專利名稱：一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法以及一種將制備好的固定化微球在人工濕地中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量的增加，生活污水、醫(yī)藥污水、生活垃圾以及農(nóng)業(yè)大量施用化肥、農(nóng)藥導(dǎo)致水資源受到不同程度污染，其中硝酸鹽污染是水資源的主要污染類型之一。近年來，人工濕地在污水治理上發(fā)揮了重大作用。基質(zhì)、高等植物、微生物是人工濕地發(fā)揮凈化作用的三個主要因素。許多研究表明，濕地對氮的去除的首要因素是微生物的降解，基質(zhì)和濕地植物的作用相對較小。由于濕地中厭氧的條件比較缺乏，反硝化過程并不能完全進(jìn)行，所以對于傳統(tǒng)意義上的反硝化而言，氮的去除并不是很徹底。20 世紀(jì)70年代，固定化微生物技術(shù)開始應(yīng)用于工業(yè)廢水的生物處理。與其它應(yīng)用游離微生物的過程相比，固定化微生物技術(shù)可以使微生物在某一固定區(qū)域具有較高的密度，減輕或消除微生物的流失，提高反應(yīng)速度，同時便于培養(yǎng)優(yōu)勢微生物種群，提高處理過程的穩(wěn)定性， 減少或消除副反應(yīng)的發(fā)生，便于控制處理過程。目前，固定化微生物技術(shù)已成為國內(nèi)外生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研究的重點。好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用的一類反硝化菌。自20世紀(jì)80年代，Robertson等(Robertson et al. Archives of Microbiology, 1984,139, 351-354)在除硫和反硝化處理系統(tǒng)中首次分離出好氧反硝化菌以來，人們對于好氧反硝化菌的脫氮性能已經(jīng)進(jìn)行了一定程度上的研究，而且在此種細(xì)菌的包埋固定處理含氮廢水方面也進(jìn)行了一定的研究，但是將包埋固定化后的好氧反硝化菌應(yīng)用到濕地系統(tǒng)中還未見報道。目前，文獻(xiàn)中已經(jīng)出現(xiàn)了很多關(guān)于分別利用海藻酸鈉和聚乙烯醇作為固定化材料進(jìn)行反硝化的研究，但是對于聚乙烯醇這種合成高分子凝膠載體，它的抗微生物分解性好， 機械強度高，化學(xué)穩(wěn)定性好，但傳質(zhì)性能較差，在包埋細(xì)胞的過程中會降低細(xì)胞的活性；而海藻酸鈉這種天然高分子凝膠載體對微生物無毒性，傳質(zhì)性能好，但強度較低，厭氧條件下易被微生物分解，使用壽命短。所以，基于上述兩種材料的優(yōu)缺點，本發(fā)明將這兩種包埋材料結(jié)合起來進(jìn)行研究，克服其各自的缺點，將更有利于增強固定化小球的各種性能，以便于更好的進(jìn)行固定化小球的脫氮研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法，即采用海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋法對好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行固定化具有固定化微球機械強度高， 穩(wěn)定性好，反硝化活性高以及使用壽命長等優(yōu)點，海藻酸鈉價格便宜，生物相容性好；其工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)污水處理上應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌在人工濕地中的應(yīng)用，即將固定化小球填充到人工濕地中進(jìn)行好氧反硝化脫氮有效降低水中硝態(tài)氮的含量，并使亞硝態(tài)氮的殘留量幾乎為零；彌補了人工濕地中厭氧環(huán)境缺乏導(dǎo)致的脫氮效率低下的不足。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案—種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法，其步驟是1)從增氧型復(fù)合垂直流人工濕地中篩選出好氧反硝化菌株，在恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌株的篩選培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基組成是瓊脂20g，硝酸鉀lg，磷酸二氫鉀lg，六水氯化亞鐵0.5g，七水氯化鈣0. 2g，七水硫酸鎂lg，琥珀酸鈉8. 5g，溴瑞香草酚蘭試劑ImL ；蒸餾水IOOOmL,用 Imol · Γ1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 3 ；2)好氧反硝化細(xì)菌的菌懸液的制備挑選1-2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到經(jīng)過高溫高壓121 105-1 IOkPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在30°C下曝氣培養(yǎng)5天，得到菌液；將得到的菌液離心， 棄去上清液，用0. 9% w/v生理鹽水離心洗滌2-3次，再用0. 9% w/v生理鹽水稀釋到500ml 左右(菌體生理鹽水=20 250v/v)，混合均勻，4°C貯藏備用；所述富集培養(yǎng)基組成是雙蒸水750mL，硝酸鉀2g，磷酸二氫鉀lg，磷酸氫二鉀lg， 硫酸鎂0. 2g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL ；3)用海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋獲得固定化好氧反硝化菌5% w/v聚乙烯醇和5% w/v海藻酸鈉的混合溶液60mL，微波加熱，使其完全混合， 高溫高壓滅菌1211，105-110迚￡1，冷卻至室溫，與801^好氧反硝化菌懸液充分混合；將此混合液用注射器擠入到4% w/v的氯化鈣溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球；將形成的小球放置于4°C冰箱中交聯(lián)固化ll_13h，用無菌水清洗小球，再放入飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)固化ll_13h，用生理鹽水洗滌2-3次備用；一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌在人工濕地中的應(yīng)用，其步驟是1)活化上述固定化小球?qū)⒅苽洳襟E3制得的好氧反硝化細(xì)菌固定化小球從冰箱中取出，用雙蒸水或者 0.9% w/v的生理鹽水洗滌3-4次，然后浸泡在0. 9% w/v的生理鹽水中，曝氣約11-1 以活化固定化小球；2)人工濕地脫氮研究將固定化小球填充到人工濕地模擬柱中，進(jìn)行廢水脫氮處理研究。實驗結(jié)果與實施例3相同。與已有的包埋法相比，具有以下優(yōu)點和效果具有固定化微球機械強度高，穩(wěn)定性好，脫氮效率高，亞硝態(tài)氮積累量低，反硝化活性高，將其作為基質(zhì)填充在濕地中，能有效降低水中硝態(tài)氮的含量，并使亞硝態(tài)氮的殘留量幾乎為零；彌補人工濕地厭氧環(huán)境缺乏導(dǎo)致的脫氮效率地下的缺點；海藻酸鈉價格便宜，生物相容性好；其工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)污水處理上應(yīng)用，脫氮效率高，亞硝態(tài)氮積累量低，使用壽命長的優(yōu)點。使用固定化微球進(jìn)行實驗室小試試驗，進(jìn)水采用模擬廢水，其中C0D&約為400mg/L左右，硝態(tài)氮的濃度約為80mg/L左右，當(dāng)水力停留時間為36h時，硝態(tài)氮的去除率達(dá)到了 98%以上，并且亞硝態(tài)氮的殘留量趨近于零。


圖1為3種固定化小球好氧反硝化速率變化曲線。將使用3種不同固定化技術(shù)進(jìn)行包埋的好氧反硝化微球投入到等體積的液體培養(yǎng)基中，每池對其中硝態(tài)氮的濃度進(jìn)行測定，得平均好氧反硝化速率。所述培養(yǎng)基組成如下雙蒸水750mL，硝酸鉀2g，磷酸二氫鉀lg，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0. 2g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL ；圖2為進(jìn)行廢水脫氮處理的人工濕地模擬柱結(jié)構(gòu)示意圖。設(shè)置3組人工濕地模擬柱，分別標(biāo)記為A、B、C。其中，A、B、C中1都表示填埋的是新鮮的陶粒層，2分別表示填充了好氧反硝化固定化微球、使用好氧反硝化菌懸液浸泡的陶粒、大小相等的新陶粒，3表示水層。圖3為三種不同基質(zhì)填埋條件下硝態(tài)氮的去除率曲線。系統(tǒng)A、B、C與圖2中的A、B、C相同。圖4為三種不同基質(zhì)填埋條件下亞硝態(tài)氮的積累量曲線。系統(tǒng)A、B、C與圖2中的A、B、C相同。
具體實施例方式實施例1 一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法，其步驟是1)從增氧型復(fù)合垂直流人工濕地中篩選出好氧反硝化菌株，在恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌株的篩選培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基組成是瓊脂20g，硝酸鉀lg，磷酸二氫鉀lg，六水氯化亞鐵0.5g，七水氯化鈣0. 2g，七水硫酸鎂lg，琥珀酸鈉8. 5g，溴瑞香草酚蘭試劑ImL ；蒸餾水IOOOmL,用 Imol · Γ1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 3。2)好氧反硝化細(xì)菌的菌懸液的制備挑選1-2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到750mL經(jīng)過高溫高壓121°C， 105-1 IOkPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在30°C下曝氣培養(yǎng)5天，得到菌液；將得到的菌液離心， 棄上清，0. 9% w/v生理鹽水離心洗滌2-3次，用0. 9% w/v的生理鹽水稀釋到500ml左右 (菌體生理鹽水=20 250v/v)，混合均勻，4°C貯藏備用所述富集培養(yǎng)基組成是雙蒸水750mL，硝酸鉀2g，磷酸二氫鉀lg，磷酸氫二鉀lg， 硫酸鎂0. 2g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL ；3)用海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋所獲得的好氧反硝化菌5 % w/v聚乙烯醇和5 % w/v海藻酸鈉的混合溶液60mL，加熱使其完全混合，高溫高壓121°C，105-1 lOltfa滅菌，冷卻至室溫，與SOmL好氧反硝化菌懸液充分混合；將此混合液用針筒擠入到4% w/v氯化鈣溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球；將形成的小球放置于4°C冰箱中交聯(lián)固化11-1 后，用無菌水清洗小球，再放入飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)固化11-1 后，用生理鹽水洗滌2-3次備用。4)用海藻酸鈉和聚乙烯醇分別包埋所獲得的好氧反硝化菌海藻酸鈉固定法稱取4g海藻酸鈉溶解到60mL的0. 9% w/v的生理鹽水中，高溫高壓121°C，105-1 IOkPa滅菌，冷卻至室溫，與SOmL好氧反硝化細(xì)菌懸浮液充分混合，滴入4% w/v氯化鈣溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球；將形成的小球放置于4°C冰箱中交聯(lián)固化22-2 ，用生理鹽水洗滌2-3次備用。聚乙烯醇固定法配制60mL 10 % w/v的聚乙烯醇溶液，高溫高壓121 °C， 105-1 IOkPa滅菌，冷卻到室溫，與SOmL好氧反硝化菌懸液充分混合，滴入飽和硼酸溶液中， 冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球；將形成的小球放置于4°C冰箱中交聯(lián)固化 22-25h后，用生理鹽水洗滌2-3次備用。5)活化固定化小球?qū)⒅苽洳襟E3中所制得的好氧反硝化細(xì)菌固定化小球從冰箱中取出，用雙蒸水或者0. 9% w/v的生理鹽水洗滌3-4次，然后浸泡在0. 9% w/v的生理鹽水中，曝氣11-1 以活化固定化小球。6)將制備步驟5中的固定化小球放入制備步驟2所述的液體培養(yǎng)基中，每2小時采樣一次，則制備步驟3，4中所得固定化小球不同階段的平均好氧反硝化速率如圖1所示。 前Mi的平均好氧反硝化速率SAL小球> SAL+PVA小球> PVA小球，分別為45. 85mg Γ1 .tT1， 45. 70mg · L-1 · IT1，26. 7 Img · L-1 · IT1。實施例2 將實施例1中制備步驟1-5制得的等量的三種固定化小球分別置于0. Olmol化人 0. Imol · IAlmol · L-1 的 HCl 禾口 NaOH、lmol · L-1 的 NaCl、CaCl2、KH2PO4 等溶液中浸泡 24h, 觀察固定化小球的完好性及強度等的變化。結(jié)果如表1所示，海藻酸鈉-聚乙烯醇固定化小球在酸堿鹽溶液中具有更好的穩(wěn)定性。表1 3種載體包埋固定化小球在酸、堿、鹽溶液中的穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法其步驟是1)從增氧型復(fù)合垂直流人工濕地中篩選出好氧反硝化菌株，在恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌株的篩選培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基組成是瓊脂20g，硝酸鉀lg，磷酸二氫鉀lg，六水氯化亞鐵 0.5g，七水氯化鈣0.2g，七水硫酸鎂lg，琥珀酸鈉8. 5g，溴瑞香草酚蘭試劑ImL;蒸餾水 IOOOmL,用Imol 廠1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 3 ；2)好氧反硝化細(xì)菌的菌懸液的制備挑選1-2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到經(jīng)過高溫高壓121°C，105-110kPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在30°C下曝氣培養(yǎng)5天，得到菌液，將得到的菌液離心，棄去上清液，用 0. 9%w/v生理鹽水離心洗滌2-3次，再用0. 9%w/v生理鹽水稀釋到500ml左右(菌體生理鹽水=20 :250v/v)，混合均勻，4°C貯藏備用；所述培養(yǎng)基組成是雙蒸水750mL，硝酸鉀2 g，磷酸二氫鉀1 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸鈉5 g，微量鹽溶液2mL;3)用海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋獲得的固定化好氧反硝化菌5%w/v聚乙烯醇和5%w/v海藻酸鈉的混合溶液60mL，微波加熱，使其完全混合，高溫高壓滅菌121°C，105-110kPa，冷卻至室溫，與SOmL好氧反硝化菌懸液充分混合；將此混合液用注射器擠入到4%w/v氯化鈣溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球；將形成的小球放置于4°C冰箱中交聯(lián)固化ll_13h，用無菌水清洗小球，再放入飽和硼酸溶液中， 于4°C冰箱中交聯(lián)固化ll_13h，用生理鹽水洗滌2-3次備用。
2.權(quán)利要求1所述的一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌在人工濕地中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高人工濕地脫氮效率的固定化細(xì)菌制備方法及應(yīng)用。1.制備步驟1)在恒溫箱中篩選培養(yǎng)從人工濕地中篩選出的好氧反硝化菌株；2)挑選斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，接種到滅菌的富集培養(yǎng)基中，曝氣，得到菌懸液；3)用海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋獲得的固定化好氧反硝化細(xì)菌；4)將好氧反硝化細(xì)菌小球從冰箱中取出，用雙蒸水或生理鹽水洗滌后，浸泡在生理鹽水中，曝氣以活化固定化小球。2.固定化細(xì)菌在人工濕地中的應(yīng)用將固定化小球填充到人工濕地模擬柱中，進(jìn)行廢水脫氮處理。此種固定化細(xì)菌制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)污水處理上應(yīng)用，脫氮效率高，亞硝態(tài)氮積累量低，使用壽命長。
文檔編號C02F3/02GK102392011SQ20111032085
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者吳振斌, 周巧紅, 張燕, 徐棟, 王瑩, 賀鋒 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所