專利名稱：脫除水體中亞硝酸態(tài)氮素污染的產堿桿菌mb-n6及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物治理污染領域，具體涉及一種治理廢水或環(huán)境中有毒物質的微 生物菌株以及它的用途。
背景技術：
水產養(yǎng)殖和環(huán)境保護中，氮素污染尤其是氨氮和亞硝酸鹽氮的污染對許多水產動 物有一定的毒害作用。因養(yǎng)殖水體的環(huán)境承載能力有限，其自身氮素污染日趨嚴重，養(yǎng)殖水 域的環(huán)境質量日益下降。水域環(huán)境污染不僅直接對養(yǎng)殖品種造成危害，而且可通過改變水 域的微生態(tài)，使得病原微生物滋生繁衍，導致養(yǎng)殖品種暴發(fā)病的發(fā)生。在養(yǎng)殖水域氮素污染 的控制上，以往一般采用單一的理化方法，雖然取得了一定的成效，但同時存有種種弊端， 如能源消耗過大，易產生二次污染等。因此生物控制技術便得到人們的重視。目前國內外 一般采用單一或復合微生態(tài)菌種來控制氮素污染。二十世紀八十年代，我國的臺灣省和東 南亞等國率先應用光合細菌來控制養(yǎng)殖水體的水質，取得了一定的成果，并開創(chuàng)了生物制 劑控制養(yǎng)殖水質的先河。九十年代后國內也采用光合細菌來凈化養(yǎng)殖水域環(huán)境，效果比較 明顯。九十年代中期開始，國內外又采用如玉壘菌、硝化細菌等生物制劑來凈化水質，效果 也不錯。這些生物處理的方法，由于具有投資少，成本低，應用范圍廣等特點，已越來越受水 產工作者的重視和歡迎。因此研制高效與專一的復合微生態(tài)制劑調控養(yǎng)殖水體環(huán)境，促進 水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保證水產品質量及降低成本具有非常重要的意義。目前普遍認 為生物脫氮是從水體中去除氮素污染的經濟有效的方法之一。在此基礎上，國內外在90年代后期大量采用復合微生態(tài)制劑技術。復合微生態(tài) 制劑技術是脫除不同種屬微生物的不同性質，通過微生物的互生和共生作用，最大限度地 去除水體中的各種有害成分。目前應用較為成功的是EM菌。但這些產品均是從國外引進 的，國外最初在研制這些產品時并非從水產養(yǎng)殖水體控制的目標出發(fā)，而主要側重于環(huán)保 領域。因此在菌株的選擇上主要考慮其降解性能，沒有考慮其對水產養(yǎng)殖生物的安全性問 題。如有些產品中含有熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)等，這些菌株對養(yǎng)殖水 生生物來說是致病菌。綜合來看目前尚無一種比較適合我國水產養(yǎng)殖業(yè)的高效復合菌制劑 及其控制技術。傳統(tǒng)生物脫氮包括硝化和反硝化兩作用過程。一般認為硝化作用只發(fā)生在好氧 條件下，而反硝化只能在厭氧或缺氧的條件下進行。但是，在蝦等特產高密度養(yǎng)殖中，由于 必須連續(xù)充氧以保證水中一定的溶解氧，厭氧反硝化細菌的反硝化作用不能充分發(fā)揮(Pai s L, Chong N M, Chen C H. Bioresource Technology, 1999,68 179—85)。20 世紀 80 年代 以來，科學家對好氧反硝化的研究日趨活躍，一些好氧反硝化菌被陸續(xù)篩選出來作為新型 脫氮細菌。目前國外已發(fā)現的好氧反硝化菌有異養(yǎng)球硫細菌(Thiosphaera Pantotropha) (Robertson, L. Α. ,Ε. W. J. van Niel, R. A. M. Torres mans, et al. Appl. Environ. Microbiol, 1988,54 :2812-2818.)、海洋假單胞菌(Pseudomonas nautical) (Frette L, Gejlsbjerg B, Westermann P. FEMS Microbiology Ecology, 1997,24 :363_370.)和奈瑟菌科的
3Microvirgula aerodenitrifica等。國內對好氧反硝化菌的篩選、研究和應用研究還處于 起步階段。目前尚未見到有關專門篩選選育可脫除亞硝酸鹽氮、改良水體氮素富營養(yǎng)化的菌 株以及微生物制劑和它的用途方面的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，克服現有技術的缺陷，通過人工馴化，篩選得到一株好氧反硝 化菌，研究了在不同濃度亞硝酸鹽氮、硝態(tài)氮和多種配合菌協同條件下該菌反硝化能力的 強弱，并且試驗了混合微生物菌劑降解氨態(tài)氮和實際大田應用的效果，探討了該菌和脫氮 微生物制劑脫除水中亞硝酸鹽氮和氨氮的能力，為水產養(yǎng)殖生物除氮尋求了更為高效、經 濟的水質改良方法。本發(fā)明通過以下技術方案實現本發(fā)明所述的脫除廢水或環(huán)境中殘留的亞硝酸鹽氮的菌株，是產堿桿菌 (Alcaligenes sp. )MB_N6，保藏在 CCTCC,保藏編號 M2010014。一種脫除微生物菌株脫除廢水或環(huán)境中殘留的亞硝酸鹽氮的方法，是用產堿桿菌 CCTCCM2010014脫除廢水中殘留的亞硝酸鹽氮。本發(fā)明公開了上述產堿桿菌在脫除水體中亞硝酸態(tài)氮素污染中的應用。本發(fā)明所述的亞硝酸鹽氮素是亞硝酸及其可溶性鹽。本發(fā)明所用的菌株分離篩選方法、脫除力測定方法及所分離篩選得到的菌株的特 性如下采集南京市一市政污水處理廠曝氣池污污水樣品本，依據Naoki Takaya等建立的 有氧反硝化菌平板分離方法進行初步篩選。將菌落劃線培養(yǎng)于添加亞硝酸鹽的培養(yǎng)基進行 復篩和純化。通過測定純化菌株對亞硝酸鹽的降解能力作進一步的驗證。將初篩時出現的 陽性結果挑選到反硝化培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)并測定硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮濃度。根據亞硝 酸鹽氮脫除的速度和能力選出的高活性反硝化細菌取合適稀釋度的純培養(yǎng)菌液涂平板培 養(yǎng)。待長出菌落后，觀察菌落的大小、顏色等特征。革氏染色，顯微鏡觀察其個體形態(tài)。經 革蘭氏染色陰性，芽孢染色觀察，不產芽孢。葡萄糖氧化不產酸產氣，接觸酶試驗陽性，吲哚 試驗陰性，甲基紅試驗陽性，伏普試驗陰性，檸檬酸鹽試驗陰性，硫化氫試驗陰性。經《伯杰 氏細菌鑒定手冊》鑒定，初步鑒定該菌為產堿桿菌。將其命名為MB-N6。菌株MB-N6的系統(tǒng) 發(fā)生樹的結構如圖1所示。菌株MB-N6于2010年1月18日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位 地址武漢大學。分類命名為產堿桿菌MB-N6 (Alcaligenes sp. MB-N6)，保藏在，保藏編號 CCTCCNo. M2010014ο在好氧條件下菌株MB-N6對亞硝酸鹽氮的脫除實驗證明，在最適脫除溫度下 MB-N6菌株在60小時內對不同濃度的亞硝酸鹽氮均有反硝化能力，且亞硝酸鹽氮濃度越高 反硝化能力越強?，F據報道已知多數反硝化菌的反硝化能力在50%左右，而MB-N6菌株最 高反硝化脫除能力可達78%，明顯高于其他。在脫除過程中沒有積累中間代謝產物。且在 不同濃度的硝態(tài)氮脅迫條件下，MB-N6均可在60小時內高效脫除亞硝酸鹽氮，反硝化能力 增強達到90%以上，反硝化能力提高。
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采用對氨氮脫除和蛋白質降解效果較好的菌株MB-HKF(購自南京尊微生物技術 有限公司)和MB-LA(購自南京尊微生物技術有限公司)與MB-N6協同作用脫除亞硝酸鹽 氮試驗方法證明混合菌劑在模擬自然水體中能有效脫除氨態(tài)氮素，其脫除率在48小時內 達到最大。將混合菌劑田間對亞硝酸鹽氮和氨氮脫除顯示使用混合菌劑后亞硝酸鹽氮和氨 氮濃度均有顯著降低，同時水色在使用后有明顯改善，由含有綠藻和綠藻的青綠色轉變?yōu)?含有綠藻和硅藻的黃綠色。本發(fā)明的積極效果亞硝酸鹽是一種有毒、致癌的化合物，對含亞硝酸鹽廢水的處理是環(huán)保工作者面 臨的重要課題。本發(fā)明分離篩選的脫除亞硝酸鹽氮的產堿桿菌菌株MB-N6不但具有較強的 好氧脫除亞硝酸鹽氮的能力，和其他微生物復配后能更好的發(fā)揮好氧反硝化作用，其性能 穩(wěn)定。菌株MB-N6是從污水處理系統(tǒng)中取樣，并經過馴化和純化分離出來的，對有毒環(huán)境有 一定的適應能力，有望在含亞硝酸鹽廢水處理中發(fā)揮重要作用。


圖1 是基于16S rDNA序列同源性構建的本發(fā)明菌株MB-N6和其它相關細菌的系 統(tǒng)發(fā)生樹。圖2 是本發(fā)明的產堿桿菌MB-N6對不同濃度亞硝酸鹽氮的脫除曲線。圖中縱坐 標代表亞硝酸鹽氮的濃度；橫坐標代表時間。圖3 是本發(fā)明的產堿桿菌MB-N6在不同硝酸鹽氮濃度下對亞硝酸鹽氮的脫除曲 線。圖中縱坐標代表亞硝酸鹽氮的濃度；橫坐標代表時間。圖4 是本發(fā)明的產堿桿菌MB-N6和另外兩種功能菌復配后制成的微生物制劑對 亞硝酸鹽氮的脫除曲線。圖中縱坐標代表亞硝酸鹽氮的濃度；橫坐標代表時間。圖5 是本發(fā)明的產堿桿菌MB-N6和另外兩種功能菌復配后制成的微生物制劑對 氨氮的脫除曲線。圖中縱坐標代表氨氮的濃度；橫坐標代表時間。
具體實施例方式本發(fā)明所述培養(yǎng)基配方中百分數均指質量百分數實施例一、菌株MB-N6的分離篩選(1)樣品采集和馴化采集南京市江心洲污水處理廠曝氣池污污水樣品本。將樣品放置于20 30°C搖 床150r/min，并經常向其中添加一定量的亞硝酸鹽以對其中的微生物進行馴化。經過幾個 月處理后，即開始從該樣品中分離亞硝酸鹽氮脫除菌株。剩余樣品繼續(xù)按上述方法保存和 馴化。(2)菌株分離篩選分離篩選用溴百里酚(BTB)培養(yǎng)基0. L-天冬酰胺酸，0. KN03，0. KH2P04,0. 005 % FeC12 · 6H20,0. 02 % CaCl2 · 2H20,0. 1 % MgS04 · 7H20,0. 1 % BTB, 2 % 瓊 脂，ρΗ 7. 0 7. 2，培養(yǎng)基呈墨綠色。溴百里酚(BTB)培養(yǎng)基配方為上述液體培養(yǎng)基再添 加瓊脂1.6%。LB培養(yǎng)基蛋白胨，0. 酵母膏，0. 8% NaCl，pH 7. 0 7. 5。以上培養(yǎng)基配制后均采用濕熱滅菌(121°C ) 30分鐘。菌株純化將BTB培養(yǎng)基加熱熔化，搖勻后倒平板。挑取在無機鹽固體培養(yǎng)基平板 上長出的藍色菌落，劃線接種于其表面，置28°C培養(yǎng)24 48小時。挑取單菌落，按上述方 法再次純化一至三次，直至最后長出的菌落均一、鏡檢后確定為純種為止。亞硝酸鹽氮脫除能力測定脫除力測定用反硝化培養(yǎng)基，其配方為0. 472%琥珀 酸鈉，10mmol/L NaNO3,0. 11% KH2PO4,0. 042% Na2HPO4,0. 06% NH4Cl, 0. 5 % 酪蛋白，0. 1% MgSO4 · 7H20, 2mL的微量元素溶液/L，pH 7. 2。。濕熱滅菌(121°C ) 30分鐘。亞硝酸鹽氮于 接種前分別添加。用接種環(huán)挑取2 3環(huán)純化菌株，接種于上述添加亞硝酸鹽氮的反硝化 培養(yǎng)基中，置28°C搖震培養(yǎng)2 7天。將培養(yǎng)液離心，采用N-(l-萘基)-乙二胺鹽酸比色 法測定一次樣品中的亞硝酸鹽氮含量。采用有氧反硝化菌平板分離方法初篩得到6個BTB陽性反應菌株，搖瓶復篩中發(fā) 現其中1株即使周圍有較高濃度溶解氧存在仍具有較強的反硝化能力。經革蘭染色，鏡檢 觀察，該菌株為革蘭陰性桿菌、短桿狀、不產芽孢、不發(fā)酵葡萄糖產酸產氣。將其命名為菌株 ΜΒ-Ν6。實施例二、斜面菌種及其培養(yǎng)培養(yǎng)基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15 20g，水1000 毫升，pH7. 2。培養(yǎng)基分裝試管(18X 180mm)，裝量10ml，塞上棉塞，濕熱滅菌(121°C ) 30分 鐘。待溫度降至50°C左右時，搖勻后擺成斜面。采用無菌操作接種MB-N6菌株于試管斜面，28°C培養(yǎng)24 48小時，肉眼觀察菌苔 豐滿。置4°C可保存三個月至六個月。實施例三、菌株MB-N6在液態(tài)條件下對亞硝酸鹽氮的脫除(1)菌株MB-N6在LA培養(yǎng)基表面擴大培養(yǎng)LA培養(yǎng)基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培養(yǎng)基濕熱滅菌(121°C)30分鐘。將上述固體培養(yǎng)基加熱熔化，待溫度 降至50°C左右時搖勻倒平板。取試管斜面菌種，接種于液體LA培養(yǎng)基中，置28°C培養(yǎng)24 48小時。(2)對亞硝酸鹽氮的脫除人工模擬池塘母液蔗糖27. 5克，酵母膏0. 3克，NH4Cl 7. 3克，KH2PO4 2. 5克， K2HPO4 · 3Η201· 3克，NaHCO3 33. 0克，水1000ml。將母液稀釋60倍后作使用液。濕熱滅菌 (121°C)30分鐘。根據實驗要求，將50-150mg/L的亞硝酸鹽氮于接種前添加。用接種環(huán) 挑取2 3環(huán)試管斜面菌種，接種于上述添加亞硝酸鹽氮的人工模擬池塘污水培養(yǎng)基中，置 28°C搖震培養(yǎng)4 7天，培養(yǎng)過程中取樣測定培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽氮含量。方法為將培養(yǎng) 液離心，每12h采用N-(l-萘基)-乙二胺鹽酸比色法測定一次樣品中的亞硝酸鹽氮含量。在上述液態(tài)條件下，菌株ΜΒ-Ν6對亞硝酸鹽氮的最適脫除溫度為25-30°C，脫除 期在25-30°C溫度下為12-60h ；在15°C溫度下，48h開始脫除。在最適脫除溫度下MB-N6 菌株在60小時內對不同濃度的亞硝酸鹽氮均有反硝化能力，且亞硝酸鹽氮濃度越高反硝 化能力越強。現據報道已知多數反硝化菌的反硝化能力在50%左右，而MB-N6菌株最高反 硝化脫除能力可達78%，明顯高于其他。典型的脫除曲線見圖2所示。實施例四、菌株MB-N6在硝態(tài)氮脅迫下對亞硝酸鹽氮的脫除
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(1)菌株MB-N6在添加亞硝酸鹽氮的LA培養(yǎng)基表面擴大培養(yǎng)和活化LA培養(yǎng)基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培養(yǎng)基濕熱滅菌(121°C)30分鐘。將上述固體培養(yǎng)基加熱熔化，待溫度 降至50°C左右時搖勻倒平板。取試管斜面菌種，接種于液體LA培養(yǎng)基中，置28°C培養(yǎng)24 48小時。(2)在硝態(tài)氮脅迫下對亞硝酸鹽氮的脫除人工模擬池塘母液蔗糖27. 5克，酵母膏0. 3克，NH4Cl 7. 3克，KH2PO4 2. 5克， K2HPO4 · 3Η201· 3克，NaHCO3 33. 0克，水1000ml。將母液稀釋60倍后作使用液。濕熱滅菌 (12ΓΟ30分鐘。根據實驗要求，調整初始亞硝酸鹽氮濃度為30mg/L，硝態(tài)氮濃度分別為 50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L ；在 30°C，100r/min 搖床培養(yǎng) 60h，培養(yǎng)基 DO 值為(9.0士0.5)mg/L。每12h采用N-(l-萘基)-乙二胺鹽酸比色法測定一次樣品中的亞 硝酸鹽氮含量。在不同濃度的硝態(tài)氮脅迫條件下，ΜΒ-Ν6均可在60小時內高效脫除亞硝酸鹽氮， 反硝化能力增強達到90%以上，反硝化能力提高。實施例五、菌株ΜΒ-Ν6和其他功能菌復配制劑對亞硝酸鹽氮和氨氮的脫除(1)菌株ΜΒ-Ν6、BMB-LA和BMB-HKF的擴大培養(yǎng)和活化LA培養(yǎng)基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培養(yǎng)基濕熱滅菌(121°C)30分鐘。將上述固體培養(yǎng)基加熱熔化，待溫度 降至50°C左右時搖勻倒平板。分別取試管斜面菌種，接種于液體LA培養(yǎng)基中，置28°C培養(yǎng) 24 48小時。按照3 2 1的比例進行復配制成混合制劑。(2) MB-N6和其他功能菌BMB-LA、BMB-HKF復配制劑對亞硝酸鹽氮和氨氮的脫除將混合菌劑接種于IOOmL無氮源人工模擬池塘水三角瓶中，調整初始亞硝酸鹽氮 濃度為 211^/1，301，10017/1^11搖床培養(yǎng)6011，培養(yǎng)基00值為(10. 0士0. 5)mg/L。每 12h 采 用N-(l-萘基)-乙二胺鹽酸比色法測定一次樣品中的亞硝酸鹽氮含量。結果顯示(圖3)， 在模擬自然水體的亞硝酸鹽氮濃度下，配合菌協同ΜΒ-Ν6脫除亞硝酸鹽氮的速度很快，脫 除率在12小時內即可達到95%以上。相比較ΜΒ-Ν6單獨進行反硝化脫除亞硝酸鹽氮，加入 配合菌后其脫除率有了較大提高。將混合菌劑轉接IOOmL無氮源人工模擬池塘水三角瓶中；調整初始氨態(tài)氮濃度為 10mg/L, 30°C，100r/min搖床培養(yǎng)60h混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基DO值為(8. 0 士0. 5)mg/L ；每12h按 納氏比色法測定一次樣品中的氨氮含量。結果顯示(圖4)，混合菌劑在模擬自然水體中能 有效脫除氨態(tài)氮素，其脫除率在48小時內達到最大。實施例六、菌株MB-N6和其他功能菌復配制劑在大田條件下對亞硝酸鹽氮和氨氮 的脫除(1)菌株MB-N6、MB-LA和MB-HKF的擴大培養(yǎng)和活化擴增培養(yǎng)基一級培養(yǎng)基蛋白胨，葡萄糖2%，0. 5% NaCl, 0. 5%酵母浸取汁， pH 7. 0 7. 5 ；二級培養(yǎng)基蛋白胨，葡萄糖 2%，0. 5% NH4H2PO4,0. 3 % KH2PO4,0. 2% MgSO4,0. 2%酵母膏，3mL的微量元素素溶液化―1，pH 7. 0 7. 5。挑取單菌落分別將MB-N6、 MB-LA和MB-HKF接種一級培養(yǎng)基，過夜活化。按1 %接種量轉接擴增二級培養(yǎng)基，30°C， 120r/min搖床培養(yǎng)48h。把三種擴培的菌液按3 2 1的比例復配制成混合菌劑。
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(2) MB-N6和其他功能菌MB_LA、MB_HKF復配制劑大田條件下對亞硝酸鹽氮和氨氮 的脫除2007年8月，在江蘇省吳江市某南美白對蝦養(yǎng)殖池塘中先后進行了兩次田間試 驗第一次塘口面積12. 5畝，水深1. 3米，水體中初始氨氮濃度0. 5mg mg/L，亞硝酸鹽氮濃 度0.9mg/L。使用濃度2畝 米/500mL(0.25mg mg/L)；第二次使用，塘口面積15畝，用量3 畝 米/500mL (0. 167mgmg/L)，水體中亞硝酸鹽氮初始濃度0. 35mg/L,氨氮初始濃度0. 4mg/ L。分別各連續(xù)使用六天。通過試劑盒測定池塘水中亞硝酸鹽氮和氨氮的含量；通過水色觀 察水質是否得到改善。結果顯示(表1、表2)，使用混合菌劑后亞硝酸鹽氮和氨氮濃度均有顯著降低，同 時水色在使用后有明顯改善，由含有綠藻和綠藻的青綠色轉變?yōu)楹芯G藻和硅藻的黃綠 色。表1是本發(fā)明的復配微生物制劑在第一次田間實驗時對亞硝酸鹽氮和氨氮的脫 除情況。表2是本發(fā)明的復配微生物制劑在第一次田間實驗時對亞硝酸鹽氮和氨氮的脫
除情況。
權利要求
一種產堿桿菌菌株，其特征在于，是產堿桿菌MB N6(Alcaligenes sp.MB N6)，保藏編號是CCTCC M2010014。
2.權利要求1所述產堿桿菌在脫除水體中亞硝酸態(tài)氮素污染中的應用。
3.根據權利要求2的所述的應用，其特征在于，所述的亞硝酸鹽氮素是亞硝酸及其可 溶性鹽。
全文摘要
本發(fā)明屬于治理水產養(yǎng)殖及廢水中氮素污染的微生物菌株的發(fā)明以及該菌株在好氧條件下脫除亞硝酸鹽氮和其它殘留物質的用途發(fā)明。本發(fā)明的主要特征包括，馴化篩選和選育成一種專門在好氧條件下脫除亞硝酸鹽氮的產堿桿菌菌株MB-N6(Alcaligenes sp.MB-N6)，保藏編號是CCTCC M2010014。該菌株可在高溶氧條件下充分脫除目前水產養(yǎng)殖中產生的高濃度亞硝酸鹽氮的污染。與已有技術相比，本發(fā)明的菌株專一性和適應性強，便于增殖和脫除開發(fā)。
文檔編號C02F3/02GK101914464SQ20101016611
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權日2010年5月7日
發(fā)明者何偉, 鐘文輝 申請人:南京師范大學