一種復(fù)合微生物肥及其制備
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合微生物肥，重量份數(shù)組成為：植物乳桿菌混合菌劑15?30份，曲霉混合培養(yǎng)物10?16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1?3份，枯草芽孢桿菌菌粉5?10份，聚谷氨酸0.5?1份。肥料顆粒表面的聚谷氨酸可以在實(shí)際使用過(guò)程中吸納水分形成水凝膠，為顆粒內(nèi)部肥料的迅速生長(zhǎng)繁殖提供水分環(huán)境，同時(shí)也可以達(dá)到緩慢釋放生物菌肥力的效果。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.1176320151130
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種復(fù)合微生物肥及其制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生態(tài)肥，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物肥料是活體肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活動(dòng)來(lái) 完成。只有當(dāng)這些有益微生物的生命活動(dòng)來(lái)完成。只有當(dāng)這些有益微生物處于旺盛的繁殖 和新陳代謝的情況下，物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有益代謝產(chǎn)物才能不斷形成。因此，微生物肥料中有益微 生物的種類(lèi)、生命活動(dòng)是否旺盛是其有效性的基礎(chǔ)，而不像其它肥料是以氮、磷、鉀等主要 元素的形式和多少為基礎(chǔ)。正因?yàn)槲⑸锓柿鲜腔钪苿?，所以其肥效與活菌數(shù)量、強(qiáng)度及周 圍環(huán)境條件密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)條件及原生活在土壤中土著微生物排 斥作用都有一定影響。
[0003] 發(fā)明名稱(chēng)為微生態(tài)海藻酸有機(jī)肥料增效劑制備方法，申請(qǐng)?zhí)枺?01110221042.4，發(fā) 明提供一種微生態(tài)海藻酸有機(jī)肥料增效劑，包括海藻酸2-60%、甘露醇0.1-5%、粗蛋白1-20 %以及復(fù)合芽孢桿菌，其中復(fù)合芽孢桿菌活性成分包括:地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、 短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、多食鞘芽孢桿菌和膠凍樣芽胞桿菌，活菌總數(shù)〇. 1-50億/ml;該 增效劑的制備方法以海藻為原料，利用高活性解聚酶裂解，再接入復(fù)合菌種進(jìn)行升溫加氧 發(fā)酵，所得到的增效劑完全保留海藻中的天然活性有效成分，如海藻酸(海藻多糖）、粗蛋白 以及氮、磷、鈣、碘、鉀、鎂、錳、硒等微量元素。
[0004] 名稱(chēng)為一種微生物肥料的制備方法申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枺?01310743759.4,發(fā)明公開(kāi)了一 種微生物肥料的制備方法，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域，所述微生物肥料的生產(chǎn)方法，是將黑曲 霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例混合為微生物肥料。本發(fā) 明的肥料通過(guò)復(fù)合微生物發(fā)酵的方法制成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長(zhǎng) 提供有益條件。解磷巨大芽孢桿菌能分解土壤中的有機(jī)磷成為植物可利用的速效磷;本發(fā) 明使用的黑曲霉具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機(jī)質(zhì)的分解，腐殖 質(zhì)的形成和碳素營(yíng)養(yǎng)的釋放。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國(guó)內(nèi)外 使用量較少的微生物肥料之一。
[0005] -種復(fù)合飼料添加劑產(chǎn)品，申請(qǐng)?zhí)枮?01210182772.2,該專(zhuān)利公開(kāi)了一種復(fù)合飼 料添加劑產(chǎn)品，組成如下：低聚果糖10-15%，大豆多肽10-20%，黃芪萃取物10-25%，枯草 芽孢桿菌凍干菌粉，靈芝菌固體發(fā)酵培養(yǎng)物;枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)為CGMCC 6012,上述比例為質(zhì)量百分比;本發(fā)明產(chǎn)品可以有效降低抗生素類(lèi)藥物在飼養(yǎng)動(dòng)物中的使 用量，提高動(dòng)物肉制品的安全性，提高動(dòng)物的飼料利用效率，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，提高飼養(yǎng) 效益。
[0006] 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，申請(qǐng)?zhí)枺?01310566374.5，本發(fā)明公開(kāi)了 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Li-2013-02 于 2013年 7 月 15 日 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC) ， 保藏 號(hào)為CGMCCNo. 7926。該菌株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2010經(jīng)紫外線-氯化鋰- 硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點(diǎn)，應(yīng)用前景 非常廣闊。一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉.申請(qǐng)?zhí)枺?01310571925.7.本發(fā)明公開(kāi)了一株高產(chǎn) 纖維素酶的黑曲霉，本發(fā)明屬于黑曲霉領(lǐng)域，特別涉及高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株。本發(fā)明 所提供的黑曲霉(六8口6坪；[11118111861')，該菌株保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7927。發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)跟蹤的各項(xiàng)性能指標(biāo)表明，該菌株 代謝正常，產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)，是一株優(yōu)良的纖維素酶高產(chǎn)菌株。
[0007] 由于我國(guó)長(zhǎng)期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國(guó)的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然 存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問(wèn)題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù) 發(fā)展已成為人類(lèi)共識(shí)的今天，這些問(wèn)題成了微生物肥行業(yè)函待打通的"瓶頸"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種復(fù)合微生物肥.
[0009] 復(fù)合微生物肥重量份數(shù)組成為：植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng)物 10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，聚谷氨酸0.5-1份。
[0010] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成· [0011]植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 3-8份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2-4份。
[0012 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0013]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1 -3份，黑曲霉培養(yǎng)物6-8份。 [0014]所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0015] 所述復(fù)合微生物肥的制備方法如下：
[0016] 將植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng)物10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌 劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，按照比例混合均勻，采用肥料造粒機(jī)造粒，粒徑在0.5-2_之間，隨后將上述肥料顆粒與聚谷氨酸進(jìn)行混合，使聚谷氨酸黏附在肥料顆粒表面。
[0017] 所述枯草芽孢桿菌菌粉制備:發(fā)酵法培養(yǎng)的發(fā)酵液離心分離，采用常規(guī)冷凍干燥 法獲得的菌粉。
[0018] 植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn) 接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加 載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為〇. 5-0.6:1，載體 組成為:CaC03 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0019]泡盛曲霉培養(yǎng)物制備：菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料 中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0020] 黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見(jiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)方法制備:孢子液接種到固 態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)料，干燥，粉碎干燥物。黑曲霉(Aspergi 1 lus niger)Li-2013-03保藏號(hào)為CGMCC N0.7927。
[0021] 本發(fā)明中植物乳桿菌CGMCC 9405菌株特點(diǎn)如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿 狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致 密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0022] 理化特征為:過(guò)氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實(shí)驗(yàn)( + )，運(yùn)動(dòng)性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氫氣體(-)，pH4.OMRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(+ )。
[0023]本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育：
[0024]原始出發(fā)菌種-試管活化-硫酸二乙酯(DES)誘變-亞硝基胍(NTG)誘變-等離 子體誘變-平板初篩-搖瓶復(fù)篩-傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0025]本發(fā)明所采用的出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d， 當(dāng)培養(yǎng)基pH為3.5時(shí)幾乎停止生長(zhǎng)，對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株 為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場(chǎng)的青儲(chǔ)飼料，采集時(shí)間2013年9月15日。
[0026]為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術(shù)對(duì)該菌種進(jìn)行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進(jìn)行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā) 酵，生物傳感器分析儀對(duì)高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實(shí)驗(yàn)， 評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。
[0027]植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代十次，各項(xiàng)性能指標(biāo)都 比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒(méi)有回復(fù)，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌 株。
[0028] 經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到35g/L/d，該菌株經(jīng)過(guò)71小時(shí)發(fā) 酵后乳酸濃度達(dá)到95g/L;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力 達(dá)到9.8mg/h/kg(自然發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽積累的速率大約為1. lmg/h/kg)，能夠耐1%膽鹽。 [0029]因此采用該菌種生產(chǎn)泡菜，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠(yuǎn)低于 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0030]植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014，該菌株已于2014 年7月2 日保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：中國(guó)北京市朝 陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.9405。
[0031] 1. DES誘變選育
[0032] 1)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無(wú)瓊 月旨，葡萄糖20g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)前期。
[0033] 2)取5mL菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0034] 3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/mL菌懸液。
[0035] 4)取32mL ρΗ7·0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0036] 5)在37°C搖床中150rpm反應(yīng)30min，取lmL混合液，加入0 · 5mL 25 %Na2S2〇3溶液中 止反應(yīng)。
[0037] 6)適當(dāng)稀釋?zhuān)∽詈笙♂尪鹊木?.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0038] 7)在37 °C培養(yǎng)2~3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。 [0039] 2.亞硝基胍誘變
[0040] 1)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌L1 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無(wú)瓊 月旨)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。
[0041 ] 2)取5mL菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0042] 3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/mL菌懸液。
[0043] 4)取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0044] 5)在37 °C下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水 洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0045] 6)適當(dāng)稀釋?zhuān)∽詈笙♂尪鹊木?.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0046] 7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
[0047] 3.搖瓶復(fù)篩
[0048] 1)在超凈臺(tái)上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無(wú)瓊脂)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為l〇〇g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)15h左右，使菌 體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0049] 2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基(含250g/L葡萄糖的碳酸 鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基）和 亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基（單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）上（注:采用 250mL三角瓶）。200印!11，37°(：培養(yǎng)3-4天，每天分別檢測(cè)碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn) 生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速 率。發(fā)酵結(jié)束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體 培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0050] 3)選擇兼具高L-乳酸產(chǎn)生速率、耐受低pH(該菌種僅能在最低為pHl. 8的培養(yǎng)基中 生長(zhǎng))和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L(zhǎng)2菌。
[0051 ] 4.遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0052]將L2菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后的發(fā)酵情 況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒(méi)有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說(shuō) 明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。菌株命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0053] 5. 5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
[0054] 1)取斜面上的植物乳桿菌L2-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無(wú)瓊脂）（葡萄糖濃度 為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。 [0055] 2)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌L2的乳酸產(chǎn)量達(dá)到95g/L。這樣的產(chǎn)乳酸速率 利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0056] 3)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為50g/ L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10 % (通氣 0.5L/min)，后期厭氧，整個(gè)過(guò)程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵液pH控制在1.8，總培養(yǎng)時(shí)間 為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說(shuō)明植物乳桿菌L2能夠在 pHl.8的環(huán)境中生存。
[0057] 4)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸 鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10 %，37 °C下1 OOrpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前 期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過(guò)程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L 的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算發(fā)酵過(guò)程植物乳桿菌L2對(duì)亞硝酸鈉的降解 速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，L2對(duì)亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到563mg/h/L。
[0058] 5)將對(duì)數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預(yù)處理過(guò)的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行 加工，每12小時(shí)測(cè)定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，L2菌對(duì)亞硝酸 鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0059]有益效果
[0060] 本發(fā)明的肥料由復(fù)合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的 生長(zhǎng)提供有益條件。本發(fā)明的肥料能夠改良土壤。肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類(lèi)物質(zhì)，占土 壤有機(jī)質(zhì)的〇 . 1 %，與植物粘液，礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起，可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)， 增強(qiáng)土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形成。所以 施用微生物肥料能改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。本發(fā)明的肥料能夠增強(qiáng)作物 的抗旱能力。本發(fā)明的復(fù)合菌種分解土壤里硅元素供植物利用，使得植物的蠟質(zhì)層增厚，提 高植物保水能力；能促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)形成，防止土壤板結(jié);破壞土壤毛細(xì)現(xiàn)象，防止土壤 水分蒸發(fā)。
[0061] 肥料顆粒表面的聚谷氨酸可以在實(shí)際使用過(guò)程中吸納水分形成水凝膠，為顆粒內(nèi) 部肥料的迅速生長(zhǎng)繁殖提供水分環(huán)境，同時(shí)也可以達(dá)到緩慢釋放生物菌肥力的效果，且可 以有效減少作物生長(zhǎng)階段的灌溉用水量13%以上。
[0062]本產(chǎn)品使用方法簡(jiǎn)單，每畝地使用量0.3-1公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或生 長(zhǎng)期灌水前使用。
【具體實(shí)施方式】
[0063]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0064]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03是由實(shí)驗(yàn)室保藏的一 株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對(duì)突變 株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌 株（Aspergillus niger)Li-2013-03〇
[0065]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101 )，保藏號(hào)為 CGMCC NO.7927〇
[0066]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟：
[0067] 1)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2010劃線接種斜面培養(yǎng) 基，30°C培養(yǎng)2~3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下 麥芽汁1000mL，pH值自然，121°C滅菌20min;
[0068] 2)孢子懸液制備（以下步驟均在無(wú)菌條件下操作）：向試管斜面加入15mL無(wú)菌水， 把孢子刮下，用濾紙過(guò)濾，將濾過(guò)液倒入已滅菌、并加有5-10粒無(wú)菌玻璃珠的150mL三角瓶 中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0069] 3)亞硝基胍(NTG)誘變
[0070] A.用無(wú)菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成106-107個(gè)/mL。
[0071 ] B.取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0072] C.在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水 洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0073] D.適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為103個(gè)/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于 纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株 200支。（所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨 5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉 O.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來(lái)水定容1000mL，pH值5-6，121 °C滅菌20min)。
[0074] E.復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無(wú)菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪 滿(mǎn)斜面。分別將孢子以無(wú)菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵， 接種量1〇%~八），30°(：、10(^/1^11培養(yǎng)9611，分別測(cè)定各菌株的纖維素酶活性。（所述復(fù)篩培 養(yǎng)基組成如下：纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0. lg、自來(lái)水 定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。 [0075] 4)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0076]將Li-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后 的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒(méi)有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo) 都正常，說(shuō)明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0077] 5)放大試驗(yàn)
[0078] ①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入 500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72-96h。
[0079]③種子罐培養(yǎng):將種子液以10 % (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的10L發(fā)酵罐 中，控制pH值恒定為6.0 ± 0.2，培養(yǎng)溫度30 ± 0.1°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/v) 1:0.8-1.2,培養(yǎng)時(shí)間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸 鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉 0. lg、自來(lái)水定容1000mL，pH值5-6,121°C滅菌20min。
[0080] 發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液（粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測(cè)經(jīng)測(cè)定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別 達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株Aspergillus niger Li-2010 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0081] 解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬(Bacillus)中的一個(gè)種。運(yùn)動(dòng)，形成莢膜，好氧。 從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP陰性。能分解 土壤中的有機(jī)磷成為植物可利用的速效磷。
[0082] 解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所提供，地址：中國(guó)河北滄州市運(yùn) 河區(qū)解放西路顧和國(guó)際商務(wù)中心A座1區(qū)807-812。
[0083] 本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02。該菌株已于2013 年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：中 國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏號(hào)為CGMCC No.7926。
[0084] 所述菌株特點(diǎn)如下：
[0085] 所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn) 動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實(shí) 驗(yàn)成陽(yáng)性。
[0086] 所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013_02由一株保藏于本實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn) 耐高溫淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲 得，具體篩選步驟如下：
[0087] (1)菌懸液的制備
[0088]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的Li-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培 養(yǎng)12h后，取lmL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
[0089] (2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0090]將菌懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將 經(jīng)過(guò)照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做 對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板 上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋 后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過(guò)的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂 布于氯化鋰平板。
[0091] (3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0092]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上初篩出水解圈與菌 落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02，Li-2013-03
[0093] (4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0094] 將獲得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02, Li-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上 清液制得粗酶液。
[0095] (5)酶活測(cè)定
[0096] 酶活單位的定義：lmL粗酶液，于105°C、pH 4.2條件下，1111；[11液化111^可溶性淀粉， 即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。
[0097] 經(jīng)測(cè)定，菌株Li-2013-02,為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U/mL，比原始菌 株酶活提高1.6倍。
[0098] 所述氯化鋰平板：淀粉1 %，蛋白胨1 %，（NH)2S〇4〇 · 4%，K2HP〇4〇 · 8%，CaCl20 · 2%， 氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0099] 所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCl 1%。
[0100] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，（NH)2S040.4%， K2HP040.8%，CaC120.2%。
[0101] 所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10% (V/V)，100r/min、40°C發(fā)酵培養(yǎng)72h。
[0102] 由菌株Li-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α-淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下：
[0103] (1)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105-115Γ之間，且在110°C以下保存 的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長(zhǎng)時(shí)間溫度穩(wěn)定性較差。
[0104] (2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0 時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
[0105] (3)酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力 為30000-35000U/ml。
[0106] 1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高 溫α_淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013-02,該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點(diǎn)。
[0107] 2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α-淀粉酶酶活力高達(dá)30000-35000u/ml，；適用溫度 范圍為25-115 °C，最適反應(yīng)溫度110 °C，在110 °C酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α-淀粉酶酶活力 高，酶作用最適pH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存 的工業(yè)化需求。
[0108] 發(fā)明所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.11763,保 藏地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編： 100101。。
[0109] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0110] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC N0.11763經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1%膽鹽培養(yǎng)4小時(shí)后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC N0.11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達(dá)到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在發(fā)酵60h小時(shí)后，對(duì)膽固醇降解率可達(dá)到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力測(cè)定的自凝集率為95 · 71 %。
[0111] CGMCC N0.11763對(duì)膽固醇降解能力研究和測(cè)定：
[0112] 取lml CGMCC N0.11763母液接種于10mL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，以接入lmL無(wú)菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對(duì)照，取以上培養(yǎng)不同時(shí)間的菌液樣品及對(duì)照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醛法測(cè)定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . lml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.Oml，混合均勻。室溫靜置lOmin，于550nm下測(cè)吸光值）。每一處理3個(gè)重復(fù)，以同樣方法制 作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見(jiàn)表1?？芍珻GMCC NO. 11763 對(duì)膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時(shí)后，降解率可達(dá)到64.76%。
[0113] 表1對(duì)膽固醇的降解情況
[0114]
[0115] CGMCC N0.11763菌株的耐膽鹽試驗(yàn)：
[0116] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接種菌種于含有不同膽鹽(含量梯度為0.0 %、0.2 %、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液體培養(yǎng)基(？!1=6.4)，置于37°(：下分別培養(yǎng)0、2、411， 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各取lml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄計(jì)算平 板上的菌數(shù)個(gè)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2?？芍摼谀扄}濃度為1 %處理4h后菌的生長(zhǎng)量依然達(dá)到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0117] 表2耐膽鹽能力檢測(cè)[(土s) X 107cfu/ml]
[0118]
[0119] CGMCC NO.11763菌株的耐酸試驗(yàn)
[0120] 取CGMCC N0.11763母液按lml接種菌種于不同pH值(pH梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10mL MRS液體培養(yǎng)基，置于37 °C下分別培養(yǎng)0、2、4h，每一處理3個(gè)重復(fù)。各取lml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1ml稀釋液于MRS中涂布，于37°C生化 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄平板上的菌落個(gè)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō) 明該菌具有很強(qiáng)的耐酸能力。
[0121] 表3耐酸能力檢測(cè)[(土s) X 107cfu/ml]
[0122]
[0123] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力測(cè)定
[0124] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 lOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無(wú)菌的roS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長(zhǎng)600nm處 的吸光值為0.4 ±0.1 (A 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測(cè)定吸光值A(chǔ) 24,自凝集率 (%)公式為(A 0-A 24)/A 0。；他凝集率（％):將CGMCC如.11763和大腸桿菌0耶€[的懸菌 液調(diào)節(jié)成在波長(zhǎng)600nm處的吸光值為0.6±0.1 (A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測(cè)定吸光 值A(chǔ) 24,他凝集率（％ )公式為(A 0 -A 24)/A 0。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,可知CGMCC N0.11763的自 凝集率為95.71 %，有很強(qiáng)的黏附能力。
[0125] 表4黏附能力表
[0126]
[0127] 菌株生理特性
[0128] 所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.11763,保藏地 址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。
[0129] 該菌株特點(diǎn)如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)鞭毛， 不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0130] 理化特征為:過(guò)氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實(shí)驗(yàn)( + )，運(yùn)動(dòng)性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(+ )。經(jīng)過(guò) 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0131] 菌株能夠在57°C下生長(zhǎng)良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0132] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹(shù)，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時(shí)間2015年6月2日。
[0133] 5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
[0134] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC N0.11763-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無(wú)瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0135] (2)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌CGMCC N0.11763的乳酸產(chǎn)量達(dá)到110g/L。這樣 的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0136] (4)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝 酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10 %，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù) 前期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過(guò)程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算發(fā)酵過(guò)程植物乳桿菌CGMCC N0.11763 對(duì)亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，XH對(duì)亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到653mg/ h/L〇
[0137] (5)將對(duì)數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預(yù)處理過(guò)的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行 加工，每12小時(shí)測(cè)定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，XH菌對(duì)亞硝酸 鈉的分解速率為10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于4.8mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0138] 實(shí)施例1
[0139] 復(fù)合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑20份，曲霉混合培養(yǎng)物14份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢桿菌菌粉8份，聚谷氨酸0.6份。
[0140] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0141] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌CGMCC9405 6份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2份。
[0142 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0143 ]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0144] 所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0145] 所述復(fù)合微生物肥的制備方法如下：
[0146] 將植物乳桿菌混合菌劑，曲霉混合培養(yǎng)物，解磷巨大芽抱桿菌菌劑，枯草芽孢桿菌 菌粉，聚谷氨酸按照比例混合均勻，采用肥料造粒機(jī)造粒，粒徑在〇. 5-2_之間，隨后將上述 肥料顆粒與聚谷氨酸進(jìn)行混合，使聚谷氨酸黏附在肥料顆粒表面。
[0147] 采用的菌種如下：
[0148] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0149] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0150] 黑曲霉（Aspergillus niger)Li-2013-03保藏號(hào)為CGMCC Ν0·7927〇
[0151] 泡盛曲霉菌劑的制備方法：
[0152]技術(shù)方案如下：
[0153 ]斜面菌種活化培養(yǎng):將泡盛曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27 °C培養(yǎng)3天。 [0154]固體一級(jí)種子培養(yǎng):挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角 瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0155]固體二級(jí)種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級(jí)種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克 培養(yǎng)基的5000_升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30 °C培養(yǎng)3天即可。
[0156] 固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級(jí)搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤(pán)中混 合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在30°C，濕度85%，每隔10小時(shí)翻料一次，培養(yǎng)時(shí)間6天； 固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù);待培養(yǎng)料長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預(yù)先經(jīng) 高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時(shí)間1小時(shí)。
[0157] 干燥粉碎:發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設(shè)備上進(jìn)行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以 上。
[0158] 培養(yǎng)基組成：固體原料:麩皮80 %，豆餅粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自來(lái)水； 初始pH自然。
[0159] 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法：
[0160] 1.發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0161] (1)-級(jí)種子培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0162] (2)二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0163] (3)三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0164] (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量（V/V) 1: 0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0165] (5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級(jí)種子罐菌種以10%接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級(jí)種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V) 1:0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。
[0166] 培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03 1%，ρΗ6.8。
[0167] 植物乳桿菌劑的制備方法：
[0168] (1)-級(jí)種子培養(yǎng):將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升， 培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0169] (2)二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0170] (3)三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0171] (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以5%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)；
[0172] (5)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級(jí)種子罐菌種以5%接種量接入總?cè)莘e為3噸二級(jí)種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間22小時(shí)。發(fā)酵完畢發(fā)酵 液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好 的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0 3 25份，糊精12份。流 化床干燥，干燥溫度50 °C。
[0173] 培養(yǎng)基組成為:酪蛋白胨1 %，牛肉提取物1 %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸鈉 0.5%,檸檬酸二胺 0.2%, Tween 800.1%，K2HP040.2%，MgS04.7H20 0.02%, MnS04.H20 0.005% ,CaC032% ,瓊脂1.5% ,ρΗ6·8。
[0174] 實(shí)施例2
[0175] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種復(fù)合微生物肥.
[0176] 復(fù)合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑30份，曲霉混合培養(yǎng)物16份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢桿菌菌粉10份，聚谷氨酸0.5份。
[0177] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0178] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 8份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2份。
[0179 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0180]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0181 ]所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0182] 實(shí)施例3
[0183] 基本同實(shí)施例1
[0184] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種復(fù)合微生物肥.
[0185] 復(fù)合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑30份，曲霉混合培養(yǎng)物10份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑3份，枯草芽孢桿菌菌粉5份，聚谷氨酸0.5份。
[0186] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0187] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 3份，植物乳桿菌 CGMCC11763 4份。
[0188] 曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0189] 曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0190] 所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0191] 產(chǎn)品效果實(shí)驗(yàn)
[0192] 試驗(yàn)地的選擇與試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)于2015年在寧夏鹽池縣進(jìn)行。
[0193] 試驗(yàn)田達(dá)到田種植玉米10畝，分別在種植時(shí)使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.4公斤，出苗1 個(gè)月左右通過(guò)鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.2公斤，對(duì)照組使用市場(chǎng)銷(xiāo)售同類(lèi)產(chǎn)品。
[0194] 發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達(dá)到790公斤，對(duì)照組達(dá)到540公斤，作物生長(zhǎng)階段 的灌溉用水量比對(duì)照減少18%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)合微生物肥，重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng) 物10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，聚谷氨酸0.5-1份。2. 如權(quán)利要求1所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑由植物 乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCCl 1763組成。3. 如權(quán)利要求2所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑重量份 數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC94053-8份，植物乳桿菌CGMCCl 17632-4份。4. 如權(quán)利要求1所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉 培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成。5. 如權(quán)利要求4所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組 成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1 -3份，黑曲霉培養(yǎng)物6-8份。6. 如權(quán)利要求1所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述復(fù)合微生物肥重量份數(shù)組成 為:植物乳桿菌混合菌劑20份，曲霉混合培養(yǎng)物14份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢 桿菌菌粉8份，聚谷氨酸0.6份。7. 如權(quán)利要求6所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑由植物 乳桿菌CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCCl 1763組成;植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為:植 物乳桿菌CGMCC94056份，植物乳桿菌CGMCCl 17632份。8. 如權(quán)利要求6所述一種復(fù)合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉 培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉 培養(yǎng)物7份。9. 如權(quán)利要求1所述一種復(fù)合微生物肥的制備方法，如下：將植物乳桿菌混合菌劑，曲 霉混合培養(yǎng)物，解磷巨大芽抱桿菌菌劑，枯草芽孢桿菌菌粉按照比例混合均勻，采用肥料造 粒機(jī)造粒，粒徑在0.5-2mm之間，隨后將上述肥料顆粒與聚谷氨酸進(jìn)行混合，使聚谷氨酸黏 附在肥料顆粒表面。
【文檔編號(hào)】C09K17/14GK105907397SQ201610252130
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】李秉京
【申請(qǐng)人】義烏市錦鈺信息科技有限公司