專利名稱：培養(yǎng)皮膚組織相同物的冷藏和貯存的方法和包裝設(shè)計的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請是1996年1月30日提交的中國專利申請96191673.7(發(fā)明名稱培養(yǎng)組織相同物的冷藏和貯存的方法和包裝設(shè)計)的分案申請。
本發(fā)明涉及獲取的組織及用體外技術(shù)得到的培養(yǎng)組織相同物的冷凍保藏。本發(fā)明還涉及獲取的組織和培養(yǎng)組織相同物的冷藏包裝設(shè)計，該設(shè)計成本低，易于處理，并使冷藏的組織或組織相同物具有最大的成活力，利用該冷藏技術(shù)，無論是冷藏的獲取組織或冷藏的培養(yǎng)組織，在使用前可無限期的貯存，培養(yǎng)組織是相同的人類組織的體外標(biāo)本，當(dāng)從貯存處取回后，可用于體內(nèi)移植或植入，或用于體外篩選化合物。
背景技術(shù)：
體外技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了組織相同物(tissue equivalents)，用于體外檢測或體內(nèi)移植修復(fù)傷口。制備此類組織相同物的方法見US專利號4,485,096，4,604,346，4,835,102和5,374,515，和US專利申請序號08/193,809和08/337,830；所有的這些文獻(xiàn)都列入本文作為參考文獻(xiàn)。
活組織的貯存期是有限的，其次，其使用期也很短，因而造成極大的浪費。當(dāng)運輸和貯存，需將這些組織保存更長的時間，直至使用。用于冷藏和貯存的冷藏方法和包裝技術(shù)的發(fā)展，將無限期地延長組織的使用壽命，使運輸變得容易，并允許長時間庫存。使組織能在燒傷康復(fù)中心和醫(yī)院庫存，也是希望的，其它的優(yōu)點是從處于生產(chǎn)周期的不同階段保留樣品用于質(zhì)量控制歸檔，和當(dāng)樣品維持在冷凍狀態(tài)時，可進(jìn)行大批量生產(chǎn)。
通常，冷卻到“深冷”溫度，可延長細(xì)胞生物材料的貯存期。當(dāng)結(jié)晶(冰)時，涉及水分子的有序排列，或當(dāng)玻璃化或非晶化(形成玻璃態(tài))時，即不存在結(jié)晶相的有序排列，可通過降低系統(tǒng)的溫度，使其從液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?。低溫生物學(xué)家面臨的挑戰(zhàn)是將細(xì)胞帶到深冷溫度，再將其帶回到生理條件下而不損傷它們。
有兩種基本的方法用于冷藏細(xì)胞和組織凍—融法和玻璃化法。運用凍融技術(shù)時，胞外溶液被冷凍(即結(jié)晶形式)，但采用步驟最大限度地減少胞內(nèi)冰的形成。在玻璃化步驟中，則試圖阻止整個樣品形成冰。前一種方法存在些問題，如果冰晶在細(xì)胞內(nèi)形成，則融化時，對細(xì)胞的成活力是不利的。然而，如果在無毒量的冷藏液存在下，以控制的速度冷卻，經(jīng)過一個凍融周期，細(xì)胞是能存活的。后一種玻璃化法通過采用高濃度的溶質(zhì)和/或聚合物來抑制冰的形成，從而避免胞內(nèi)和胞外冰的潛在危害。然而，細(xì)胞長期暴露于玻璃化法所需這些添加劑的有毒環(huán)境中，必會受到損傷。
冷藏液保護(hù)活細(xì)胞免受在冷凍過程中的損害，冷藏液保護(hù)細(xì)胞的一條途徑是稀釋鹽濃度，因為隨著水變成冰，在未結(jié)冰的溶液中，鹽濃度急劇增加。冰的數(shù)量由溫度和溶液起始組成來決定；而未結(jié)冰部分的數(shù)量僅是溫度的函數(shù)，冷藏液還具有幾種其它功能。一種重要的功能是它們通常能降低胞內(nèi)冰形成的溫度，另一種功能是它們能穩(wěn)定膜和蛋白質(zhì)。
所有的溶液都過冷到冰點之下，直至發(fā)現(xiàn)一隨機(jī)的結(jié)晶形成的成核點。當(dāng)用凍融法冷藏時，在低程度過冷下，引入晶種，可審慎地引發(fā)胞外基質(zhì)中冰的形成。如果不用引入晶種誘導(dǎo)冰的形成，則當(dāng)溶液冷至遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其平衡冰點時，冰將自發(fā)形成。由于此過程的隨機(jī)性，因而冰的形成也將是隨機(jī)的，不可預(yù)測溫度；繼之，在采用相同冷凍法的重復(fù)實驗之間，其成活率是大不相同的。進(jìn)一步，極其快速的結(jié)晶會導(dǎo)致如下結(jié)果當(dāng)冰在高度低冷的溶液中形成，會損傷細(xì)胞和組織。更進(jìn)一步表明，如果胞外冰的形成是在高度過冷時引發(fā)的，則胞內(nèi)冰的形成的可能性將急劇增加。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是因為延遲了冷凍誘導(dǎo)細(xì)胞脫水的開始，將導(dǎo)致保留的胞內(nèi)水增加，細(xì)胞中冰形成的可能性增加。
一旦胞外冰被引入晶種，樣品便由冰相包圍。必需將樣品冷卻到冷藏狀態(tài)。在凍融技術(shù)中，冷卻是最重要的步驟之一。由于冰的形成，即純水。部分冷凍的胞外溶液其濃度較胞內(nèi)間隔中的更大。結(jié)果，在試圖恢復(fù)熱力學(xué)平衡時，通過失去水分使細(xì)胞脫水。隨著系統(tǒng)的冷卻，產(chǎn)生更多的胞外冰，溶質(zhì)的濃度上升，迫使細(xì)胞進(jìn)一步脫水，細(xì)胞的三種特性控制其脫水速率。一是細(xì)胞膜的透水性；其透水性越差，細(xì)胞脫水所需的時間越長。另一種是細(xì)胞膜透水性的溫度依賴性；所有的細(xì)胞隨著溫度的降低其透水性降低。最后一種是細(xì)胞的大??；大細(xì)胞較小細(xì)胞需更長的時間脫水。已知每一種細(xì)胞類型可能具有完全不同的特性，因此最適冷藏條件依不同細(xì)胞類型的大小順序而多化。
雖然在冷藏中細(xì)胞損傷的準(zhǔn)確機(jī)理還不完全清楚，但是通過測定細(xì)胞成活產(chǎn)生的，作為冷卻速度函數(shù)的特征成活符號似乎對所有的細(xì)胞類型在性質(zhì)上都是相似的，并顯示出逆轉(zhuǎn)的U型曲線。在很慢和很快的冷卻速度下，細(xì)胞成活都很低；存在一中間冷卻速度，產(chǎn)生最佳的成活力，雖然對于不同的細(xì)胞類型，最適冷卻速度和曲線的寬度會發(fā)生劇烈變化，但其定性特征似乎是通用的?？焖倮鋮s，使細(xì)胞不具備足夠的時間脫水，于是細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰。快速冷卻時細(xì)胞受損，應(yīng)歸于胞內(nèi)冰的形成。在慢速冷卻時細(xì)胞受損，被認(rèn)為是由于將其暴露到高濃度的胞內(nèi)和胞外鹽及冷藏液中，或由于細(xì)胞和胞外冰間的相互機(jī)械作用造成的。
在跨越胞內(nèi)冰的成核曲線前，必需盡可能地使細(xì)胞脫水。實際上正是在此處，細(xì)胞內(nèi)殘留的所有水分將成核，結(jié)冰。要確定此處的準(zhǔn)確溫度是不實際的，但是，在1M到2M濃度的冷藏液存在下，當(dāng)細(xì)胞慢慢冷凍時，它大約是-40℃到-50℃。在冷凍時，在此處細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成冰的水的數(shù)量是無害的，但是，在融化時，如果沒有融化得足夠快，它將膨脹，并殺死細(xì)胞，注意這點是很重要的。(器官冷藏的生物物理，Pg117-140，edited by David E.Pegg和Armand M.Karow，Jr.NATOASI Series A生命科學(xué)Vol.147 1987 Plenum Press，New York 233 SpringSt.，New York，NY 10013)。
在產(chǎn)業(yè)上活皮膚相同物開發(fā)之前，是用尸體的皮膚來進(jìn)行皮膚移植。冷藏方法的發(fā)展使得燒傷中心和醫(yī)院能擁有皮膚庫。大量不同的冷藏方法發(fā)展起來，它們利用不同的冷藏液，不同的冷凍速度、包裝格式和貯存條件。大多數(shù)研究者贊同快速融化法，這種方法的成敗通過對損傷處的移植或檢測細(xì)胞成活力來衡量。
在美國專利3,842,831中，Beisang發(fā)表了冷藏尸體皮膚塊的方法。該方法包括將尸體皮膚附著到一稀松編織的麻布或支持物上，在冷凍前，將皮膚塊和麻布卷在一起。沒有加入冷藏液，雖然發(fā)明者建議可用甘油或DMSO。該冷凍法采用快速非控制(固定溫度)冷凍速度直到-70℃低溫。
May SR和FA DeClement(皮膚庫方法學(xué)，17，33-45(1980))評價了利用生皮節(jié)尸體皮膚的包裝幾何學(xué)和冷卻與加溫速度，結(jié)果表明尸體皮膚最好是平坦，而不是卷起來的，應(yīng)采用慢些的控制的冷凍速度。
在美國專利5,040,677中，Tubo發(fā)表了一個不漏氣的可密封的容器，可用于上皮細(xì)胞層的單獨移植。該容器要求用夾子將上皮細(xì)胞層連到一片狀粘性物質(zhì)或支持物上。
在美國專利5,145,770中，Tubo發(fā)表了一種冷藏角質(zhì)化細(xì)胞層的方法，該方法采用一種非細(xì)胞滲透液如葡聚糖和一種細(xì)胞滲透液如甘油做冷藏液，冷凍速度約為-1℃/分鐘。與此類似，Chao等在EP 0364306中發(fā)表了一種冷藏活的培養(yǎng)上皮細(xì)胞層的方法，但利用了DMSO和甘油作為冷藏液，選擇的冷凍方法是-1℃/分鐘。
在美國專利5,298,417中，Cancedda等發(fā)表了一種冷藏單層構(gòu)建物如上皮層的方法，其制備法見美國專利4,016,036，4,304,866和4,456,687。將上皮層同冷藏液，或是8-15％的甘油，或是DMSO，一起保溫，用控制速度法進(jìn)行冷藏，在此，冷凍速度在開始時慢于結(jié)束時，其特征是在冷凍步驟完成之前有一溫度的增加。
Teasdale等研究了在膠原凝膠上冷藏真皮成纖維細(xì)胞的方法，燒傷，19(5)406-410(1993)。Teasdale確定，用DMSO作為冷藏液，以--0.5℃/分鐘速度進(jìn)行冷凍，可獲得最佳細(xì)胞成活力。
Nanchahal等，“培養(yǎng)的合成皮膚移植物生物皮膚相同物允許大規(guī)模的發(fā)展，”The Lancet，2(8565)，191-193(July 22，1989)，討論了一種用于貯存合成培養(yǎng)組織移植物的技術(shù)，該技術(shù)利用在培養(yǎng)基199中的15％甘油和10％FCS作為冷藏液。將移植物和冷藏液在37℃保溫2小時，再以-1℃/分鐘的速度冷凍至-70℃，然后貯存在液氮中。當(dāng)將移植物快速融化后，通過培養(yǎng)2周和將其移植到無毛小鼠中來測定其成活力。最后，將其移植到三個切除紋身的病人身上，再做最后估價。
Johnstone等，“在-18到-24℃冷藏兔子和貓的角膜”，角膜，11(3)211-220(1992)，提出了一個冷藏兔子和貓角膜的簡單方法，該方法利用家用冷柜而不是在液氮中或低溫冷柜中保藏。將角膜逐次放入具有遞增的甘油和葡萄糖含量的一系列50％胎牛血清和McCarey-Kaufman培養(yǎng)基中，可使冷藏流充滿樣品。
用前述現(xiàn)有技術(shù)的方法不可能冷藏培養(yǎng)組織相同物，部分原因是這些相同物相對厚些，并且有異質(zhì)細(xì)胞層。這些組織在體內(nèi)的功能之一是提供一個滲透屏障。在發(fā)展冷藏方法時，必需考慮組織的功能。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種冷藏方法，特別是一種包裝設(shè)計，適用于大量的培養(yǎng)組織相同物和哺乳動物皮膚。對于冷藏培養(yǎng)組織相同物，這種包裝是令人驚異的有效和在產(chǎn)業(yè)上實用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在非常低的溫度下成功冷藏培養(yǎng)組織相同物的方法，避免了有害的胞內(nèi)冰晶的形成，最大限度地減少潛在有害化學(xué)物的有效濃度，并且利用可編程的冷凍儀器，在適宜的溫度下允許冷藏液的迅速導(dǎo)入和除去。
本發(fā)明還提供了一種新的包裝設(shè)計，用于培養(yǎng)組織相同物的冷藏、貯存和分配。與現(xiàn)有的包裝設(shè)計相比，新的包裝設(shè)計具有許多優(yōu)點。現(xiàn)在，通過商業(yè)渠道買不到冷藏的培養(yǎng)組織相同物，因此，也得不到現(xiàn)貨供應(yīng)的包裝設(shè)計，由于具有更有效的熱傳遞，新的包裝設(shè)計使包裝內(nèi)部的溫度能更好地跟蹤外部的冷室溫度，一種改進(jìn)的熱傳遞速度可以供一個更能控制的過程之用；因此，有了培養(yǎng)組織相同物均勻的冷凍和加熱速度，減少了細(xì)胞成活力的可變性。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種冷藏由體外技術(shù)制備的培養(yǎng)組織相同物的方法，因而這些組織作為人類組織的相同物能維持其成活力和利用性。本發(fā)明包括利用攪拌增進(jìn)有效數(shù)量冷藏液的滲透。本發(fā)明方法以保護(hù)結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞成活力的方式對獲得的組織和培養(yǎng)的組織相同物提供冷藏。
本發(fā)明的方法包括下列步驟1)將獲得的組織或培養(yǎng)組織相同物浸入冷藏液中，攪拌，使冷藏液有效地浸透組織(充滿組織)；和2)在冷藏液浸透組織后，將其冷卻到冷藏液的固-液相平衡溫度；引入胞外冰晶種，然后以緩慢的速度將組織冷凍到至少等于或低于-70℃，更好是等于或低于-120℃，再如是-140℃，最好是-196℃，使之達(dá)到冷藏狀態(tài)。
一旦冷凍了，冷藏組織便可在約-120℃到約-196℃，液氮的溫度，這樣的溫度之間，被無限期的貯存。
快速加熱冷凍的組織，通常在1到2分鐘內(nèi)，可融化冷藏的組織，通過直接施加加熱的培養(yǎng)基或加入生理緩沖液或采用其它快速加熱法，可將冷凍的組織融化，由于在其關(guān)鍵的融化過程中保持無菌的同時，該包裝設(shè)計確保了一個極快的加熱速度和控制的熱均勻性，因而可將包裝設(shè)計浸入水浴中而使組織融化。
在作為人類組織相同物用于移植或體外檢測前，將融化的培養(yǎng)組織相同物進(jìn)行清洗，以除去冷藏液。例如，用生理pH下的等滲緩沖液可清洗除去冷藏液。在使用前，培養(yǎng)組織相同物可暫時貯存在這種緩沖液中或在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。


圖1A和1B為蓋子的圖示。
圖2為密封墊的俯視圖。
圖3A和3B示出安裝到蓋子上的密封墊的視圖。
圖4A和4B示出載體的視圖。
圖5A和5B示出盤子的視圖。
圖6A和6B為組裝物的側(cè)視圖，部件分解圖和完成裝配圖。
圖7為組裝物的細(xì)部圖。
圖8為組裝物完成裝配的俯視圖。
圖9為冷藏培養(yǎng)組織與非冷藏培養(yǎng)組織的成活力的比較圖表，圖表中列出了由MTT測定的冷藏培養(yǎng)組織的成活力。LSE是附加地再由LDH法測定。所有的培養(yǎng)組織同年齡相當(dāng)?shù)姆抢洳貙φ者M(jìn)行比較，結(jié)果以對照的百分比來表示。
具體實施方案組織工程(tissue engineering)是一個新興領(lǐng)域，它利用培養(yǎng)的組織細(xì)胞構(gòu)建組織相同物，這些組織相同物可用于檢查對化學(xué)試劑或藥物損傷的反應(yīng)，也可用于構(gòu)成移植的人類組織。
組織相同物已在許多專利中廣泛詳盡地加以描述，包括美國專利號，4,485,906；4,485,097；4,539,716；4,546,500；4,604,346；4,837,379；和5,374,515，所有的這些專利都引入本文作為參考文獻(xiàn)，組織相同物的一個成功的應(yīng)用是“活皮膚相同物”，它與真正的人類皮膚在形態(tài)學(xué)上相似?；钇つw相同物(LSE)由兩層組成上層由分化和分層的人類表皮角質(zhì)化細(xì)胞構(gòu)成，它復(fù)蓋在由位于膠原基質(zhì)中的人類真皮成纖維細(xì)胞構(gòu)成的下層上面。Parenteau，等“體外形成表皮實際考慮和應(yīng)用，”J·of Cellular Biochemistry，45245-251(1991)；Parenteau，等，“人類皮膚角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的器官型培養(yǎng)以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能”，Cytotechnology，9163-171(1992)；和Bell等“活皮膚相同物制造，器官性質(zhì)和對刺激的反應(yīng)，”Toxic.in Vitro，5591-596(1991)。用于移植的LSE正在進(jìn)行臨床試驗，以指出與部分和全厚度皮膚損傷的關(guān)系，這些損傷包括切除手術(shù)，燒傷，靜脈停滯潰瘍，糖尿病潰瘍，褥瘡潰瘍，和慢性炎癥潰瘍。LSE是全厚度，雙層的體外工程皮膚組織。
眼角膜體外器官相同物也已被開發(fā)出來，見美國專利號5,374,515，并入本文作為參考文獻(xiàn)。角膜組織相同物有三層性質(zhì)截然不同的細(xì)胞層，最外層為分層的鱗狀上皮，中層為膠原纖維和基質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)層為簡單的鱗狀上皮，也叫角膜內(nèi)皮。在體外毒性實驗中，可使用體外角膜相同物充當(dāng)體內(nèi)的對于不同類型的產(chǎn)物和粗物質(zhì)產(chǎn)生的眼和真皮刺激電位的精確便宜的非動物預(yù)測標(biāo)本。
冷藏的目的在于能無限期的保存生物材料的結(jié)構(gòu)完整性和成活力，使得在需要時能隨時得到，加以運用。具有限生命周期的復(fù)雜組織需要冷藏來擴(kuò)展其適應(yīng)性和利用率。然而，生物材料冷藏的歷史表明，適合于某種特定細(xì)胞的冷藏方法，當(dāng)用于另一類細(xì)胞或同一組織的其它細(xì)胞時，并不一定給出好的結(jié)果。由于細(xì)胞密度不同，含水量不同，全厚度組織相同物的結(jié)構(gòu)組成水平不同，因而需要發(fā)展專一性更強(qiáng)的方法。本發(fā)明的冷藏方法令人驚異地適用于單層的表皮層和單層的真皮層，雙層的組織相同物，三層的角膜相同物，和獲取的哺乳動物皮膚。包裝設(shè)計的發(fā)展使得這些組織的冷藏適應(yīng)于大規(guī)模生產(chǎn)。
在此所用的術(shù)語“培養(yǎng)的組織相同物(cultured tissueequivalents)”意思為哺乳動物組織的組織相同物，這里的相同物由體外技術(shù)制備，包括單層皮膚相同物，或是真皮相同物，或是表皮相同物；雙層皮膚相同物，特別是LSE；三層角膜相同物和皮膚相同物。培養(yǎng)的組織相同物在形態(tài)學(xué)上與體內(nèi)的哺乳動物器官，特別是人類器官相似。進(jìn)一步闡明LSE在形態(tài)學(xué)上與人類皮膚的許多相似之處。具有代謝活性和有絲分裂活性的人類真皮成纖維細(xì)胞(HDF)遍布構(gòu)建物的真皮層，并分泌膠原和其它基質(zhì)成分到網(wǎng)格中去。表皮層由一基層組成，與人類皮膚相似，該基層由有絲分裂速率來劃分?；鶎由系谋砥优c體內(nèi)的皮膚有相同的層次，即具有嚴(yán)格定義的含有角質(zhì)透明蛋白和板狀顆粒的多刺的顆粒狀層次，其上復(fù)蓋一層角質(zhì)層。免疫組織化學(xué)證明；在正常人類皮膚的真皮—表皮連接處，如laminin，膠原，IV型和kalanin(GB3)，常能發(fā)現(xiàn)胞外基質(zhì)成分的存在。
培養(yǎng)的組織相同物通過器官型培養(yǎng)法得到，例如活皮膚相同物(LSE)，利用一個載體做骨架，在其上形成相同物。培養(yǎng)的組織相同物在一載體上制造，該載體允許在生產(chǎn)、船運和最終運用過程中，不必直接接觸構(gòu)建物，便可對構(gòu)建物進(jìn)行操作，在載體上制備培養(yǎng)的組織相同物的方法見美國專利號5,374,151和美國專利申請序號08/193,809和08/337,830。
載體包括一扁平的透性膜，該膜附在一基本為管狀支持物的一端。管狀支持物的另一端包括一向外伸出的法蘭，它能依次運載懸掛在本發(fā)明的包裝設(shè)計和組織培養(yǎng)皿中的小孔上端的邊緣。膜-支持物組裝物的大小應(yīng)設(shè)計得適合于具有至少一個特定大小的小孔的培養(yǎng)皿，以便提供恰當(dāng)?shù)目障督o支持物以銜接小室的上端?？梢越M裝不同大小的膜—支持物組裝物，以適用于不同大小的培養(yǎng)皿和冷藏包裝。這些載體的例子是TRANSWELL(Costar)，詳見美國專利號5,466,602。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對包裝設(shè)計進(jìn)行修改以適應(yīng)那些用于不同支持物和銜接在培養(yǎng)器皿中的類似載體。有關(guān)類似載體的敘述見美國專利號5,358,871和5,366,893或見美國專利號4,871,674。
本發(fā)明優(yōu)選的包裝設(shè)計結(jié)合了載體骨架，限定了組織相同物周圍的環(huán)境，使能被控制適合于預(yù)定的專一性。本發(fā)明所用的材料最好是醫(yī)用級的，能耐受很廣的溫度范圍。這些材料被鑄造成一個盤子和一個蓋子，用密封手段可將二考密封起來，設(shè)計的新包裝結(jié)合有一載體支持物、組織相同物在其上形成。
新的包裝設(shè)計包括一個盤子，一個蓋子以及位于二者間的一個緊緊的密封墊。將盤子和蓋子設(shè)計得適合于現(xiàn)存的附有組織相同物的載體。將載體及附于其上的組織相同物放入盤中，加入冷藏液，蓋上蓋子，然后將兩部分密封，使得在包裝的內(nèi)外環(huán)境間形成緊密的密封。
當(dāng)保持冷藏液與組織相同物及盤子，蓋子接觸時，該包裝設(shè)計使得冷藏液在載體下面和在組織相同物表面的上面均勻分布。該包裝的設(shè)計基于如下概念控制的冷凍速率能用等體積的冷藏液維持，在被冷藏的培養(yǎng)組織的上下接相似的幾何學(xué)排列。無論從培養(yǎng)組織相同物的上表面或者下表面到包裝的外壁進(jìn)行測量，這種排列都提供均勻的距離(該包裝也具有均勻的厚度)。當(dāng)冷凍時，這種均勻性將提供從組織相同物到冷凍室的均勻的熱交換；當(dāng)融化時，則提供從外環(huán)境到組織相同物的均勻的熱交換。
盤子包括一與側(cè)壁和法蘭相連的底面。法蘭為盤子和蓋子的密封提供一個平面。盤子的側(cè)壁具有單個連續(xù)的或許多不連續(xù)的向內(nèi)伸出的支持物，并與側(cè)壁形成一整體。當(dāng)將包含有培養(yǎng)的組織相同物的載體放入盤中一定位置時，其上部邊沿被懸在由盤子側(cè)壁提供的支持物上。在懸掛的載體和盤子底面之間在一限定的空間，測定其厚度為1.0mm，面積大約相當(dāng)于組織相同物的大小。
蓋子包括一與側(cè)壁和法蘭相連的平底面。蓋子法蘭的直徑稍小于盤子法蘭的直徑。當(dāng)將蓋子法蘭放在含有載體的盤子上時，蓋子法蘭被擱在載體上，使得盤子法蘭和蓋子法蘭的頂部表面定向接觸在同一平面上。第二個空間被蓋子和培養(yǎng)的組織相同物的表面所限定，測量其厚度為1.0mm，面積大約相當(dāng)于組織相同物的大小。
該設(shè)計允許在盤子和其上放有組織相同物的載體的底部之間有約1mm的空間，在蓋子和組織相同物之間有約1mm的空間，組織相同物的上下遍布的冷藏液與蓋子和盤子均接觸。當(dāng)蓋子放入含有培養(yǎng)基的盤子中時，蓋子將包裝中的空氣置換到載體的管狀支持物的外周空間去。
蓋子沿著由盤子和蓋子法蘭的頂部表面產(chǎn)生的暴露平面與盤子密封。密封可通過加熱，粘合或已知的其它手段來完成。蓋子和盤子間的密封阻止了冷藏液的泄漏，保持了包裝單元內(nèi)部的無菌狀態(tài)。最好將熱密封蓋柄的環(huán)形片加熱密封到盤子法蘭和其上的蓋子法蘭上。蓋子柄最好具有一個拉手，以便將蓋子打開；當(dāng)開封時，將蓋子從盤子上移走，使能接觸到組織相同物。在另一實施方案中，將其法蘭直徑與盤子法蘭直徑相同的蓋子放入一其中含載體的盤子里，使得蓋子法蘭的底面緊密地與盤子法蘭的頂面接觸，然后，用密封手段將二者的法蘭密封起來。
圖1A和1B示出蓋子10；蓋子法蘭11；蓋子側(cè)壁12；和底面13。蓋子法蘭11，蓋子側(cè)壁12和底面13形成一個鄰接的表面。
圖2示出一環(huán)形的密封墊20和拉手21。
圖3A和3B示出密封墊20；蓋子10，蓋子法蘭11。密封墊20在使用前先安裝到蓋子10的法蘭11上，以有利于在密封過程中使密封墊更易于調(diào)整。
圖4A和4B示出載體30；載體邊緣31；透性膜32；和管狀支持物33。透性膜32包含一放在其上與管狀支持物33鄰接的培養(yǎng)組織相同物。在整個冷藏過程中，載體30使得組織相同物能夠轉(zhuǎn)移而不需接觸或移動組織相同物。
圖5A和5B示出盤子40；盤底面41；盤側(cè)壁42；盤法蘭43；和載體支持物44。盤底面41，盤側(cè)壁42，盤法蘭43，和載體支持物44構(gòu)成一個鄰接的表面，載體支持物44接觸和支持位于盤中的載體。
圖6A和6B示出密封墊20；蓋子10；載體30；和盤子40。將載有組織相同物的載體30放置在盤子40中，并懸在盤子內(nèi)。具密封墊20的蓋子10放置在載體30上，并懸在載體上。
圖7示出密封墊20；蓋子法蘭11；蓋子10；載體30，載體邊緣31；載體支持物44；和盤子40。將載有組織相同物的載體30放置在盤子40中，通過載體邊緣31的底面與載體支持物44的頂面相接觸，使載體懸在盤子內(nèi)。具密封墊20的蓋子10放置在載體30上，通過蓋子法蘭11的底面與載體邊緣31的頂面相接觸，使蓋子懸在載體上。蓋子法蘭11和盤子法蘭43的頂面形成一個平面用于密封20。
圖8為組裝物的俯視圖。
用于制造盤子，蓋子的材料應(yīng)是剛性的或半柔性的熱塑材料，當(dāng)加熱時，可通過真空或注塑法加以模塑成型，如聚四氟乙烯(PTFE)或聚對苯二甲酸乙二醇酯(PETG)，包裝盤子和蓋子在使用前最好用常規(guī)的滅菌法進(jìn)行滅菌處理。所采用的滅菌法將由制造盤子和蓋子的材料來決定。若要滅菌PTFE或PETG，最好采用2.5到3.0兆拉德的Gamma射線。實驗室中常用的電化學(xué)滅菌法也可以采用。
培養(yǎng)的組織相同物包括一由介子，最好是成纖維細(xì)胞收縮而成的水合膠原晶格的真皮相同物。在一種實施方案中，表皮細(xì)胞的層狀層在真皮相同物的表面培養(yǎng)。在另一種實施方案中，由角質(zhì)化細(xì)胞收縮而來的水合收縮膠原晶格被放置在一層角膜內(nèi)皮細(xì)胞上，其角膜上皮細(xì)胞的層狀層在晶格的表面培養(yǎng)。另外，單獨的表皮細(xì)胞可培養(yǎng)，誘導(dǎo)分層以形成表皮層。培養(yǎng)的組織相同物或是在載體的多孔膜上形成，或是在附著于載體底面多孔膜上的膠原凝膠上形成。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，其它的培養(yǎng)組織相同物也可冷藏，包括，但不局限于此，任何培養(yǎng)的表皮層，任何培養(yǎng)的真皮相同物，任何培養(yǎng)的角膜相同物，或獲得的哺乳動物皮膚。
現(xiàn)利用組織相同物和優(yōu)選的包裝設(shè)計對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)敘述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白，即使對所述的方法進(jìn)行修正，改造，仍包括在本用冷藏液浸透組織相同物的方法是將組織相同物和連接的載體浸入大量的足以淹沒樣品的冷藏液中，并且在組織相同物的上下具有等體積的冷藏液。在包含有組織相同物和載體的100mm陪替氏培養(yǎng)皿中加入25ml 2M的甘油和DMEM，放置一段時間，使之完全浸透樣品，時間可選在1到2小時之間，最好是1個小時左右。在冷藏液中放置時間過長，會減少組織中細(xì)胞的成活力；若時間太短，則不能保證冷藏液完全浸透組織，單層構(gòu)建物由于其細(xì)胞層數(shù)少，防護(hù)功能降低，通常只需較短的時間就可浸透。在浸泡時間內(nèi)，攪拌樣品和冷藏液，可加強(qiáng)促進(jìn)冷藏液的浸透，通常是將陪替氏培養(yǎng)皿放在軌道平臺搖床(Bellco軌道搖床)的含10％CO2的氣室中以70rpm的轉(zhuǎn)速搖動。10％CO2的環(huán)境與組織相同物制造的環(huán)境相同，避免了培養(yǎng)基脫氣，維持了冷藏液堿性基質(zhì)成分的pH。攪拌使得冷藏液能更快，更完全地浸入組織相同物，并使冷藏組織相同物間的結(jié)果重復(fù)性更好。也能用一種在其它立體水平能進(jìn)行攪拌運動的設(shè)備代替軌道搖床。另外，其它可增強(qiáng)浸透的機(jī)械方法包括，但不局限于此，搖動放在平臺上容器中的構(gòu)建物與冷藏液或離心構(gòu)建物與冷藏液，再用泵使構(gòu)建物浸透冷藏液。
將載體和連在其上的組織相同物放入盤子中，加入總共約16.0ml的冷藏液。包裝設(shè)計使得冷藏液均勻分布在載體下面約8.0ml，組織相同物上面約8.0ml。然后將蓋子蓋在盤子上，將兩部分熱封，最好是到蓋子柄。
然后，將包裝的組織相同物放入一起始溫度設(shè)置在室溫，最好是20.0℃的可編程冷柜(Cryomed式Planer)里，含包裝組織相同物的冷室以-10.0℃/分鐘的速度冷卻到固—液相平衡溫度，對于冷藏液，2.0M的甘油和DMEM，通常在約-5.3℃和-6.0℃之間。固一液相平衡溫度是在冷藏液中加入冰晶種的必需溫度。將冷室溫度保持一段時間，以平衡包裝組織相同物的內(nèi)部溫度至冷室溫度。用于得到加晶種溫度的冷卻速度不是一個關(guān)鍵因素。保持約40分鐘的時間足以保證熱平衡。但時間可依據(jù)冷室的大小，室內(nèi)空氣的循環(huán)，冷藏包裝數(shù)目的不同而變化。通常需要至少30分鐘的時間，達(dá)到1小時的時間能確保平衡。保溫一段時間后，加入晶種引發(fā)形成胞外冰。
加入冰晶種定義為在胞外冷藏液中引發(fā)冰晶形成的方法。一種優(yōu)選的加入冰晶種的方法是用一冷凍探針如一液氮冷凍(-196℃)鋼棒去接觸裝有組織的盤子的邊沿。棒與包裝的接觸點必需低于包裝中冷藏液冷凍基質(zhì)的水平面。另一種優(yōu)選方法是直接釋放一種膨脹氣體如氟利昂或CO2到包裝的外面。冰晶的形成由一冷室釘針引發(fā)，在那里，冷室溫度在一定范圍內(nèi)升降足以形成冰晶。也可采用本領(lǐng)域里已知的其它加入冰晶種的方法。
當(dāng)所有的組織相同物被加入冰晶種后，將包裝單元放置額外的1小時，以達(dá)到熱力學(xué)平衡及傳播冰晶種使遍布冷藏液。然后重新開始冷卻，其速度選擇在-0.02～-0.3℃/分鐘之間；選擇在-0.05～-0.1℃/分鐘更好；選擇在約-0.07℃/分鐘最好，冷卻至最終溫度，至少應(yīng)為-70.0℃，或低于-70.0℃；再好一點為-120℃；更好為-140℃，最好為-196℃。隨著最終冷凍溫度接近水的玻璃化溫度，-120℃，在轉(zhuǎn)移到最終貯存地期間，將不太可能產(chǎn)生不利的溫度波動。
將冷藏的組織相同物從可編程的冷柜轉(zhuǎn)移到溫度約在-120℃到-150℃之間的汽相液氮貯存罐(Dewar)貯存，或直接貯存在-196℃的液氮里，直到使用。
為了融化冷藏的培養(yǎng)組織相同物，將其從汽相液氮貯存處取出，轉(zhuǎn)移到干冰上，加熱至約-75℃。一旦在-75℃達(dá)到平衡，將培養(yǎng)組織相同物轉(zhuǎn)移到一環(huán)境中，最好是水浴，溫度設(shè)置在37℃，設(shè)置在4℃更好，設(shè)置在室溫最好。一旦看見所有的冷藏液基質(zhì)都轉(zhuǎn)為液相，則最好將培養(yǎng)的組織相同物包裝單元轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，或其它無菌的地方，并用乙醇洗滌。將培養(yǎng)皿的蓋子剝?nèi)セ驈陌b單元的底部切去蓋子的柄以除去蓋子。然后，倒掉多余的冷藏液，將含有培養(yǎng)的組織相同物的載體轉(zhuǎn)移到陪替氏培養(yǎng)皿中。將25ml清洗液，最好是DMEM在室溫加到含有培養(yǎng)組織相同物的陪替氏培養(yǎng)皿中約30分鐘，以洗掉培養(yǎng)組織相同物中殘留的冷藏液。由技術(shù)人員來決定是否加入其它充足的清洗液。最好是生理補(bǔ)強(qiáng)液，如細(xì)胞培養(yǎng)基戊磷酸鹽緩沖液。更換清洗液兩次，再放置額外的30分鐘。清洗時間的長短由組織的復(fù)雜性來確定。
可將培養(yǎng)的組織相同物轉(zhuǎn)移到最初的培養(yǎng)皿中，在37℃/10％CO2于維持培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。另外，這種相同物可用于病人，或用于檢測與某種物質(zhì)接觸后的反應(yīng)，詳見美國專利號4,835,102。
下面的實例更詳盡地闡述了本發(fā)明的應(yīng)用，但無論如何，不應(yīng)被看作是對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的原則下，可對在此敘述的方法進(jìn)行各種修正。
實例例1至例3例1至例3為本發(fā)明的具有最佳包裝設(shè)計的冷藏和融化技術(shù)。
例1具有包裝設(shè)計的活皮膚相同物(LSE)的冷藏根據(jù)美國專利申請序號08/193,809可制備活皮膚相同物(LSE)構(gòu)建物。在空氣升液后9到10天，LSEs和連接的載體插入物(TRANSWELLCostar，Cambridge)，被放在100mm的陪替氏培養(yǎng)皿(Costar)中。將構(gòu)建物和transwell浸入裝在100mm的陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)的25ml冷藏液，DMEM中的2M甘油1小時，可使LSE構(gòu)建物充滿冷藏液。在充液過程中，將構(gòu)建物放在含10％CO2的氣室中于軌道搖床(Bellco)上以70rpm的轉(zhuǎn)速搖1小時。搖動能使充液更完全，并使冷藏法具有更好的再現(xiàn)性。在LSE充滿冷藏液后，將含有LSE，載體插入物，胞外冷藏液(2M的甘油和DMEM)的陪替氏培養(yǎng)皿放入一冷藏包裝盒里，加熱封口。在與本申請同時提交的一共同未決的專利申請中，美國專利申請序號--/---,---，也敘述了該冷藏包裝盒的制備。
在本文敘述的本發(fā)明中配備了一個可編程的冷柜(Planar)的冷室。冷柜的起始溫度設(shè)置在20℃管道線里每隔1秒用氟里昂清潔凈化一次，以除去管道線里的任何空氣。包裝好的LSE單位被安全放置在能容納8個LSE單位的架子上。這些架子在定位針指示下，安放在臨近噴霧軌道處。關(guān)閉冷柜冷室的門，使冷室與外部環(huán)境隔絕。
LSE單元以-10℃/分的速度被冷卻到-6℃。將冷室溫度維持在-6℃40分鐘，以平衡冷藏液和充滿冷藏液的結(jié)構(gòu)物至冷室溫度。40分鐘后，通過直接使緊靠包裝邊沿的氟里昂去電荷1秒鐘，可引發(fā)胞外冰的形成，隨著包裝表面的氟里昂的蒸發(fā)，使得與氟里昂接觸的地方溫度下降，足以引發(fā)胞外冰的形成。
當(dāng)所有的LSE單元加入冰晶種后，將它們在-6℃平衡1小時。然后，將冷室溫度以-0.07℃/分的速度冷卻到-20℃，再以-0.5℃/分的速度冷卻到最終溫度-70℃。一旦LSE單元被冷藏后，將其轉(zhuǎn)移到一溫度為-120℃到-150℃的汽相貯存罐(Dewar)里。
例2融化冷藏的LSE將冷藏的LSE從汽相的液氮貯存處取出，轉(zhuǎn)移到干冰上加熱至約-75℃。在-75℃平衡后，將培養(yǎng)的組織相同物轉(zhuǎn)移到37℃水浴中；若是4℃水浴更好；放置在室溫最好。一旦看見所有的冷藏液變?yōu)橐合?，則最好將培養(yǎng)的組織相同物包裝單元轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，或其它無菌的地方，并用乙醇洗滌。將培養(yǎng)皿的蓋子剝?nèi)セ驈陌b單元的底部切去蓋子的座以除去蓋子，然后，倒掉多余的冷藏液，將含有培養(yǎng)的組織相同物的載體轉(zhuǎn)移到陪替氏培養(yǎng)皿中。將25ml清洗液(室溫)，最好是DMEM加到含有培養(yǎng)組織相同物的陪替氏培養(yǎng)皿中約30分鐘，以洗掉培養(yǎng)組織相同物中殘留的冷藏液。由技術(shù)人員來決定是否加入其它的充足的生理清洗液，如其它的培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液。更換清洗液兩次，再放置額外的30分鐘。
用組織學(xué)法處理融化的冷藏樣品和對照樣品，通過光學(xué)顯微鏡評價其形態(tài)組織和成活力，結(jié)果表明其成活力接近100％，與對照樣品幾乎無甚區(qū)別。
例3由加熱速度和熱均勻性來評價冷藏包裝設(shè)計本發(fā)明的冷藏包裝由均勻的熱轉(zhuǎn)移來評價。在未連接培養(yǎng)的組織相同物的載體膜上安裝5個熱電偶，一個在中心，另4個離載體的邊沿壁均留出1.0mm的間隔。熱電偶的導(dǎo)線從蓋子到盤緣之間這邊離開包裝盒到溫度記錄儀(Azonix Scanner Plus)。包裝盒里充滿了17ml冷藏液，加熱封口。將包裝盒平衡到-70℃，再轉(zhuǎn)移到20℃水浴中。在加熱過程中，溫度記錄儀每隔1-2秒記錄一次每個熱電偶的溫度。包裝盒最初以700℃/分鐘的速度被加熱，當(dāng)接近冷藏液的熔點時則放慢速度。在加熱速度達(dá)到最大時，熱均勻性為平均熱電偶溫度，在2℃到6℃之間。在為溶液的熔點時，則接近8℃。
例4到12為本發(fā)明的對不同組織的冷藏方法。
例4表皮片的冷藏在空氣升液后12天，從成熟的LSE獲取表皮片。用鑷子從表皮層上剝?nèi)フ嫫?，將其丟掉，再取下表皮片。將每一片切成相同的三塊。將每一片中的一塊用作對照，另兩塊放在位于100mm培養(yǎng)皿(Costar)中的一塊75mm多聚碳酸酯transwell膜(Costar)上面。每一塊用25mlDMEM和2M甘油浸泡1小時。將裝有構(gòu)建物的培養(yǎng)皿放在一軌道搖床(Bellco)的含10％CO2的氣室中70rpm搖1小時。當(dāng)表皮片浸透后，將裝有表皮片，trasnswell和胞外冷凍基質(zhì)(2M甘油和DMEM)的陪替氏培養(yǎng)皿放入一盒子中，真空封接，(Audiovox)編程抽真空5秒，封接3.9秒。
將包裝的表皮片放入一起始溫度為20.0℃的可編程的冷柜(Planer)里。表皮片以-10.0℃/分鐘的速度被冷卻至-6.0℃。將溫度維持在-6.0℃20分鐘使平衡到冷室溫度。然后將一液氮冷凍探針伸到冷凍液下面，接觸盒子的外邊，引發(fā)胞外冰的形成。在所有的表皮片被加入冰晶種后，在-6.0℃再保持5分鐘。然后，以-1.0℃/分鐘的速度將冷室冷卻至-8.0℃。在-8.0℃保持30分鐘，使樣品周圍的冰塊均勻分布。然后，以-0.1℃/分鐘的速度將冷室冷至最終溫度-70.0℃。
將冷藏的表皮片從冷柜中取出，將盒子與陪替氏培養(yǎng)皿分開，移去蓋子。將加熱的40ml DMEM(37℃)無菌倒入每個陪替氏培養(yǎng)皿中，進(jìn)行融化。45秒后，將所有的液體從培養(yǎng)皿中除去，再加入40ml液體到每個培養(yǎng)皿中2分鐘。當(dāng)所有的冰都融化后，用25ml DMEM漂洗表皮片30分鐘。更換漂洗液，再放置30分鐘，在進(jìn)行分析前，將表皮片放入維持培養(yǎng)基中37℃/10％CO2保溫24小時。保溫時間允許滯后，通?？磥硎且驗槔鋬黾?xì)胞需恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀況。再一次，保溫時間允許滯后，通常看來是因為冷凍細(xì)胞需恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀況。
對于每一表皮片的剩余的兩塊，其中一塊用于組織學(xué)處理，另一塊用MTT檢測法測定。比較實例4的非冷藏表皮片和冷藏表皮片的光學(xué)顯微圖片，發(fā)現(xiàn)表皮的三個基本特征表皮基層，表皮上基層和表皮層狀角質(zhì)，均可由該方法保存。每一層都未受損，冷藏表皮片的全部形態(tài)學(xué)都與未冷藏的表皮片一致。
例5真皮相同物的冷藏本研究所用的真皮相同物為LSE的非表皮化成分。在剝下后8天，真皮相同物被冷凍。將放置在100mm陪替氏培養(yǎng)皿(Costar)中并連在75mm transwell(Costar)上的真皮相同物浸入25ml DMEM和2M甘油中1小時，使冷藏液充滿真皮相同物。將陪替氏培養(yǎng)皿放在軌道搖床(Bellco)的含10％CO2氣室中于70rpm搖1小時。當(dāng)真皮相同物浸透冷藏液后，將陪替氏培養(yǎng)皿，真皮相同物，trasnswells和胞外冷藏基質(zhì)放入一起始溫度為20.0℃的可編程冷柜(Planer)里。然后，以-10.0℃/分鐘的速度將冷室冷至-6.0℃。維持該溫度20分鐘，使之平衡到冷室溫度。平衡20分鐘后，將一液氮冷凍探針插入到冷凍基質(zhì)下面，接觸培養(yǎng)皿的外壁，引發(fā)胞外冰的形成。當(dāng)所有的真皮相同物都被播種冰晶后，于-6.0℃再保溫5分鐘。然后，以-1.0℃/分鐘的速度將冷室冷至-8.0℃。將冷室溫度在-8.0℃保持30分鐘。使冰晶在整個樣品中均勻分布。然后，以-0.1℃/分鐘的速度將真皮相同物冷至終溫度-70.0℃。
然后，將冷藏的真皮相同物從冷柜中取出，去掉培養(yǎng)皿的蓋子。為了融化，將40ml溫?zé)岬?37℃)DMEM無菌操作倒入每個陪替氏培養(yǎng)皿中。45秒鐘后，倒掉皿中的所有液體，重新加入40ml DMEM液，放置2分鐘。當(dāng)所有的冰都融化后，加入25ml DMEM漂洗真皮相同物30分鐘，更換溶液一次，再漂洗30分鐘，在進(jìn)行分析前，將仍然連在transwells上的真皮相同物轉(zhuǎn)移回培養(yǎng)皿中，在維持培養(yǎng)基中37℃/10％CO2保溫24小時。保溫時間允許滯后，通常是因為冷凍細(xì)胞需恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀況。用MTT試驗檢測樣品。
例6角膜相同物的冷藏在濕空氣升液后9天，將連在24mm培養(yǎng)transwells(Costar)上的角膜相同物放入6孔簇培養(yǎng)皿(six well cluster dishes)(Costar)中。在6孔簇培養(yǎng)皿中將每一個角膜相同物和transwell浸入4ml胞外冷凍基質(zhì)(2M甘油和DMEM)中1小時，使冷藏液充滿角膜。將包含角膜構(gòu)建物的6孔簇培養(yǎng)皿放在軌道搖床(Bellco)上于10％CO2氣室中70·rpm搖1小時。當(dāng)角膜相同物浸透冷藏液后，將包含角膜相同物，transwells和為胞外冷凍基質(zhì)的6孔簇培養(yǎng)皿放入一起始溫度為20.0℃的可編程的冷柜(Planer)里。以-10.0℃/分鐘的速度將角膜相同物冷至-6.0℃保持此溫度20分鐘使平衡到冷室溫度。平衡20分鐘后，將一液氮冷凍探針插入到冷凍基質(zhì)下面，接觸簇板上每一個孔的外壁，引發(fā)胞外冰的形成。在所有的角膜相同物被播種冰晶后，在以-1.0℃/分鐘的速度冷至-8.0℃之前。于-6.0C再保溫5分鐘，在-8.0℃保溫30分鐘，使冰晶在整個樣品中均勻分布。以-0.1℃/分鐘的速度將角膜相同物冷至終溫度-70.0℃。
將冷藏的角膜相同物從冷柜中取出，將培養(yǎng)皿的蓋子去掉。為了融化，在簇板的每個孔中無菌操作倒入6ml溫?zé)岬?37℃)DMEM。45秒鐘后，倒掉皿中的所有液體，重新加入6ml DMEM放置2分鐘。用無菌鑷子將角膜相同物和相連的transwells轉(zhuǎn)移到一新的簇培養(yǎng)皿中，在每一個孔中加4mlDMEM漂洗30分鐘，更換一次溶液，再漂洗30分鐘。然后于分析前，將角膜單元轉(zhuǎn)移回相同的培養(yǎng)皿中，在角膜維持培養(yǎng)基中于37℃/10％CO2保溫24小時。保溫時間允許滯后，通常是因為冷凍細(xì)胞需恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀況。用MTT試驗檢測樣品。
例7獲取的鼠皮膚的冷藏野生型小鼠，種號B6CB6YF1，由過劑量Nembutal無痛致死。無菌操作取下皮膚。從真皮上去掉過量的血管，脂肪和連接的組織。將小鼠皮膚修剪成1cm×2cm的長方形塊。將小鼠皮膚塊放入75mmtranswell(Costar)上放入100mm陪替氏培養(yǎng)皿(Costar)中，在100mm陪替氏培養(yǎng)皿中將小鼠皮膚浸入25ml 2M甘油和DMEM中1小時，使小鼠皮膚充滿冷藏液。在充滿過程中，將包含有小鼠皮膚和tramswell的陪替氏培養(yǎng)皿放在軌道搖床(Bellco)上于10％CO2氣室中于70rpm搖1小時。在皮膚移植前的冷藏和融化過程期間(2天)，對照，未冷藏的小鼠皮膚于4℃下保存在營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
當(dāng)小鼠皮膚浸透冷藏液后，將裝有鼠皮膚transwells和胞外冰藏基質(zhì)的陪替氏培養(yǎng)皿放入一起始溫度為20.0℃的可編程的Planer冷柜中。以-10.0℃/分鐘的速度將小鼠皮膚冷至-6.0℃。于此溫度上保持20分鐘，使之平衡到冷室溫度。平衡20分鐘后，用一液氮冷凍探針接觸培養(yǎng)皿的外壁，引發(fā)胞外冰的形成。接觸位點必須低于冷凍基質(zhì)水平面。當(dāng)所有的小鼠皮膚被播種冰晶后，保持-6.0℃的溫度5分鐘。再以-1.0℃/分鐘的速度冷至-8.0℃。在-8.0℃保持30分鐘。使冰晶在整個樣品中均勻分布。以-0.1℃/分鐘的速度將包裝單位冷至終溫度-70.0℃。
將冷藏的小鼠皮膚從冷柜中取出，去掉培養(yǎng)皿的蓋子。為了融化，將40ml溫?zé)岬?37℃)DMEM無菌操作倒入陪替氏培養(yǎng)皿中。45秒鐘后，將所有液體從皿中倒出，再加入40ml液體，放置2分鐘。當(dāng)所有的冰都融化后，在培養(yǎng)皿中將小鼠皮膚用25ml DMEM漂洗30分鐘，更換一次DMEM，再漂洗30分鐘。
將凍融的樣品和對照樣品進(jìn)行組織學(xué)處理或移植到小鼠身上。比較非冷藏小鼠皮膚和冷藏小鼠皮膚的光學(xué)顯微圖片，發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚的四個基本特征具成纖維細(xì)胞的真皮，表皮基層，表皮上基層和表皮層狀角質(zhì)，均可由該方法保存。每一層都未受損，冷藏小鼠皮膚的全部形態(tài)學(xué)都與未冷藏的小鼠皮膚一致。
例8冷藏ATS SKIN2TM根據(jù)船運插入物的到達(dá)時間，將SKIN2TM，型號ZK 1300(組織科學(xué)進(jìn)展，La Jolla，CA)從包裝中取出，放入培養(yǎng)皿(Costar)中。將transwell插入物放在SKIN2TM的上面以使皮膚構(gòu)建物浸入其中。在培養(yǎng)皿中將SKIN2TM浸入2M甘油和DMEM中1小時。使SKIN2TM中充滿冷藏液。在充滿過程中，將包含構(gòu)建物和transwell的培養(yǎng)皿放在一軌道搖床(Bellco)上于10％CO2的氣室中70rpm搖1小時。
當(dāng)SKIN2TM中充滿冷藏液后，將包裝單元放入一起始溫度為20.0℃的可編程的冷柜(Planar)里。以-10.0℃/分鐘的速度將SKIN2TM冷至-6.0℃。保持該溫度20分鐘，使之平衡到冷室溫度。平衡20分鐘后，用一液氮冷凍探針插入冷凍基質(zhì)中，接觸培養(yǎng)皿的外壁，引發(fā)胞外冰的形成，在所有的SKIN2TM單元都播種冰晶后，再將溫度保持在-6.0℃5分鐘。然后，以-1.0℃/分鐘的速度將冷室溫度冷至-8.0℃。將SKIN2TM單元在-8.0℃保持30分鐘。使冰晶在整個樣品中均勻分布。然后將SKIN2TM單元以-0.1℃/分鐘的速度冷至終溫度-70.0℃。
將冷藏的SKIN2TM從冷柜中取出，去掉培養(yǎng)皿的蓋子。將溫?zé)岬?37℃)DMEM無菌操作倒入每個培養(yǎng)皿中。45秒鐘后，將所有的液體從皿中倒出，重新加入DMEM到每個培養(yǎng)皿中，放置2分鐘。一旦融化了，用無菌鑷子將SKIN2TM單元和連接的transwell轉(zhuǎn)移到一個新的培養(yǎng)皿中。為了漂洗掉SKIN2TM中的冷藏液，在含SKIN2TM的每個培養(yǎng)皿中加入DMEM，30分鐘更換一次DMEM，再漂洗額外的30分鐘。在分析前，將SKIN2TM單元轉(zhuǎn)移回同一類型的培養(yǎng)皿中，在維持培養(yǎng)基中于37℃/10％CO2保溫24小時，又，保溫時間可以滯后，通常是因為冷凍細(xì)胞需恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀況。
用MTT試驗測定SKIN2TM，型號ZK1300，附產(chǎn)物，的冷藏和對照構(gòu)建物，同樣也可由組織學(xué)來估價。比較非冷藏的SKIN2TM和冷藏的SKIN2TM的光學(xué)顯微圖片，表明SKIN2TM的4種基本構(gòu)成，具成纖維細(xì)胞的膠原網(wǎng)格，表皮基層，表皮上基層和表皮層狀角質(zhì)，都可由該法保存。每一層都未受損，冷藏SKIN2TM的全部形態(tài)學(xué)都與未冷藏的SKIN2TM一致。
例9代謝線粒體活性試驗(MTT)用MTT試驗測定冷凍和非冷凍(對照)的LSE，表皮片，真皮相同物和角膜相同物。[SKIN2TM構(gòu)建物的檢測根據(jù)“用于型號ZK1300的MTT試驗”，附船運插入物]用MTT試驗測定構(gòu)建物的細(xì)胞成活力，一種比色的MTT轉(zhuǎn)化法用于測定細(xì)胞生長和成活力。Gay等對該法進(jìn)行了詳細(xì)敘述，“活皮膚相同物作為一種體外模式用于排列真皮刺激物的潛在毒性，”體外毒物，6303-315(1992)。將可溶性的四唑鹽代謝還原成一種蘭色的甲沉淀，依賴于具有完整線粒體功能的活細(xì)胞的存在。本試驗用于定量各種細(xì)胞包括培養(yǎng)的人類角質(zhì)化細(xì)胞的細(xì)胞毒素。
在包含LSE，表皮片和真皮相同物的培養(yǎng)皿中加入40ml試驗培養(yǎng)基，在包含角膜相同物的小孔里加入含0.33mg/ml MTT(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的試驗培養(yǎng)基1.5ml。將組織相同物在MTT試驗培養(yǎng)基中保溫3-4小時。在轉(zhuǎn)化末期，用一直徑為8mm的皮膚活組織檢查穿孔器對組織相同物進(jìn)行活組織檢查，然后，在室溫將穿孔的活組織用由0.04N HCl酸化的0.3ml異丙醇抽提2-3小時，在抽提結(jié)束后，將每一種抽提液取0.2ml轉(zhuǎn)移到-96孔板的孔中。用異丙醇抽提培養(yǎng)基作空白，在一板式讀數(shù)器上(Dynatech)讀570nm的吸收值。從凍融樣品得到的MTT值與相應(yīng)的對照樣品的進(jìn)行比較，以對照的百分?jǐn)?shù)來表示。
例10乳糖脫氫酶試驗(LDH)LDH為普遍存在于活細(xì)胞中的一種酶。對細(xì)胞的損傷會導(dǎo)致該酶的釋放，用本試驗進(jìn)行檢測，則相應(yīng)的酶活力降低。
用一直徑為8mm的皮膚活組織檢查穿孔器對LSE的凍融樣品和對照樣品進(jìn)行穿孔。從每一LSE單位中取出樣品3份。將穿孔的樣品放入裝有1ml 0.1M三乙醇胺緩沖液(于冰上)的15mm試管中，用一電組織勻漿器勻漿1分鐘，然后在4.0℃1000g下離心。測定上清液，裝下列試劑混合可制得LDH混合試劑3.0ml磷酸緩沖液(0.1mol/L；pH7.0)，0.1ml丙酮酸Na鹽(2.5mg/mt)，和0.05ml NADH Na鹽(10mg/ml)。將100μl樣品上清液加到900μl混合試劑中，反應(yīng)2分鐘，記錄2分鐘內(nèi)吸收值的變化。將每一冷藏LSE單元的三份樣品的平均值與非冷藏對照進(jìn)行比較。樣品值與相應(yīng)的對照值進(jìn)行比較，并以對照的百分?jǐn)?shù)來表示(圖4)。
例11冷藏LSE和非冷藏LSE的生物相同性為了證明冷藏的和非冷藏的LSE具有生物相同性，進(jìn)行了athymic鼠的移植研究。
在移植前一天，將根據(jù)例1中所述方法冷藏的LSE單元融化，并在維持培養(yǎng)基中恢復(fù)24小時。
進(jìn)行了4次實驗，用冷藏的LSE(n＝43)或非冷藏的(對照)LSE(n＝23)對總共66只athymic鼠，種號B6CB6YF1/J-nu(JacksonHarbor Labs)，進(jìn)行移植。用Nembutal對動物進(jìn)行麻醉。從每只小鼠背部切下2×2cm的全厚度皮膚塊，抽出肌膜(panicculus carnosus)。將LSE移植物，或是對照，或是冷藏樣品，放在傷口處，修剪使其適合。在所有的移植物上包扎一層飽含凡士林的羅紗布(vendor)其外再纏兩層膠口繃帶(vendor)。在移植7天后將包扎取掉。
移植14天后，將所有動物無痛致死前照像將移植部位切下作組織學(xué)分析并評價。一般像片和顯微像片表明，對于對照LSE或凍融LSE而言，在移植融合方面沒有區(qū)別。在傷口攣縮速度方面，對照或冷藏移植物間也無明顯區(qū)別。
例12冷藏和非冷藏小鼠皮膚的同基因皮膚移植為了證明冷藏的和非冷藏的小鼠皮膚的生物相同性，進(jìn)行了同基因皮膚移植研究。
用過劑量的Nembutal使野生型小鼠，種號B6CB6YF1，無痛致死。無菌操作獲取皮膚，從真皮除去多余的血管，脂肪和相連的組織，然后用真皮制備皮膚移植物。按照例7中的方法冷藏和融化小鼠皮膚。皮膚移植前，在共計2天的凍融過程中。將對照，非冷藏的小鼠皮膚于4℃保存在營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
同種的6只小鼠接受皮膚移植，兩只接受對照，非冷藏小鼠皮膚，4只接受凍融小鼠皮膚。用Nembutal將小鼠麻醉。從每只小鼠的背部切下2×2cm的全厚度皮膚塊，抽出肌膜(Panicculus carnosas)。將小鼠皮膚移植物，或是對照，或是冷藏樣，放在傷口處，修剪使其適合，在所有的移植物上包扎一層飽含凡士林的羅紗布，其外再纏兩層膠口繃帶。移植后7天，可將包扎去掉。
移植后30天，將所有動物無痛致死并照像。切下移植部位用于組織學(xué)分析和評價。一般像片和顯微像片表明，在對照小鼠皮膚或凍融小鼠皮膚之間，在移植物整合方面沒有區(qū)別。在對照或冷藏移植物之間，傷口攣縮速度也無明顯區(qū)別。
雖然對前述的發(fā)明已經(jīng)做了描述，為了便于理解，對于某些細(xì)節(jié)舉出實例進(jìn)行說明，但顯而易見的是，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)做出變動和修改。
權(quán)利要求
1.一種冷藏獲取的哺乳動物角膜組織或培養(yǎng)的角膜組織相同物的方法，包括(a)將上述組織浸入冷藏液中，攪拌上述冷藏液和上述浸入組織，使冷藏液有效地滲透上述組織，得到滲透組織；(b)在上述冷藏液和滲透組織中播種胞外冰；(c)通過以緩慢的冷凍速度將由步驟(b)得來的上述滲透組織冷至一溫度，該溫度至少等于或低于-70℃，而使上述組織冷至冷藏狀態(tài)，從而得到冷藏組織；和(d)在至少等于或低于-70℃的溫度下，貯存上述冷藏組織。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)所述的浸入，其起始溫度約20℃，然后，在滲透過程中，以約-10℃/分鐘的速度冷至約-6℃。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)的冷凍是以-1℃/分鐘的速度冷至約-8℃，保持一段時間直至在上述組織中的上述冷藏液達(dá)到物理和生物學(xué)平衡。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)的溫度是保持恒定一段時間足以使在上述組織中的上述冷藏液達(dá)到物理和生物學(xué)平衡。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述的冷卻是以約-0.3℃到-0.02℃的速度一直持續(xù)到約-70℃或更低。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的冷藏狀態(tài)的所述溫度是等于或低于-120℃至等于或低于-196℃。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的冷藏液是在Dulbeuo’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM)基質(zhì)中的1.5M到2.5M的甘油。
8.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括融化所述的玻璃化組織，其中所述的組織在約1到約2分鐘的時間內(nèi)融化。
9.一種用于冷藏獲取的哺乳動物角膜組織或培養(yǎng)的角膜組織相同物的設(shè)備，包括一個盤子，包括一與側(cè)壁和法蘭相連的底面，其中側(cè)壁具有向內(nèi)伸出的支持物，該支持物從側(cè)壁伸出并與側(cè)壁形成一整體；一個載體，包括一個連在一基本為管狀的支持物一端的扁平透性膜和位于所述的管狀支持物另一端的邊緣，其中所述的邊緣由所述的盤子的所述的向內(nèi)伸出的支持物來支持；一個蓋子，包括一與側(cè)壁和法蘭相連的平底面，其中所述的法蘭與所述盤子的法蘭緊密接觸；和在所述盤子和所述蓋子之間的密封墊。
全文摘要
本發(fā)明為獲取的哺乳動物組織和體外技術(shù)制備的活培養(yǎng)組織相同物的一種有效的冷藏包裝設(shè)計。本發(fā)明包括將哺乳動物組織或培養(yǎng)組織相同物浸入到冷藏液中，攪拌冷藏液和浸入的組織，使冷藏液有效地侵透組織，然后，以緩慢的冷凍速度冷凍組織。在冷凍步驟中，通過引入晶種引發(fā)胞外冰的形成，在使用前，冷藏組織可無限期貯存。培養(yǎng)組織相同物是相同人類組織，如皮膚或角膜，的體外標(biāo)本，當(dāng)從貯存處取回后，可用于體內(nèi)移植或植入，或體外篩選化合物。
文檔編號B65D77/04GK1589622SQ03145798
公開日2005年3月9日 申請日期1996年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月30日
發(fā)明者S·R·瓦特森, M·托納, A·G·楚馬科 申請人:器官發(fā)生有限公司