考馬斯亮藍(lán)染色法及相關(guān)固定液和染色劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的考馬斯亮藍(lán)染色方法以及相關(guān)的固定液和染色液。所述考馬斯亮藍(lán)染色方法相關(guān)的固定液包含酸和醇，所述醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為V乙酸：V磷酸＝1:1的混合酸；所述考馬斯亮藍(lán)染色方法相關(guān)的染色液包含質(zhì)量體積濃度為0.05％～0.12％的考馬斯亮藍(lán),體積百分含量為5％～20％的醇，體積百分含量為3％～10％的酸，質(zhì)量體積濃度為3％～10％的硫酸銨。所述方法線性關(guān)系更好、質(zhì)譜兼容性更好、膠體不易碎、基本無(wú)背景，并且減少了近一半的試劑用量，降低了染色成本，更加環(huán)保。
【專(zhuān)利說(shuō)明】考馬斯亮藍(lán)染色法及相關(guān)固定液和染色劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及凝膠電泳領(lǐng)域，更具體地涉及在凝膠電泳中使用的考馬斯亮藍(lán)染色的 相關(guān)試劑和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 凝膠電泳技術(shù)，尤其是單向SDS-PAGE凝膠電泳（1-DE )和二維凝膠電泳（2-DE ) 是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中使用范圍最廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。其定量的基礎(chǔ)是利用某種 特定的染料對(duì)膠上的蛋白進(jìn)行染色，然后基于染色強(qiáng)度對(duì)蛋白進(jìn)行定量。因此，基于凝膠 定量的靈敏度、線性范圍以及定量精度均高度依賴(lài)于蛋白染色水平?，F(xiàn)有的染色方法主 要分為4種：有機(jī)染料染色、負(fù)染、銀染以及熒光染料染色。其中，有機(jī)試劑染色以考馬斯 亮藍(lán)染色法（Coomasie brilliant blue，CBB)為代表，其在1963年被首次應(yīng)用到醋酸 纖維素片上的蛋白染色（Fazekas De St.Groth，S.，Webster，R.G.，Datyne;r，A.，Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips [J]. Biochim. Biophys. Actal963, 71，377 - 391 )，隨后 Meyer 等使用甲醇 / 乙酸 /水的溶液配制CBB R250染色液為聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白染色（M. Pink，N. Venna，A. W. Rettenmeier, et al. CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility[J]· Electrophoresis，2010, 31，593-598.)。由于 CBB 染色 法簡(jiǎn)單易用，價(jià)格低廉，且與下游的蛋白質(zhì)譜分析高度兼容，因而，已成為目前使用最廣泛 的染色方法。然而，其主要的問(wèn)題在于染色靈敏度不高，對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)較差。
[0003] 自Groth等第一次使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白染色以來(lái)（Fazekas De St. Groth，S 等人，同上)，已有很多研究為提高其染色靈敏度進(jìn)行了努力（Neuhoff V，Aix)ld N，Taube D，Ehrhard t W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using coomassie brilliant blue G_250and R-250[J]. Electroph oresis1988;9:255 - 62 ； G.Candiano, M. Brusch, L. Musant, et al.Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G_250staining for proteome analysis[J]. Electrophoresis,2004,25,13 27-1333 ;M. Pink 等人，同上；Victoria J. Gauci，Matthew P. Padula，Jens R. Coorssen. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics[J]. proteomics，2003, 90, 96-106)，其中Blue Silver被證明是更加靈敏的染色方法，該研究報(bào) 道其染色靈敏度能達(dá)到lng每蛋白條帶（G. Candiano等人，同上)，但是通過(guò)肉眼判斷的可 見(jiàn)條帶下限在l〇ng左右。而且，該方法染色背景深，脫色時(shí)間較長(zhǎng)，脫色過(guò)程中因?yàn)榫郾?酰胺的伸展而使膠體過(guò)度膨脹，易碎（M. Pink等人，同上)。
[0004] 基于以上分析，本領(lǐng)域中需要可以顯著增加現(xiàn)有的考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度， 用量更少，與質(zhì)譜兼容性更好的考馬斯亮藍(lán)染色法相關(guān)試劑以及使用其進(jìn)行染色的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)環(huán)保的考馬斯亮 藍(lán)凝膠染色方法及其相應(yīng)的凝膠固定液和染色劑，旨在形成新的染色方法，降低染色試劑 消耗，解決脫色困難的問(wèn)題并具有較高的染色靈敏度，具有顯著的經(jīng)濟(jì)環(huán)保特色。
[0006] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于考馬斯亮藍(lán)染色的固定液，所述固定液包含 酸和醇，其中所述醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為乙酸和磷酸體積比為1:1的混合酸。
[0008] 在本發(fā)明的固定液中，所述醇的體積百分濃度可以為30%、31%、32%、33%、34%、35%、 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49% 或 50%，優(yōu)選為 35% ?45%， 最優(yōu)選40%。
[0009] 在本發(fā)明的固定液中，所述混合酸的體積百分濃度可以為8%?12%，優(yōu)選為 9%-11%，最優(yōu)選 10%。
[0010] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種考馬斯亮藍(lán)染色液，所述染色液包含質(zhì)量體積濃 度為0. 05%?0. 12%，優(yōu)選為0. 08%?0. 10%的考馬斯亮藍(lán)，體積百分含量為5%?20%， 優(yōu)選為10%?15%的醇，體積百分含量為3%?10%，優(yōu)選為5%的酸，質(zhì)量體積濃度為3%? 10%，優(yōu)選為5%的硫酸銨；其中所述考馬斯亮藍(lán)包括R250和G250中的至少一種；所述醇包 括甲醇和乙醇中的至少一種；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一種。
[0011] 在本發(fā)明的染色液中，所述醇可以為甲醇和/或乙醇。
[0012] 在本發(fā)明的染色液中，所述酸可以為磷酸。
[0013] 本發(fā)明的染色液可以包含質(zhì)量體積濃度為0. 05%、0. 06%、0. 07%、0. 08%、0. 09%、 0. 10%、0. 11%或0. 12%的考馬斯亮藍(lán)。
[0014] 本發(fā)明的染色液可以包含體積百分含量為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、 14%或15%的醇。
[0015] 本發(fā)明的染色液可以包含體積百分含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的酸。
[0016] 本發(fā)明的染色液可以包含體積百分含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的硫酸 銨。
[0017] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，所述方法包括 將SDS-PAGE凝膠置于根據(jù)第一方面所述的固定液中進(jìn)行固定和/或?qū)DS-PAGE凝膠置于 根據(jù)第二方面所述的染色液進(jìn)行染色，任選地在所述固定和/或所述染色后在ddH 20中進(jìn) 行漂洗。
[0018] 在本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色方法中，所述固定的時(shí)間為30-60min，優(yōu)選地40?50 分鐘，更優(yōu)選地45分鐘。
[0019] 在本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色方法中，所述染色的時(shí)間為8_12h，優(yōu)選地9?llh，更 優(yōu)選地1 Oh。
[0020] 在第四方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的固定液、根據(jù)第二方面所述的染 色液和/或根據(jù)第三方面所述的方法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用。
[0021] 有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明的染色方法對(duì)固定過(guò)程，染色過(guò)程試劑配比進(jìn)行了優(yōu)化，最后僅用蒸餾 水簡(jiǎn)單漂洗即可快速完成脫色；
[0023] (2)本發(fā)明降低了甲醇的體積百分濃度、考馬斯亮藍(lán)的質(zhì)量體積濃度、硫酸銨的使 用量以及磷酸的體積百分濃度，節(jié)約了近一半的染色試劑，更經(jīng)濟(jì)環(huán)保，并且與一般考馬斯 亮藍(lán)染色相比提高了染色靈敏度；
[0024] (3)本發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色法與Blue Silver染色法相比靈敏度相當(dāng)，但性關(guān)系 更好、質(zhì)譜兼容性好、膠體不易碎、基本無(wú)背景，并且減少了近一半的試劑用量，降低了染色 成本，更加環(huán)保，并且無(wú)需脫色，操作簡(jiǎn)便，效率高。
[0025] 附圖簡(jiǎn)述
[0026] 圖1是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組一的染色結(jié)果圖。
[0027] 圖2是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組二的染色結(jié)果圖。
[0028] 圖3是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三的染色結(jié)果圖。
[0029] 圖4是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組四的染色結(jié)果圖。
[0030] 圖5是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一（Blue Silver)的染色結(jié) 果圖。
[0031] 圖6是不同質(zhì)量的牛血清白蛋白BSA按照對(duì)照實(shí)驗(yàn)組二（Meyer Stain)的染色結(jié) 果圖。
[0032] 圖7是BSA含量為1?lOOOng梯度范圍內(nèi)的染色線性關(guān)系圖：其中圖A、B、C、D 分別為實(shí)驗(yàn)組三、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一（Blue Silver)、實(shí)驗(yàn)組四、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組二（Meyer Stain)。
[0033] 圖8是是BSA含量為1?10ng梯度范圍內(nèi)的染色線性關(guān)系圖：其中圖A、B、C、D 分別為實(shí)驗(yàn)組三、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一（Blue Silver)、實(shí)驗(yàn)組四、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組二（Meyer Stain)。
[0034] 圖9是不同染色方法SDS-PAGE中50ng BSA條帶膠內(nèi)酶解MALDI-T0F/T0F分析結(jié) 果圖；其中圖A、B、C、D分別為實(shí)驗(yàn)組三、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一（Blue Silver)、實(shí)驗(yàn)組四、對(duì)照實(shí) 驗(yàn)組二（Meyer Stain)。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖并通過(guò)【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0036] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0037] 實(shí)驗(yàn)組一
[0038] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組一所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優(yōu)選為12%，乙醇體積百分濃度優(yōu)選為50%。具體配制過(guò)程如下：
[0039] 將250mL乙醇、30mL乙酸、30mL磷酸和190mL ddH20混勻即可。
[0040] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組一所用的考馬斯亮藍(lán)染色液含如下組分：質(zhì)量體積濃度為0. 05%的 G-250的水溶液，體積百分含量為20%的乙醇，體積百分含量為10%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為 5%的硫酸銨；各溶液采用ddH20配制。具體配制過(guò)程如下：
[0041] (1)量取58. 8mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mL ddH20中，混勻。
[0042] (2)稱(chēng)取25. 0g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0043] (3)加入0· 25g的G-250于（2)中的混合液。
[0044] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速150rpm，溫度為37°C搖一個(gè)小時(shí)以 上，保證G-250完全溶解。
[0045] (5)把100mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0046] 本發(fā)明提供的利用上述考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色的方法具體包括以下幾個(gè)步 驟：
[0047] (1)將SDS-PAGE凝膠置于固定液中搖30分鐘；
[0048] (2)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0049] (3 )將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫?fù)u動(dòng)，染色8h。
[0050] (4)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中洗掉浮色，基本無(wú)背景。
[0051] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質(zhì)量百分含量為12%聚丙烯酰胺和濃 縮膠為質(zhì)量百分含量為5%聚丙烯酰胺，使用7cm模具配制1mm厚的凝膠。
[0052] 實(shí)驗(yàn)組二
[0053] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組二所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優(yōu)選為8%，甲醇體積百分濃度優(yōu)選為30%。具體配制過(guò)程如下：
[0054] 將150mL甲醇、20mL乙酸、20mL憐酸和310mL ddH20混合在一起即可。
[0055] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組二所用的考馬斯亮藍(lán)染色液含如下組分：質(zhì)量體積濃度為0. 12%的 R-250的水溶液，體積百分含量為5%的甲醇，體積百分含量為3%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為 3%的硫酸銨；各溶液采用ddH 20配制。具體配制過(guò)程如下：
[0056] (1)量取17. 6mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mLddH20中，混勻。
[0057] (2)稱(chēng)取15g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0058] (3)加入0· 6g的R-250于（2)中的混合液。
[0059] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速150rpm，溫度為37°C搖一個(gè)小時(shí)以 上，保證R-250完全溶解。
[0060] (5)把25mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0061] 本發(fā)明提供的利用上述考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色的方法具體包括以下幾個(gè)步 驟：
[0062] (1)將SDS-PAGE凝膠置于固定液中搖60分鐘；
[0063] (2)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至H20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0064] (3)將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫?fù)u動(dòng)，染色12h。
[0065] (4)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中，搖床脫色至條帶清晰明亮，背景干凈。
[0066] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質(zhì)量百分含量為12%聚丙烯酰胺和濃 縮膠為質(zhì)量百分含量為5%聚丙烯酰胺，使用的是7cm模具配制1mm厚的凝膠。
[0067] 實(shí)驗(yàn)組三：
[0068] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優(yōu)選為8%，甲醇體積百分濃度優(yōu)選為35%。具體配制過(guò)程如下：
[0069] 將175mL甲醇、20mL乙酸、20mL磷酸和280mL ddH20混勻即可。
[0070] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三所用的考馬斯亮藍(lán)染色液含如下組分：質(zhì)量體積濃度為0. 08%的 G-250的水溶液，體積百分含量為15%的甲醇，體積百分含量為8%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為 10%的硫酸銨；各溶液采用ddH 20配制。具體配制過(guò)程如下：
[0071] (1)量取47. lmL體積百分含量為85%的磷酸加入200mL ddH20中，混勻。
[0072] (2)稱(chēng)取40g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0073] (3)加入0· 4g的G-250于（2)中的混合液。
[0074] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速150rpm，溫度為37°C搖一個(gè)小時(shí)以 上，保證G-250完全溶解。
[0075] (5)把75mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0076] 本發(fā)明提供的利用上述考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色的方法具體包括以下幾個(gè)步 驟：
[0077] (1)將SDS-PAGE凝膠置于固定液中搖30分鐘；
[0078] (2)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0079] (3)將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫?fù)u動(dòng)，染色8h。
[0080] (4)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中洗掉浮色，基本無(wú)背景。
[0081] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質(zhì)量百分含量為12%聚丙烯酰胺和濃 縮膠為質(zhì)量百分含量為5%聚丙烯酰胺，使用7cm模具配制1mm厚的凝膠。
[0082] 實(shí)驗(yàn)組四
[0083] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組四所用的凝膠固定液含如下組分：凝膠固定液中的混合酸體積百分 濃度優(yōu)選為10%，乙醇體積百分濃度優(yōu)選為40%。具體配制過(guò)程如下：
[0084] 將200mL乙醇、25mL乙酸、25mL磷酸和250mL ddH20混勻即可。
[0085] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組四所用的考馬斯亮藍(lán)染色液含如下組分：質(zhì)量體積濃度為0. 10%的 R-250的水溶液，體積百分含量為10%的甲醇，體積百分含量為5%的磷酸，質(zhì)量體積濃度為 5%的硫酸銨；各溶液采用ddH 20配制。具體配制過(guò)程如下：
[0086] (1)量取29. 4mL體積百分含量為85%的磷酸加入200mLddH20中，混勻。
[0087] (2)稱(chēng)取25g的硫酸銨加入（1)中的混合液，攪拌使硫酸銨溶解完全。
[0088] (3)加入0· 5g的R-250于（2)中的混合液。
[0089] (4)將（3)中所得溶液放到搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速150rpm，溫度為37°C搖一個(gè)小時(shí)以 上，保證R-250完全溶解。
[0090] (5)把50mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻備用。
[0091] 本發(fā)明提供的利用上述考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色的方法具體包括以下幾個(gè)步 驟：
[0092] (1)將SDS-PAGE凝膠置于固定液中搖30分鐘；
[0093] (2)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至H20中漂洗兩次，每次搖15min。
[0094] (3 )將SDS-PAGE凝膠放入上述染色液中，室溫?fù)u動(dòng)，染色8h。
[0095] (4)將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至ddH20中，搖床脫色至條帶清晰明亮，背景干凈。
[0096] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝膠指分離膠為質(zhì)量百分含量為12%聚丙烯酰胺和濃 縮膠為質(zhì)量百分含量為5%聚丙烯酰胺，使用的是7cm模具配制1mm厚的凝膠。
[0097] 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組
[0098] 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一選用了 Blue Silver染色法，染色步驟如下：
[0099] (1)將 SDS-PAGE 凝膠置于染色液（0. 12%CBB G-250、10% 硫酸銨、10% 磷酸、20% 甲 醇水溶液）中染色過(guò)夜；
[0100] (2)染色完成后，SDS-PAGE凝膠用蒸餾水漂洗脫色，直至背景無(wú)顏色即可。
[0101] 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組二選用了經(jīng)典的Meyer Stain染色法，染色步驟如下：
[0102] (1)將SDS-PAGE凝膠置于染色液（0. 1%的R-250,45%的甲醇，10%乙酸）中搖lh ;
[0103] (2)染色完成后，SDS-PAGE凝膠用蒸餾水漂洗一下，轉(zhuǎn)入脫色液（25%乙醇、8%乙 酸）中脫色，每15min更換一次脫色液，直至背景無(wú)顏色即可。
[0104] 其中上述染色過(guò)程中所用甲醇硫酸銨優(yōu)選自生工生物，R-250、G-250等均優(yōu)選自 Amresco〇
[0105] 1、實(shí)驗(yàn)組一至四和對(duì)照組的染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-6所示。
[0106] 其中實(shí)驗(yàn)組一的靈敏度也可達(dá)到10ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當(dāng)，但減 少了 58. 3%的染色試劑G-250和50%的硫酸銨消耗，高于Meyer Stain法靈敏度20ng，并且 所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的條帶，再用蒸 餾水震蕩lh即可完成脫色，整個(gè)過(guò)程凝膠膨脹變化小，有利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。
[0107] 實(shí)驗(yàn)組二的靈敏度可達(dá)到8ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當(dāng)，但減少了 50% 的甲醇、70%的磷酸和70%的硫酸銨消耗，高于Meyer Stain法靈敏度20ng，并且所得的凝 膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的條帶，無(wú)需脫色液即可 完成脫色，整個(gè)過(guò)程凝膠膨脹變化小，有利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。
[0108] 實(shí)驗(yàn)組三的靈敏度可達(dá)到2ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當(dāng)，但減少了 25% 的染色試劑G-250、25%的甲醇、20%的磷酸和20%的硫酸銨消耗，高于Meyer Stain法靈敏 度20ng，并且所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明亮的 條帶，再用蒸餾水震蕩lh即可完成脫色，整個(gè)過(guò)程凝膠膨脹變化小，有利于后續(xù)的質(zhì)譜分 析。
[0109] 實(shí)驗(yàn)組四的靈敏度也可達(dá)到10ng，與Blue Sliver的靈敏度10ng相當(dāng)，但減少了 16. 7%的染色試劑G-250、50%的甲醇、50%的磷酸和50%的硫酸銨消耗，高于Meyer Stain法 靈敏度20ng，并且所得的凝膠背景淺，用蒸餾水旋搖洗掉凝膠表面的浮色即可獲得清晰明 亮的條帶，無(wú)需脫色液即可完成脫色，整個(gè)過(guò)程凝膠膨脹變化小，有利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。
[0110] 其中實(shí)驗(yàn)組一至實(shí)驗(yàn)組四的靈敏度差異不大，約為6ng左右，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一 (Blue Silver)的靈敏度10ng相當(dāng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組二（Meyer Stain)染色法僅能檢 測(cè)到20ng的牛血清蛋白（BSA)。本發(fā)明的靈敏度與Blue Sliver的靈敏度相當(dāng)，比經(jīng)典的 Meyer Stain染色法靈敏度高很多，且本發(fā)明所需試劑少，成本低，產(chǎn)生的廢液量也顯著降 低，更加環(huán)保，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組一相比能降低50%以上的試劑消耗。此外對(duì)照實(shí)驗(yàn)組Meyer Stain和Blue Sliver染色法的脫色時(shí)間較長(zhǎng)，膠體易碎，但實(shí)驗(yàn)組一至四染色后基本無(wú)背 景，用蒸餾水洗掉浮色即可，無(wú)需脫色液即可完成脫色，故整個(gè)過(guò)程凝膠膨脹變化小，膠體 不易碎，更有利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。
[0111] 2、Blue Silver、Meyer Stain染色法與本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三、實(shí)驗(yàn)組四染色法線性關(guān) 系比較
[0112] 雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的經(jīng)典技術(shù)，復(fù)雜的蛋白樣品，經(jīng)過(guò)雙向電泳 分離后，再經(jīng)染色，通過(guò)比較不同蛋白含量和不同樣本中相同蛋白的含量差異，尋找有興趣 的區(qū)域，再結(jié)合質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行鑒定。那么一個(gè)染色方法具備良好的定量線性關(guān)系對(duì)于基于 雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究而言是非常重要，因此考察較寬濃度范圍內(nèi)的蛋白著色情 況及其響應(yīng)的線性關(guān)系是非常必要的，此外，低豐度蛋白（low abundance protein)在細(xì)胞 內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能，代表蛋白質(zhì)組研究的"冰山之尖"，因此考察低濃度蛋白著色 情況及其在較窄濃度范圍內(nèi)響應(yīng)的線性關(guān)系也是非常必要的。故本發(fā)明考察了實(shí)驗(yàn)組三、 實(shí)驗(yàn)組四、Blue Silver和Meyer Stain四種染色方法的線性關(guān)系，分別對(duì)它們的SDS-PAGE 凝膠蛋白條帶光密度值（Vol%)與1?lOOOng范圍的BSA含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，以及 SDS-PAGE凝膠蛋白條帶光密度值（Vol%)與低濃度范圍的BSA(1?10ng)的相關(guān)性進(jìn)行分 析，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。
[0113] 從圖7中可以看出，在BSA含量為1?lOOOng范圍內(nèi)，四種染色方法均有相對(duì)較 好的線性關(guān)系；但從圖8中可以看出，在低含量的BSA (1?10ng)梯度內(nèi)，Meyer Stain、 Blue Silver和實(shí)驗(yàn)組四都不能隨著蛋白量的增加而形成一定的線性關(guān)系，而實(shí)驗(yàn)組三不 僅在1?lOOOng BSA范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且在低含量的BSA (1?10ng)范圍內(nèi)仍保持 較好的線性關(guān)系。從各染色方法低蛋白含量線性關(guān)系圖可以看出，實(shí)驗(yàn)組三具有較寬的定 量線性范圍，因此，CBBG-250在該染色體系中比CBB R-250有更加廣泛的適用性，更加適合 于定量。另外，也表明通過(guò)染色前增加固定過(guò)程，染色液中磷酸、硫酸銨、甲醇的濃度降低對(duì) 定量結(jié)果是有利的。
[0114] 3、Blue Silver、Meyer Stain染色法與本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三、實(shí)驗(yàn)組四染色法質(zhì)譜兼 容性評(píng)估
[0115] 盡管以上評(píng)價(jià)結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組三、實(shí)驗(yàn)組四為靈敏的蛋白染色方法，在一 定范圍內(nèi)定量線性關(guān)系也較好，但是由于不同的染色方法對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜分析有重要影響， 因此評(píng)價(jià)改良方法的質(zhì)譜兼容也非常重要。為了評(píng)價(jià)四種染色方法的質(zhì)譜兼容性情況，我 們將其SDS-PAGE凝膠中250ng和50ng的BSA條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解消化，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析 (見(jiàn)圖3)及鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1 ;圖表結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組三在低蛋白含量時(shí)依然保持了較好的質(zhì) 譜兼容性，能準(zhǔn)確鑒定出BSA，而其它三種方法在低蛋白含量時(shí)不能穩(wěn)定鑒定或不能鑒定出 BSA。該結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組三更有利于后續(xù)質(zhì)譜分析。
[0116] 表1四種染色方法的SDS-PAGE凝膠中BSA條帶MALDI-T0F/T0F鑒定分析情況表
[0117]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于考馬斯亮藍(lán)染色的固定液，其特征在于，所述固定液包含酸和醇，其中所述 醇為甲醇和/或乙醇，所述酸為:V_g=l: 1的混合酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定液，其特征在于，所述醇的體積百分濃度為30%?50%， 優(yōu)選為35%?45%，最優(yōu)選40%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定液，其特征在于，所述混合酸的體積百分濃度為 8%?12%，優(yōu)選為9%-11%，最優(yōu)選10%。
4. 一種考馬斯亮藍(lán)染色液，其特征在于，所述的染色液包含質(zhì)量體積濃度為0. 05%? 0. 12%，優(yōu)選為0. 08%?0. 10%的考馬斯亮藍(lán)，體積百分含量為5%?20%，優(yōu)選為10%?15% 的醇，體積百分含量為3%?10%，優(yōu)選為5%的酸，質(zhì)量體積濃度為3%?10%，優(yōu)選為5%的 硫酸銨；其中所述考馬斯亮藍(lán)包括R250和G250中的至少一種；所述醇包括甲醇和乙醇中 的至少一種；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一種，優(yōu)選的為磷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4中所述的染色液，其特征在于，所述醇為甲醇和/或乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的染色液，其特征在于，所述酸為磷酸。
7. -種考馬斯亮藍(lán)染色方法，其特征在于，所述方法包括將SDS-PAGE凝膠置于根據(jù)權(quán) 利要求1至3中任一項(xiàng)所述的固定液中進(jìn)行固定和/或?qū)DS-PAGE凝膠置于根據(jù)權(quán)利要 求4至6中任一項(xiàng)所述的染色液進(jìn)行染色，任選地在所述固定和/或所述染色后在ddH 20中 進(jìn)行漂洗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于，所述固定的時(shí)間為30?60min，優(yōu)選地 40?50分鐘，更優(yōu)選地45分鐘。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的方法，其特征在于，所述染色的時(shí)間為8h?12h，優(yōu)選 地9?llh，更優(yōu)選地10h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的固定液、根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述 的染色液和/或根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的定性和/ 或定量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C09B67/14GK104266893SQ201410083962
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】饒維橋, 訾金, 肖偉敏, 張繼遠(yuǎn), 饒媛, 林梁 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院