤脫毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述修復(fù)土壤的方法，其特征在于:所述檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液為現(xiàn)用現(xiàn)配。
【文檔編號】B09C1/10GK103691736SQ201310613699
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】趙曉聯(lián), 黃慶國, 周智慧, 廖祥儒, 王捷, 毛飛君 申請人:無錫市金坤生物工程有限公司