專利名稱：熒光微球標(biāo)記物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光微球標(biāo)記物及其制備方法。
背景技術(shù)：
常用熒光標(biāo)記物如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明-6-G(R-6_G)等，熒光壽命較短，難以克服背景熒光的干擾，因此檢測(cè)靈敏度較低。利用具有長(zhǎng)熒光壽命的稀土絡(luò)合物作為標(biāo)記物，采用時(shí)間分辨檢測(cè)技術(shù)，可以有效克服背景熒光的干擾，可使靈敏度有極大的提高。這種技術(shù)被稱為時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技木，已成為目前生物醫(yī)學(xué)研究和臨床生化檢測(cè)中的常見(jiàn)技術(shù)之一。 常用稀土離子主要有銪、釤、鏑和鋱，它們能與某些特定的配合物形成具有強(qiáng)烈熒光的絡(luò)合物。稀土熒光絡(luò)合物具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)長(zhǎng)熒光壽命。一般熒光絡(luò)合物及背景突光的壽命約為I 10納秒,而稀土突光絡(luò)合物的突光壽命一般為10 1000微秒,兩者相差5 6個(gè)數(shù)量級(jí)。因此采用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)，可以有效克服非特異性的背景熒光的干擾，極大地提高測(cè)量靈敏度。(2)較寬的激發(fā)光譜帶。這有利于增加激發(fā)能，提高標(biāo)記物的比活性。(3)較窄的發(fā)射譜帯。半峰寬小于15納米，有利于提高分辨率。(4)較大的Stokes位移。稀土絡(luò)合物的最大激發(fā)光波長(zhǎng)通常在300 380納米的紫外區(qū)，最大發(fā)射波長(zhǎng)在500納米以上，Stokes位移達(dá)250 350納米，可有效排除各種背景熒光的干擾，增強(qiáng)檢測(cè)的特異性和靈敏度。(5)激發(fā)波長(zhǎng)具有配體的特性，即隨配體的變化而變化，發(fā)射波長(zhǎng)則具有稀土離子的性質(zhì)，即不隨配體的變化而變化。稀土離子或稀土配合物和ニ氧化硅摻雜的發(fā)光材料已有不少報(bào)道，Cannasa(Cannasa. C, etal,Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 676 (Y3) 18. 1-18. 6, 2001)描述了一直用溶膠-凝膠法制備直接摻雜Eu3+的Y203-Si02納米發(fā)光材料。Moran等(C. E. Moranetal,Langmuir2001,17,8376-8379)合成了一直摻入Pr3+和Er3+的硅納米顆粒。程艷玲等(程艷玲等，應(yīng)用化學(xué)2008，25 (10)，1217-1220)以聚こ烯吡咯烷酮作穩(wěn)定劑，將單體苯こ烯通過(guò)超聲輻照分散聚合制得直徑在80nm左右的聚苯こ烯納米微球。CN01133257. 3號(hào)專利公開(kāi)了ー種將ニ氧化硅、高分子單體和部分稀土熒光絡(luò)合物混合，先產(chǎn)生凝膠，再進(jìn)行高分子聚合，可得到塊狀的發(fā)光材料，具有優(yōu)良的力學(xué)性能，可以磨制拋光。但也存在制備方法繁瑣，エ業(yè)化生產(chǎn)難度較大的缺點(diǎn)。CNOl 133258號(hào)專利公開(kāi)了ー種無(wú)溶劑人型高聚物/稀土化合無(wú)納米雜化發(fā)光材料的合成方法，采用Sol-Gel反應(yīng)，將無(wú)機(jī)組分的前驅(qū)體正硅酸こ酷、こ烯基單體和稀土配合物都加入到溶膠體系中，在こ酸的存在下水解縮合，こ酸在此是調(diào)節(jié)PH值又起到增進(jìn)兩相相溶性的目的。攪拌合成為均相溶膠，然后凝膠化。之后利用熱聚合方法引發(fā)單體聚合，從而獲得有機(jī)/無(wú)機(jī)納米雜化發(fā)光材料。該方法同樣存在制備エ藝復(fù)雜的缺點(diǎn)，且不易控制制備得到的納米材料的大小及均一度。CN1631951號(hào)專利公開(kāi)了ー種聚合物中空微球的制備方法,該微球通過(guò)微乳液聚合方法在無(wú)機(jī)材料納米微球的表面化學(xué)鍵接ー層聚合物，形成聚合物/無(wú)機(jī)材料納米復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)微球，然后用強(qiáng)酸刻蝕發(fā)去掉無(wú)機(jī)材料獲得，其尺寸為微米到納米級(jí)。該方法制備得到的微球尺寸較大，不適合應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
現(xiàn)有稀土熒光絡(luò)合物標(biāo)記物，稀土離子主要是Eu3+、Sm3+、Dy3+和Tb3+同一些有機(jī)配合物如β - ニ酮化合物、鄰菲咯啉類化合物、水楊酸類化合物、聯(lián)吡啶類化合物等所形成絡(luò)合物，雖然目前已得到不同程度的應(yīng)用，但是都難以同時(shí)滿足以下要求(I)具有強(qiáng)烈的熒光。(2)穩(wěn)定性好包括熱力學(xué)穩(wěn)定和耐光漂白等。(3)易干與抗體、核酸等生物大分子交聯(lián)，交聯(lián)后能同時(shí)保持標(biāo)記物的高熒光強(qiáng)度和被標(biāo)記物的生物活性。(4)易合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種熒光微球標(biāo)記物，與常規(guī)熒光標(biāo)記物相比，具有更高的熒光強(qiáng)度，更高的穩(wěn)定性，更易于標(biāo)記，且制備簡(jiǎn)單。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供ー種突光微球標(biāo)記物，包括載體，所述載體為由苯こ烯単體聚合而成的微球，所述微球上連接有熒光絡(luò)合物。優(yōu)選的，上述方案中所述熒光絡(luò)合物為稀土熒光絡(luò)合物。優(yōu)選的，上述方案中所述微球化學(xué)鍵合有帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷。優(yōu)選的，上述方案中所述活性基團(tuán)為氨基、羧基或巰基。優(yōu)選的，上述方案中所述的熒光稀土絡(luò)合物是帶有活性基團(tuán)的稀土配體，所述稀土熒光絡(luò)合物通過(guò)化學(xué)鍵合與帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷微球連接。優(yōu)選的，上述方案中所述熒光絡(luò)合物為4，7- ニ氯磺基苯-1，10-菲咯啉-2，9- ニ竣酸_箱、4,4,-雙(1,1,1,2,2,3,3, b氣_4,6,-己_■麗基)氣橫基_鄰-ニ聯(lián)苯_箱、異硫氰酸熒光素、四こ基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明的ー種或者幾種。本發(fā)明另ー技術(shù)方案為提供ー種熒光微球標(biāo)記物的制備方法，包括以下步驟a、制備聚苯こ烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球；b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)。優(yōu)選的，上述方案包括以下步驟a、制備聚苯こ烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球，具體為每IOOmLこ醇溶液中加入25g聚こ烯吡咯烷酮、O. 06g過(guò)硫酸鉀、IOg苯こ烯，所述こ醇溶液中こ醇與水的體積為3:1，將配置好的每IOOmLこ醇溶液溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚苯こ烯納米微球分散液，離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮，加入5μ L氨基硅烷，攪拌反應(yīng) I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集；b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)，具體為將lmg/mL的BCPDA按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中,攪拌15min,離心收集，懸浮于50mmol/L的pH=7. 8磷酸鹽緩沖液中，加入等體積O. lmol/L的EuCl3溶液，避光攪拌反應(yīng)IOmin ;離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5 μ L氨基硅烷，攪拌反應(yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到稀土熒光微球標(biāo)記物。優(yōu)選的，上述方案包括以下步驟a、制備聚苯こ烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球，具體為每IOOmLこ醇溶液中加入25g聚こ烯吡咯烷酮、O. 06g過(guò)硫酸鉀、IOg苯こ烯，所述こ醇溶液中こ醇與水的體積為3:1，將配置好的每IOOmLこ醇溶液溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚苯こ烯納米微球分散液，離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮，加入5μ L氨基硅烷，攪拌反應(yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集；b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)，具體為 將FITC配制成lmg/mL的こ醇溶液，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，攪拌15min，離心收集，離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5 μ L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的FITC熒光微球標(biāo)記物。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的熒光微球標(biāo)記物采用了由苯こ烯単體聚合而成的微球作為載體，制備方法更簡(jiǎn)單，更簡(jiǎn)易。本發(fā)明的微球既可以標(biāo)記稀土熒光絡(luò)合物，又可以標(biāo)記普通熒光物質(zhì)(FITC等)，因此可以制成多種熒光性質(zhì)的微球，可以滿足多重檢測(cè)的需要。本發(fā)明將突光物質(zhì)標(biāo)記于微球的表面，使得該微球包含有多個(gè)突光物質(zhì)，突光強(qiáng)度得到極大提高，顯著減少了外部條件對(duì)熒光的淬滅效應(yīng)，使熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度得到進(jìn)ー步提高。熒光微球的熒光強(qiáng)度高于單個(gè)熒光物質(zhì)，這就避免了標(biāo)記單個(gè)熒光物質(zhì)時(shí)不得不采用多重標(biāo)記的麻煩。其穩(wěn)定性高于常規(guī)熒光物質(zhì)。在其表面引入了活性基團(tuán)，可以與生物大分子進(jìn)行方便的交聯(lián)，合成難度較小，且成本較低。具有常規(guī)熒光標(biāo)記物所不具有的長(zhǎng)熒光壽命，又具常規(guī)熒光物質(zhì)所不具有的高熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性和易標(biāo)記性。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式詳予說(shuō)明。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供ー種熒光微球標(biāo)記物。與常規(guī)熒光物質(zhì)相比，具有更高的熒光強(qiáng)度。更高的穩(wěn)定性，更易于標(biāo)記，且制備簡(jiǎn)單的摻雜有熒光物質(zhì)的微球標(biāo)記物。本發(fā)明的突光微球標(biāo)記物，是ー種標(biāo)記有突光物質(zhì)的微球，其中的突光物質(zhì)是以化學(xué)鍵合的形式摻雜于微球的表面。化學(xué)鍵合是在微球內(nèi)核形成之后進(jìn)行的。微球是由苯こ烯聚合而成，并摻雜有機(jī)硅烷水解產(chǎn)物。本發(fā)明的熒光微球標(biāo)記物，其特點(diǎn)是既能發(fā)出普通熒光物質(zhì)的特征熒光，又能發(fā)出稀土離子的特征熒光。標(biāo)記的熒光物質(zhì)可以是4，7- ニ氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9 ニ羧酸-箱(BCPDA_Eu3+)、4,4,-雙(1,1,1,2,2,3,3, - ヒ氣-4,6,-己ニ酮基)氯磺基-鄰 _ ニ聯(lián)苯-銪(BHHCT-Eu3+)、異硫氰酸熒光素、四こ基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明的ー種或者幾種。本發(fā)明的熒光微球標(biāo)記物，其表面帶有活性基團(tuán)，如氨基、羧基、巰基，這些基團(tuán)是由帶有相應(yīng)基團(tuán)的有機(jī)硅烷引入。這種結(jié)構(gòu)使本發(fā)明的熒光微球標(biāo)記物可以用化學(xué)鍵合的作用將生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、酶等標(biāo)記于熒光微球的表面?？梢宰鳛闃?biāo)記物用于免疫檢測(cè)，核酸探針標(biāo)記等。本發(fā)明具體實(shí)施方法的原理將聚こ烯吡咯烷酮(PVP)、過(guò)硫酸鉀(KPS)、苯こ烯(St)加入到こ醇/水介質(zhì)中溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下聚合反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中維持反應(yīng)溫度為60°c。反應(yīng)一段時(shí)間后得到聚苯こ烯納米微球分散液。利用帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷在ニ氧化硅微球引入活性基團(tuán)，再將熒光物質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵合的形式固定于ニ氧化硅微球的表面，而后在微球表面以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷再次引入活性基團(tuán)。
實(shí)施事例I制備FITC熒光微球標(biāo)記物異硫氰酸熒光素(FITC)是ー種常用熒光素，在波長(zhǎng)為490nm的激發(fā)光作用下，發(fā)出波長(zhǎng)為520nm的熒光，呈現(xiàn)明亮的黃緑色。FITC的水溶性和醇溶性良好，其自身帶有異硫氰酸基，可以與氨基發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。利用苯こ烯制備等材料制備聚苯こ烯納米微球內(nèi)核，以氨基娃燒在微球表面弓I入氨基，可將FITC標(biāo)記于微球表面,制得突光納米微球。(I)制備氨基化納米微球?qū)?5gPVP、0. 06gKPS、IOgSt加入到IOOmLこ醇/水(體積為3:1)介質(zhì)中溶解后置
于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中通循環(huán)水維持的反應(yīng)溫度為60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮?dú)饬魉佟７磻?yīng)一段時(shí)間后得到聚苯こ烯納米微球分散液。離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮,加入5 μ L氨基娃燒,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集。(2)制備稀土熒光納米微球?qū)ITC配制成lmg/mL的こ醇溶液，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min，離心收集，離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5 μ L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的FITC熒光微球標(biāo)記物。實(shí)施事例2制備TRITC熒光微球標(biāo)記物四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)是ー種常用熒光素，在波長(zhǎng)為550nm的激發(fā)光作用下，發(fā)出波長(zhǎng)為620nm的熒光，呈現(xiàn)紅色熒光。TRITC的水溶性和醇溶性良好，其自身帶有異硫氰酸基，可以與氨基發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。利用苯こ烯制備等材料制備聚苯こ烯納米微球內(nèi)核，以氨基娃燒在微球表面引入氨基，可將TRITC標(biāo)記于微球表面,制得突光納米微球。(I)制備氨基化納米微球?qū)?5gPVP、0. 06gKPS、IOgSt加入到IOOmLこ醇/水(體積為3:1)介質(zhì)中溶解后置
于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中通循環(huán)水維持的反應(yīng)溫度為60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮?dú)饬魉?。反?yīng)一段時(shí)間后得到聚苯こ烯納米微球分散液。離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮,加入5 μ L氨基娃燒,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集。(2)制備稀土熒光納米微球?qū)RITC配制成lmg/mL的こ醇溶液，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min，離心收集，離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5 μ L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的TRITC熒光微球標(biāo)記物。實(shí)施事例3制備BHHCT-Eu3+熒光納米微球4，4，-雙(1，1，1，2，2，3，3-七氟-4，6_ 己ニ酮基)氯磺基-鄰-三聯(lián)苯(BHHCT)是ー種三葉型β -ニ酮化合物，可以與Eu3+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下可發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光。BHHCT的水溶性很差，在こ醇中溶解性良好，其自身帶有-SOCl2基團(tuán)，可以與氨基發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。利用苯こ烯制備等材料制備聚苯こ烯納米微球內(nèi)核，以氨基硅烷在微球表面引入氨基，可將BHHCT-Eu3+標(biāo)記于微球表面，制得熒光納米微球。
(I)制備氨基化納米微球?qū)?5gPVP、0. 06gKPS、IOgSt加入到IOOmLこ醇/水(體積為3:1)介質(zhì)中溶解后置
于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中通循環(huán)水維持的反應(yīng)溫度為60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮?dú)饬魉?。反?yīng)一段時(shí)間后得到聚苯こ烯納米微球分散液。離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮,加入5 μ L氨基娃燒,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集。(2)制備稀土熒光納米微球?qū)HHCT配制成lmg/mL,按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min,離心收集,懸浮于50mmol/L pH=7. 8磷酸鹽緩沖液中，加入等體積O. lmol/LEuCl3溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)lOmin。離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5μ L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的稀土熒光微球標(biāo)記物。實(shí)施事例4制備BCPDA-Eu3+熒光納米微球4,7- ニ氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9 ニ羧酸(BCPDA)是ー種帶有羧基的鄰苯菲咯啉化合物，可以與Eu3+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下可發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光。BCPDA的水溶性和醇溶性均良好，其自身帶有-SOCl2基團(tuán)，可以與氨基發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。利用苯こ烯制備等材料制備聚苯こ烯納米微球內(nèi)核，以氨基硅烷在微球表面弓I入氨基，可將BCPDA-Eu3+標(biāo)記于微球表面，制得熒光納米微球。(I)制備氨基化納米微球?qū)?5gPVP、0. 06gKPS、IOgSt加入到IOOmLこ醇/水(體積為3:1)介質(zhì)中溶解后置
于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中通循環(huán)水維持的反應(yīng)溫度為60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮?dú)饬魉佟７磻?yīng)一段時(shí)間后得到聚苯こ烯納米微球分散液。離心搜集聚苯こ烯納米微球，以5mL無(wú)水こ醇懸浮,加入5 μ L氨基娃燒,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集。(2)制備稀土熒光納米微球?qū)CPDA配制成lmg/mL,按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min,離心收集,懸浮于50mmol/L pH=7. 8磷酸鹽緩沖液中，加入等體積O. lmol/L的EuCl3溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)lOmin。
離心收集后懸浮于等體積無(wú)水こ醇溶液中，加入5μ L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小吋，以等體積無(wú)水こ醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的稀土熒光微球標(biāo)記物。本發(fā)明的熒光納米微球(熒光微球標(biāo)記物)。與常規(guī)熒光物質(zhì)相比，具有更高的熒光強(qiáng)度。更高的穩(wěn)定性，更易于標(biāo)記，且制備簡(jiǎn)單的摻雜有熒光物質(zhì)的微球標(biāo)記物。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，包括載體，所述載體為由苯乙烯單體聚合而成的微球，所述微球上連接有熒光絡(luò)合物。
2.如權(quán)利要求I所述的熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，所述熒光絡(luò)合物為稀土熒光絡(luò)合物。
3.如權(quán)利要求2所述的熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，所述微球化學(xué)鍵合有帶有活性基團(tuán)的有機(jī)娃燒。
4.如權(quán)利要求3所述的熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，所述活性基團(tuán)為氨基、羧基或巰基。
5.如權(quán)利要求3所述的熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，所述的熒光稀土絡(luò)合物是帶有活性基團(tuán)的稀土配體，所述稀土熒光絡(luò)合物通過(guò)化學(xué)鍵與帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷的微球連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熒光微球標(biāo)記物，其特征在于，所述熒光絡(luò)合物為4，7-二氯橫基苯 _1，10-菲略琳-2,9- 二竣酸 _ 箱、4,4,-雙(1,1,1,2,2,3,3, —b氣-4,6,-己二麗基)氯磺基-鄰-三聯(lián)苯-銪、異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明中的一種或者幾種。
7.一種熒光微球標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、制備聚苯乙烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球； b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的熒光微球標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、制備聚苯乙烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球，具體為 每IOOmL乙醇溶液中加入25g聚乙烯吡咯烷酮、O. 06g過(guò)硫酸鉀、IOg苯乙烯，所述乙醇溶液中乙醇與水的體積為3:1，將配置好的每IOOmL乙醇溶液溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚苯乙烯納米微球分散液，離心搜集聚苯乙烯納米微球，以5mL無(wú)水乙醇懸浮，加入5μ L氨基娃烷，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，以等體積無(wú)水乙醇洗滌后收集； b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)，具體為 將lmg/mL的BCPDA按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中,攪拌15min,離心收集，懸浮于50mmol/L的pH=7. 8磷酸鹽緩沖液中，加入等體積O. lmol/L的EuCl3溶液，避光攪拌反應(yīng)IOmin ;離心收集后懸浮于等體積無(wú)水乙醇溶液中，加入5μ L氨基硅烷，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，以等體積無(wú)水乙醇洗滌后收集，即得到稀土熒光微球標(biāo)記物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的熒光微球標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、制備聚苯乙烯納米微球，并將其和帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅烷化學(xué)鍵合，形成表面帶有活性基團(tuán)的微球，具體為 每IOOmL乙醇溶液中加入25g聚乙烯吡咯烷酮、O. 06g過(guò)硫酸鉀、IOg苯乙烯，所述乙醇溶液中乙醇與水的體積為3:1，將配置好的每IOOmL乙醇溶液溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮?dú)馀懦w系中的氧氣，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚苯乙烯納米微球分散液，離心搜集聚苯乙烯納米微球，以5mL無(wú)水乙醇懸浮，加入5 ii L氨基硅烷，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，以等體積無(wú)水乙醇洗滌后收集； b、將熒光絡(luò)合物以化學(xué)鍵合摻雜于上述微球中，得到帶有熒光絡(luò)合物的微球，之后再以帶有活性基團(tuán)的有機(jī)硅在微球表面引入活性基團(tuán)，具體為 將FITC配制成lmg/mL的乙醇溶液，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，攪拌15min,離心收集，離心收集后懸浮于等體積無(wú)水乙醇溶液中，加入5 L氨基硅烷，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I小時(shí)，以等體積無(wú)水乙醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的FITC熒光微球標(biāo)記物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光微球標(biāo)記物及其制備方法。目的是提供一種熒光微球標(biāo)記物，與常規(guī)熒光標(biāo)記物相比，具有更高的熒光強(qiáng)度，更高的穩(wěn)定性，更易于標(biāo)記，且制備簡(jiǎn)單。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種熒光微球標(biāo)記物，包括載體，所述載體為由苯乙烯單體聚合而成的微球，所述微球上連接有熒光絡(luò)合物。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的熒光微球標(biāo)記物采用了由苯乙烯單體聚合而成的微球作為載體，制備方法更簡(jiǎn)單，更簡(jiǎn)易。本發(fā)明的微球既可以標(biāo)記稀土熒光絡(luò)合物，又可以標(biāo)記普通熒光物質(zhì)如FITC等，因此可以制成多種熒光性質(zhì)的微球，可以滿足多重檢測(cè)的需要。
文檔編號(hào)C09K11/02GK102676157SQ20121015023
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者何東華, 沈義峰 申請(qǐng)人:泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司