本發(fā)明涉及免疫分析和過敏性疾病診斷，特別涉及一種用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、食物過敏(fa)在世界范圍內(nèi)非常普遍，正在成為一個重大的公共衛(wèi)生問題。據(jù)估計，全世界有超過2.2億人患有食物過敏。流行病學(xué)研究表明，全球范圍內(nèi)食物過敏的患病率呈上升趨勢。其中，食品過敏原主要有八大類，分別為：含有麩質(zhì)的谷物及其制品、甲殼綱類動物及其制品、魚類及其制品、蛋類及其制品、花生及其制品、大豆及其制品、乳及乳制品、堅果及其果仁類制品。當(dāng)食物過敏患者接觸到過敏食品(含有過敏原)，均可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)，這些反應(yīng)包括呼吸道(哮喘等)、消化道(腸炎等)、皮膚(蕁麻疹等)等癥狀，最嚴(yán)重的可能危及生命。因此開發(fā)過敏診斷技術(shù)，使過敏患者明確自身過敏原，避開過敏食物，能夠有效避免過敏反應(yīng)的發(fā)生。

2、現(xiàn)有診斷技術(shù)可以分為體內(nèi)診斷技術(shù)(人體上進(jìn)行)和體外診斷技術(shù)(采集血液等)兩大類。體內(nèi)診斷技術(shù)包括食物激發(fā)實(shí)驗(yàn)、皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)、斑貼試驗(yàn)等，體外診斷技術(shù)主要是指以特異性ige(sige)為檢測對象的immunocap。體內(nèi)診斷的優(yōu)點(diǎn)是簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是由于患者與潛在過敏原直接接觸，可能導(dǎo)致局部或者全身不良反應(yīng)，體外診斷方法的優(yōu)點(diǎn)是安全、準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是耗時、檢測費(fèi)用高。此外，現(xiàn)有的診斷方法以血液樣本為基礎(chǔ)，作為與血液存在物質(zhì)交換的間質(zhì)液(血液中的每一種分析物都可以被認(rèn)為存在于間質(zhì)液中)，尚未得到完全開發(fā)。微針具有微創(chuàng)、無痛的特點(diǎn)，能夠解決部分患者排斥血液采集的問題，并且能夠透過表皮層，接觸皮下間質(zhì)液，這使得采集間質(zhì)液中的特異性過敏標(biāo)志物成為可能。目前公布的基于微針的食物過敏診斷專利(cn202110457854、cn201780049577)均是以皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，即通過對人皮膚施加過敏原，引起過敏患者產(chǎn)生過敏癥狀。為了解決部分患者排斥血液采集的問題，填補(bǔ)間質(zhì)液過敏標(biāo)志物檢測的空白，有必要開發(fā)一種基于微針的多元食物過敏新型診斷方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片的制備方法。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供所述方法制備得到的用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片。

3、本發(fā)明的再一目的在于提供所述用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、一種用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片的制備方法，包括如下步驟：

6、(1)將聚二甲基硅氧烷(pdms)溶液澆入模具，放置除氣泡，常溫干燥后脫模，得到微針吸附背板；

7、(2)將聚苯乙烯和納米銀顆粒加入到二氯甲烷中，配制成含質(zhì)量濃度15～20％聚苯乙烯和1～8mg/ml納米銀顆粒的二氯甲烷溶液，作為微針原料；

8、(3)向微針模具中注入步驟(2)中得到的微針原料，抽真空，然后放氣，取出模具刮去溢出模具凹槽的原料；繼續(xù)向微針模具中注入步驟(2)中得到的微針原料，常溫干燥，重復(fù)6～7次；最后常溫放置后脫模，得到微針；

9、(4)將步驟(3)中得到的微針放入等離子體處理腔體中處理30s～3min后，取出，然后將微針的針尖沒入濃度為質(zhì)量百分比0.015％～0.025％的l-多聚賴氨酸溶液中，再放入等離子體處理腔體處理10～15min(優(yōu)選為10min)，得到修飾微針；其中，等離子體處理的條件均為：電壓40～60kv、電流100～150ma、極板距離2.4～3cm；

10、(5)將步驟(3)中得到的微針或步驟(4)中得到的修飾微針嵌入到步驟(1)中得到的微針吸附背板的凹槽中，得到所述用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片。

11、步驟(1)中所述的聚二甲基硅氧烷(pdms)溶液通過如下步驟配制得到：將道康寧dc184聚二甲基硅氧烷中的硅聚合體(a組分)與固化劑(b組分)按質(zhì)量比8～10:1混合，即得。

12、步驟(1)中所述的除氣泡的條件為：在0.1mpa真空度下放置30～60min(去除氣泡)；優(yōu)選為：在0.1mpa真空度下放置30min(去除氣泡)。

13、步驟(1)中所述的常溫干燥的時間為18～24h；優(yōu)選為24h。

14、步驟(1)中所述的微針吸附背板的大小形狀可根據(jù)微針大小形狀進(jìn)行設(shè)置，主體為柔性pdms材料，上有凹槽，能嵌入微針基底層；所述的微針吸附背板優(yōu)選為立方體，尺寸為：長35mm，寬35mm，高3mm；背板內(nèi)設(shè)四個立方體凹槽，每個凹槽尺寸為：長10mm，寬10mm，高1.5mm，每個凹槽邊與相鄰邊的邊距均為4.9mm。

15、步驟(2)中所述的微針原料中聚苯乙烯的濃度優(yōu)選為質(zhì)量百分比15％，納米銀顆粒的濃度優(yōu)選為8mg/ml。

16、步驟(3)中，第一次注入的原料占模具總體積100％，之后注入的原料占模具總體積50％；如針對上述規(guī)格的模具，第一次注入的200μl微針原料，之后每次注入100μl微針原料。

17、步驟(3)中所述的微針模具的大小形狀可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置；所述的微針模具優(yōu)選為基底層為立方體、針尖為圓柱體的模具，其基底層的尺寸為：長10mm，寬10mm，高1.5mm；針尖的尺寸為：針長0.8～1mm，針尖直徑0.01～0.02mm，底面直徑0.25～0.35mm，針尖距離0.5～0.7mm，陣列數(shù)量(9*9)～(11*11)；基底層的尺寸優(yōu)選為：長10mm，寬10mm，高1.5mm；針尖的尺寸優(yōu)選為：針長0.8mm，針尖直徑0.015mm，底面直徑0.3mm，針尖距離0.6mm，陣列數(shù)量11*11。

18、步驟(3)中所述的抽真空的條件為：抽真空至0.1mpa，持續(xù)30～60s；優(yōu)選為：抽真空至0.1mpa，持續(xù)30s。

19、步驟(3)中所述的常溫干燥的時間為40～60min；優(yōu)選為40min。

20、步驟(3)中所述的常溫放置的時間8～12h；優(yōu)選為8h。

21、步驟(4)中所述的l-多聚賴氨酸的分子質(zhì)量為150～300kda；優(yōu)選為200kda。

22、步驟(4)中所述的l-多聚賴氨酸的濃度優(yōu)選為質(zhì)量百分比0.02％。

23、步驟(4)中所述的等離子體處理可采用本領(lǐng)域常規(guī)的等離子放電實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行，如大氣低溫等離子放電實(shí)驗(yàn)裝置(南京蘇曼等離子科技有限公司，型號dbd-50)等。

24、步驟(4)中所述的等離子體處理的條件優(yōu)選為：電壓50kv、電流100ma、極板距離2.4cm。

25、一種用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片，通過上述任一項所述的方法制備得到。

26、所述的用于多元食物過敏定量檢測的微針貼片在制備診斷食物過敏的試劑盒中的應(yīng)用。

27、所述的食物包括含有麩質(zhì)的谷物及其制品、甲殼綱類動物及其制品、魚類及其制品、蛋類及其制品、花生及其制品、大豆及其制品、乳及乳制品(牛奶)、堅果及其果仁類制品中的至少一種；優(yōu)選為蝦。

28、一種非疾病診斷和治療目的的定量檢測sige或總ige含量的方法，包括如下步驟：

29、s1、配制標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品加入到質(zhì)量百分比1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中，配制至少5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放入4℃冰箱，待其凝固，得到含有標(biāo)準(zhǔn)品的瓊脂糖凝膠；其中，標(biāo)準(zhǔn)品為sige標(biāo)準(zhǔn)品或ige標(biāo)準(zhǔn)品；

30、s2、配制生物素化人工過敏原溶液：將活化生物素溶液和血藍(lán)蛋白溶液混合后攪拌反應(yīng)，經(jīng)透析得到生物素化血藍(lán)蛋白；然后將生物素化血藍(lán)蛋白溶解在等離子體活性水中，得到蛋白溶液；將食物過敏原表位肽(過敏原、抗原)溶解在等離子體活性水中，得到多肽溶液；再將蛋白溶液和多肽溶液混合均勻，得到蛋白/多肽混合液；將碳二亞胺(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)溶解在等離子體活性水中，得到edc-nhs溶液；在磁力攪拌條件下，向蛋白/多肽混合液中緩慢滴加edc-nhs溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后透析，得到生物素化人工過敏原溶液；

31、s3、包被、封閉、特異性標(biāo)志物提?。簩⑸鲜鲇糜诙嘣澄镞^敏定量檢測的微針貼片中的微針取出，放入到兔抗人ige溶液中包被，洗滌；接著放入牛血清白蛋白(bsa)溶液中封閉，洗滌，自然風(fēng)干；然后將風(fēng)干后的微針嵌入微針吸附背板的凹槽，組成完整的微針貼片，并分別刺入步驟s1中得到的含有標(biāo)準(zhǔn)品的瓊脂糖凝膠中提取過敏標(biāo)志物，提取完成后將微針拔出，并將微針從吸附背板凹槽中分離出來，洗滌；

32、s4、孵育：將步驟s3中洗滌后的微針放入步驟s2中得到的生物素化人工過敏原溶液或生物素化小鼠抗人ige抗體中孵育，孵育后洗滌；隨后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素溶液中孵育，孵育后洗滌；

33、s5、顯色：將步驟s4中洗滌后的微針放入tmb單組分顯色液中，待顯色完成后，取出微針，加入終止液，在450nm波長下讀數(shù)，分別測得標(biāo)準(zhǔn)品各個濃度對應(yīng)的吸光值；

34、s6、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)步驟s5中測得的標(biāo)準(zhǔn)品各個濃度對應(yīng)的吸光值和濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

35、s7、定量檢測：將含有標(biāo)準(zhǔn)品的瓊脂糖凝膠(步驟s3)替換為待測對象的皮膚，重復(fù)步驟s2～s5，獲得待測對象對應(yīng)的吸光值(生物信號轉(zhuǎn)換為比色信號)，再根據(jù)步驟s6中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到sige的濃度或含量，或總ige的濃度或含量。

36、步驟s1中所述的sige標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為0.1～1000ng/ml。

37、步驟s1中所述的ige標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為0.1～5000ng/ml。

38、步驟s2中所述的活化生物素為磺基琥珀生物素sulfo-nhs-biotin。

39、步驟s2中所述的活化生物素溶液為采用10mm?pbs緩沖液配制的溶液，其濃度為15～25mmol/l；優(yōu)選為20mmol/l。

40、步驟s2中所述的血藍(lán)蛋白溶液為采用10mm?pbs緩沖液配制的溶液，其濃度為0.8～1.2mg/ml；優(yōu)選為1mg/ml。

41、步驟s2中所述的活化生物素溶液和血藍(lán)蛋白溶液的體積比為1：(90～110)；優(yōu)選為1:100。

42、步驟s2中所述的透析均為采用截留分子量14kda的透析袋進(jìn)行透析；優(yōu)選為采用截留分子量14kda的透析袋透析48h以上。

43、步驟s2中所述的透析所用的透析液均為pbs緩沖液。

44、步驟s2中所述的攪拌反應(yīng)的時間為30min～60min；優(yōu)選為30min。

45、步驟s2中所述的等離子體活性水的制備工藝如下：將ph?6.7的mes緩沖液放入等離子體處理腔體，在電壓50v，電流1ma，極板間距13mm條件下處理1min。

46、步驟s2中所述的蛋白溶液的濃度8～12mg/ml；優(yōu)選為10mg/ml。

47、步驟s2中所述的多肽溶液的濃度為3～5mg/ml；優(yōu)選為4mg/ml。

48、步驟s2中所述的蛋白溶液中的蛋白和多肽溶液中的多肽的摩爾比為1:(8～10)；優(yōu)選為1:10。

49、步驟s2中所述的碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的摩爾比為1:1。

50、步驟s2中所述的edc-nhs溶液的濃度為40～50mmol/l；優(yōu)選為50mmol/l。

51、步驟s2中所述的edc-nhs溶液的用量為按其在反應(yīng)體系的終濃度為2～2.5mol/l添加計算；優(yōu)選為按其在反應(yīng)體系的終濃度為2mol/l添加計算。

52、步驟s2中所述的反應(yīng)的時間為1～1.5h；優(yōu)選為1h。

53、步驟s2中所述的食物過敏原表位肽的序列為如下至少一種：gsvtcpqqv(谷物)，easqaadesermrk(甲殼類)，yrgvtlaghr(魚)，veqgasvdkr(蛋)，fyfpsrrfs(花生)，seqdifvipagypv(大豆)，vvppflqpev(牛奶)，cqrqeqgqrqqqq(堅果)。

54、步驟s2中所述的生物素化人工過敏原溶液的濃度為1～2μg/ml；優(yōu)選為1.5μg/ml。

55、步驟s3中所述的兔抗人ige溶液為采用50mm?cbs溶液配制的溶液，其濃度優(yōu)選為10μg/ml。

56、步驟s3和s4述的洗滌均采用體積百分?jǐn)?shù)為0.05％的pbst溶液洗滌5次，每次3min。

57、步驟s3中所述的包被的時間為8～12h；優(yōu)選為8h。

58、步驟s3中所述的牛血清白蛋白(bsa)溶液為采用10mm?pbs緩沖液配制的溶液，其濃度優(yōu)選為質(zhì)量百分比1％。

59、步驟s3中所述的封閉的條件優(yōu)選為：37℃封閉4h。

60、步驟s3所述的提取過敏標(biāo)志物的時間為5～10min；優(yōu)選為10min。

61、步驟s4中所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素溶液的濃度為0.3～0.5μg/ml；優(yōu)選為0.4μg/ml。

62、步驟s4中所述的孵育的時間為1.5～2h；優(yōu)選為1.5h。

63、步驟s5中所述的顯色時間為5～10min；優(yōu)選為10min。

64、步驟s5中所述的終止液為2mol/l的硫酸溶液。

65、步驟s7中所述的待測對象包括人或動物，如過敏患者等。

66、本發(fā)明中的檢測診斷原理如下：

67、(1)捕捉抗體包被：將抗人ige抗體(捕捉抗體)包被在微針表面；

68、(2)特異性標(biāo)志物提取：將微針貼片貼于皮膚表面，當(dāng)微針刺入皮膚后，間質(zhì)液中的ige會與包被在微針表面的兔抗人ige抗體結(jié)合，被一同固定在微針表面；

69、(3)生物信號轉(zhuǎn)化：將含有一定濃度檢測生物素化人工過敏原或生物素化小鼠抗人ige抗體與微針一同孵育，使得生物素化人工過敏原或生物素化小鼠抗人ige抗體與吸附在微針表面的sige或總ige結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素和催化底物，將生物信號轉(zhuǎn)換為比色信號；

70、(4)定量檢測：配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測得的待測樣本吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算sige或總ige含量。

71、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

72、(1)本發(fā)明中提供了一種微針貼片，可用于多元食物過敏定量檢測，通過將微針原位檢測技術(shù)用于檢測過敏標(biāo)志物ige，拓寬了診斷標(biāo)志物來源(間質(zhì)液)，解決了部分患者排斥血液采集的問題。

73、(2)本發(fā)明還提供一種基于微針的多元食物過敏檢測方法，通過定量檢測sige以及總ige含量，判斷食物過敏風(fēng)險，主要步驟如下：生物素化人工抗原的制備；包被；封閉；特異性標(biāo)志物提??；孵育；顯色；標(biāo)曲繪制；定量檢測。本發(fā)明可以利用皮膚間質(zhì)液，實(shí)現(xiàn)對不同食物過敏標(biāo)志物(sige、總ige)的多元、定量檢測，應(yīng)用前景廣泛。

74、(3)本發(fā)明方法可以同時多次采樣，并通過使用針對不同食物過敏種類的生物素化人工過敏原以及抗人ige抗體，實(shí)現(xiàn)多元檢測和診斷。

75、(4)本發(fā)明微針材料具有抗菌的特點(diǎn)，降低了生物體采樣的感染風(fēng)險。

76、(5)本發(fā)明通過等離子體技術(shù)和涂層技術(shù)提高了微針表面蛋白的吸附效率和穩(wěn)定性。

77、(6)本發(fā)明以等離子體活性水作為edc-nhs偶聯(lián)的緩沖體系，為活化提供了豐富的電子轉(zhuǎn)移路徑，提高了活化效率。