一種檢測硫化氫的熒光探針及其制備方法與使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為硫化氫熒光探針材料使用的萘 酰亞胺-對疊氮芐醇衍生物及其制備方法與使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫化氫（H2S)是繼一氧化氮（NO)和一氧化碳（CO)之后的人體內(nèi)第三大氣體信號 分子。在生命體內(nèi)，硫化氫參與了細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)和多種信號傳導(dǎo)過程，包括血管舒 張、心肌收縮、神經(jīng)傳遞和胰島素分泌等。而當細胞內(nèi)硫化氫處于非正常水平時將導(dǎo)致一 系列生理疾病，例如阿爾茲海默、肝硬化、胃粘膜損傷、動脈和肺高血壓等（參見B. D. Paul， and S. H. Snyder，H2S signaling through protein sulfhydration and beyond?Nat. Rev. Mol. Cell Biol.，2012, 13:499-507)。因此，有效地檢測或監(jiān)控生物樣品或環(huán)境樣品中的硫 化氫已成為近年來相關(guān)領(lǐng)域的研宄熱點。
[0003] 熒光檢測法由于其優(yōu)秀的檢測靈敏度和選擇性，并能實現(xiàn)對生物樣品的實時、在 線檢測而受到研宄者的廣泛關(guān)注。萘酰亞胺類熒光分子因其具有良好的光穩(wěn)定性、高摩爾 消光系數(shù)和量子產(chǎn)率等獨特優(yōu)點而成為該方法最重要的熒光母體之一，在多種待測分子的 熒光檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。
[0004] 目前已開發(fā)的用于檢測硫化氫的小分子熒光探針主要基于疊氮官能團與硫化氫 之間的特異性化學(xué)反應(yīng)而設(shè)計的。當存在硫化氫的條件下，探針分子中的疊氮基團被硫化 氫還原為氨基，導(dǎo)致探針分子的熒光性質(zhì)發(fā)生變化，從而實現(xiàn)對硫化氫的特異性設(shè)別。
[0005] 然而，已報道的硫化氫探針大多數(shù)是熒光"關(guān)-開"型（參見L.A. Montoya and M. D. Pluth, Selective Turn-on Fluorescent Probes for Imaging Hydrogen Sulfide in Living cells，Chem.Commun.，2012,48 :4767-4769)，易受到檢測環(huán)境，如檢測溫度、探針濃 度等條件的影響；或是探針分子中存在生物易受性基團（參見X. -L. Liu，X. -J. Du，C. -G. Dai, and Q. -H. Song, Ratiometric Two-Photon Fluorescent Probes for Mitochondrial Hydrogen Sulfide in Living Cells，J.Org.Chem.，2014, 79:9481-9489.)，不利于其在復(fù) 雜的生物體內(nèi)進行檢測。因此亟須一種新穎的、具有良好生物穩(wěn)定性的且能實現(xiàn)"比率計 型"檢測的硫化氣X光探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種來自萘酰亞胺和對疊氮芐 醇的用于檢測硫化氫的熒光探針及其制備方法和使用方法。
[0007] 本發(fā)明的核心在于利用4-羥基-1，8-萘酰亞胺構(gòu)筑經(jīng)典的ICT體系，并在4-位 直接引入對疊氮芐基部分，使其更具生物和光學(xué)穩(wěn)定性。當存在硫化氫的條件下，疊氮基被 硫化氫還原為氨基，進而發(fā)生1，6-消除離去對氨基甲苯部分而得到4-羥基-1，8-萘酰亞 胺，通過上述方案，獲得"比率計型"的熒光響應(yīng)，大大提高了檢測的靈敏度。
[0008] 本發(fā)明一種檢測硫化氫的熒光探針，結(jié)構(gòu)式為式（I)或者式（II)，
[0009] 式（I)為萘酰亞胺-對疊氮芐醇衍生物；
[0010]
【主權(quán)項】
1. 一種檢測硫化氫的熒光探針，其特征在于：該熒光探針的結(jié)構(gòu)式為式（I);
式（I)中，n為0?18的原子數(shù)，R為甲基，或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷 基，或iC?中的任何一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測硫化氫的熒光探針，其特征在于：其結(jié)構(gòu)式如式（II)，
〇
3. -種檢測硫化氫的熒光探針的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： 步驟一：在惰性氣氛下，式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反 應(yīng)得到式（IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亞胺；
式（IV)中，n為0?18的原子數(shù)，R為甲基，或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基） 磷基，或中的任何一種； 步驟二：在惰性氣氛下，在金屬鈉的存在下，式（IV)所示化合物在醇中反應(yīng)得到式（V) 所示取代的4-羥基-1，8-萘酰亞胺；
式（V)中，n為0?18的原子數(shù)，R為甲基，或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷 基，或中 ,〇 的任何一種； 步驟三：在惰性氣氛下，在堿存在下，式（V)所示化合物與式（VI)所示對疊氮芐醇反應(yīng) 即得式（I)所示化合物；
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測硫化氫的熒光探針的制備方法；其特征在于： 步驟一中所述式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩爾比可為 1?50:1 ;所述氨基化合物為正丁胺；所述醇可為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或乙 二醇單甲醚；步驟一的反應(yīng)溫度為50?120度；反應(yīng)時間為1?20小時； 步驟二中所述醇為叔丁醇，異丙醇；式（IV)所示4-溴_1，8_萘酰亞胺和所述金屬鈉的 摩爾比可為0. 1?1:1 ;步驟二的反應(yīng)溫度為0?100度；反應(yīng)時間為1?20小時； 步驟三中所述堿與式（VI)所示對疊氮芐醇的摩爾比可為1?10:1，所述堿為有機堿 或無機堿，所述有機堿為三乙胺、吡啶或二異丙基乙基胺，所述無機堿為碳酸鉀、碳酸鈉、氫 氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀；式（V)所示4-羥基-1，8-萘酰亞胺和式（VI)所 示對疊氮芐醇的摩爾比可為1?〇. 1:1 ;步驟三的反應(yīng)溫度為〇?100度；反應(yīng)時間為1? 20小時；步驟三反應(yīng)過程在有機溶劑中進行，所述有機溶劑為乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、二 甲基亞砜或丙酮。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測硫化氫的熒光探針的制備方法；其特征在于： 步驟一中，反應(yīng)溫度為80度；反應(yīng)時間為5小時；，4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨 基化合物的摩爾比為10 :1 ; 步驟二中，反應(yīng)溫度為60度，反應(yīng)時間為8小時，醇為叔丁醇；4-溴-1，8-萘酰亞胺和 金屬鈉的摩爾比為1. 5 :1 ; 步驟三中，反應(yīng)溫度為80度，反應(yīng)時間為10小時，式（V)所示4-羥基-1，8-萘酰亞 胺和式（VI)所示對疊氮芐醇的摩爾比為0.8 :1 ;堿與式（VI)所示對疊氮芐醇的摩爾比為 2.2 :1，有機溶劑為乙腈。
6. -種檢測硫化氫的熒光探針的使用方法；其特征在于： 步驟1 :向不同濃度硫化氫的緩沖溶液中加入相同濃度的式（I)所示化合物，配置至少 3種不同硫化氫含量的含有式（I)所示化合物的標準溶液； 所示緩沖溶液可以是磷酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、HEPES緩沖溶液或硼酸-硼 酸鈉緩沖溶液； 所示標準溶液的pH值為5?11 ; 所示標準溶液中式（I)所示化合物的濃度為InM?1yM; 所示標準溶液中硫化氫的含量為〇.InM?ImM; 步驟2 :分別測定所述標準溶液的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為410nm，以硫化氫濃度為 橫坐標，以1539/1444或I444/1539為縱坐標，建立標準曲線； 1539表示所述標準溶液在波長為539nm處的熒光發(fā)射峰強度值； 1444表示所述標準溶液在波長為444nm處的熒光發(fā)射峰強度值； 步驟3 :向待測樣品中加入式（I)所示化合物，控制其濃度與所述標準溶液中式（I)所 示化合物的濃度相等；測定其在激發(fā)波長為410nm的激發(fā)光下的熒光發(fā)射譜，即可根據(jù)標 準曲線計算得出待測樣品的硫化氫含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測硫化氫的熒光探針及其制備方法與使用方法。本發(fā)明利用4-羥基-1,8-萘酰亞胺構(gòu)筑經(jīng)典的ICT體系，并在4-位直接引入對疊氮芐基部分，使其更具生物和光學(xué)穩(wěn)定性。當存在硫化氫的條件下，疊氮基被硫化氫還原為氨基，進而發(fā)生1,6-消除離去對氨基甲苯部分而得到4-羥基-1,8-萘酰亞胺，本發(fā)明提供的萘酰亞胺類染料的“比率計型”硫化氫探針及其專用檢測試劑盒對硫化氫溶液具有良好的響應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞內(nèi)硫化氫的檢測，具有操作簡便，成本低廉，響應(yīng)靈敏，易于推廣和應(yīng)用等優(yōu)點。
【IPC分類】G01N21-64, C09K11-06, C07D221-14
【公開號】CN104610959
【申請?zhí)枴緾N201510081350
【發(fā)明人】韓益豐, 楊成玉, 陳宇
【申請人】浙江理工大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月15日