一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架，特別涉及一種靜電紡絲與3D打印技術(shù)相 結(jié)合設(shè)計(jì)的用于模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維支架。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)工作現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、新藥研發(fā)、生物工程等各個 領(lǐng)域，研究和觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的技術(shù)手段已成為生命研究的一種必要的篩 選和預(yù)實(shí)驗(yàn)手段。
[0003] 目前，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)模式包括二維細(xì)胞培養(yǎng)，是在細(xì)胞培養(yǎng)板如2、4、6、12、24、 48、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶、生物反應(yīng)器等中進(jìn)行，細(xì)胞在培養(yǎng)基中以一種二維方式 單層貼壁生長。然而，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在體外二維培養(yǎng)的細(xì)胞的基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué) 都可能與在生物體內(nèi)三維生長的細(xì)胞有差異。
[0004] 近年來，隨著技術(shù)發(fā)展，建立了多種三維方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法，以便能夠充分模擬 生物體內(nèi)環(huán)境，提供適宜細(xì)胞生長的環(huán)境。例如納米纖維支架和多孔支架三維培養(yǎng)（多孔 磷酸鈣支架，聚乳酸支架，聚乳酸和乙交酯共聚物支架，膠原蛋白支架，海藻酸鈉支架等）， 三維水凝膠支架培養(yǎng)（例如中國專利申請CN201110259019. 4)，攪拌式、中空纖維、旋轉(zhuǎn)燒 瓶培養(yǎng)等方法。
[0005] 其中，以靜電紡絲技術(shù)獲取的納米纖維支架因其具有極高的比表面積、高孔隙率 和相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，能夠更好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為種子細(xì)胞 的生長和增殖提供良好的微環(huán)境，因此在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景（例如中 國專利申請 200480004293. 5、CN200710134505. 7、CN200910050507. 7、CN201110397867. 1)。
[0006] 然而，以靜電紡絲技術(shù)制備三維支架材料，由于其是在靜電作用下形成的紡絲膜， 其厚度受到一定的限制，形成的紡絲膜較?。ㄍǔ榧{米或微米級），在細(xì)胞培養(yǎng)時，很難 在不變形的情況下將其放到固定的培養(yǎng)容器中，也不利于后期對紡絲膜上的細(xì)胞進(jìn)行鑒 定，同時操作不當(dāng)也會對紡絲膜造成一定程度上的損害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本實(shí)用新型的目的是提供一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架，能夠模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，且克服現(xiàn)有技術(shù)中三維支架不易操作、剛性差、易受損的缺陷。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的目的，本實(shí)用新型一方面提供了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合 支架，包括支架結(jié)構(gòu)和支撐結(jié)構(gòu)，其中，所述支架結(jié)構(gòu)包括通過靜電紡絲方法制得的納米纖 維膜，所述支撐結(jié)構(gòu)包括中部封閉、兩端分別具有端口一和端口二的空腔結(jié)構(gòu)，所述支架結(jié) 構(gòu)貼合在所述支撐結(jié)構(gòu)端口 一的端面上。
[0009] 優(yōu)選的，所述支架結(jié)構(gòu)為具有三維多孔結(jié)構(gòu)的納米纖維膜。
[0010] 優(yōu)選的，所述納米纖維的直徑為100~1000 nm ;更優(yōu)選為200~600nm。
[0011] 本實(shí)用新型中，所述支架結(jié)構(gòu)的材料選自以下組中的一種或多種：聚己內(nèi)酯、聚 乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙稀、聚對苯二 甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙 烷、聚乙烯吡咯烷酮、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、改性纖維素、明膠、纖維 蛋白、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸、硫酸軟骨素、肝素、瓊脂、葡聚糖、褐藻酸；優(yōu)選為聚己內(nèi) 酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、膠原蛋白中的一種或多種；更優(yōu)選為聚己內(nèi) 酯、聚己內(nèi)酯-膠原蛋白混合物。
[0012] 優(yōu)選的，所述支架結(jié)構(gòu)通過粘接的方式進(jìn)行貼合。更優(yōu)選的，通過醫(yī)用膠黏劑進(jìn)行 貼合。
[0013] 本實(shí)用新型中，所述貼合也可通過超聲或熔融焊接的方式進(jìn)行貼合；所述醫(yī)用膠 黏劑可為非細(xì)胞毒性的聚合物材料，如聚氨酯、天然橡膠、丙烯酸酯、膠原蛋白等，具體可 為，α -氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、骨水泥、芳香族多甲基丙烯酸聚氨酯等本領(lǐng)域常 規(guī)醫(yī)用膠黏劑，本實(shí)用新型對此不作限定。
[0014] 優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)通過3D打印制作。
[0015] 本實(shí)用新型中支撐結(jié)構(gòu)也可通過注塑等方式制作。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，3D打印 技術(shù)（又稱3D快速成型技術(shù)或增材制造技術(shù)）是指在計(jì)算機(jī)控制下，根據(jù)物體的計(jì)算機(jī)輔 助設(shè)計(jì)（CAD)模型或計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT)等數(shù)據(jù)，通過材料的精確3D堆積，快速制造任意 復(fù)雜形狀3D物體的新型數(shù)字化成型技術(shù)。其中，熔融沉積成型（FDM)是采用熱熔噴頭，使 得熔融狀態(tài)的材料按計(jì)算機(jī)控制的路徑擠出、沉積，并凝固成型，經(jīng)過逐層沉積、凝固，最后 除去支撐材料，得到所需的三維產(chǎn)品。該技術(shù)具有成型產(chǎn)品精度高、表面質(zhì)量好、成型機(jī)結(jié) 構(gòu)簡單、無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確、簡便的制作所需形狀和構(gòu)造的支撐結(jié)構(gòu)。
[0016] 優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應(yīng) 器的尺寸。具體的，所述支撐結(jié)構(gòu)可做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔的尺寸，例如2孔板、4孔板、 6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板。
[0017] 優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形，縱截面為正方形、矩形或梯形。
[0018] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面不僅限于圓形，也可為橢圓形、三角 形、方形、矩形、規(guī)則多邊形等，只要其能與培養(yǎng)結(jié)構(gòu)匹配即可。例如，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)室為長方 體時，支撐結(jié)構(gòu)截面為矩形。
[0019] 更優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形，縱截面為梯形，且所述端口一的直徑小 于端口二的直徑。
[0020] 本實(shí)用新型在設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)的形狀和尺寸時，可參考細(xì)胞培養(yǎng)平板孔尺寸。通過 將端口一的直徑設(shè)計(jì)為小于端口二的直徑，一方面，便于在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對常規(guī)的二維培養(yǎng) 和本實(shí)用新型三維培養(yǎng)進(jìn)行平行對比實(shí)驗(yàn)，支撐結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔中更穩(wěn)定、不易滑 落；另一方面，采用該設(shè)計(jì)可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距離，使細(xì)胞更好的形 成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。例如，當(dāng)將復(fù)合支架置于6孔板進(jìn)行試驗(yàn)時，支撐結(jié) 構(gòu)端口二的直徑可按照6孔板尺寸，端口一的直徑按照12孔板尺寸設(shè)計(jì)，此時復(fù)合支架中 用于細(xì)胞培養(yǎng)的納米纖維膜的尺寸也與12孔板尺寸匹配，在進(jìn)行平行對比試驗(yàn)時，二維對 比組采用12孔板即可。同理，置于12孔板時，端口二的直徑按照12孔板尺寸，端口一的直 徑按照24孔板尺寸設(shè)計(jì)；置于24孔板時，端口二的直徑按照24孔板尺寸，端口一的直徑按 照48孔板尺寸；依次類推。以上具體尺寸的說明不用于限制本實(shí)用新型的保護(hù)范圍，僅用 于說明本實(shí)用新型技術(shù)方案的設(shè)計(jì)思路以舉例說明一些優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】。
[0021] 優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)還包括一固定環(huán)，所述固定環(huán)套接在所述端口一外側(cè)。更優(yōu) 選的，所述固定環(huán)為圓環(huán)，所述圓環(huán)內(nèi)壁設(shè)置有柱狀凸起，優(yōu)選的，所述柱狀凸起沿圓環(huán)內(nèi) 壁周向均勾分布。
[0022] 本實(shí)用新型中，在支撐結(jié)構(gòu)上設(shè)置固定環(huán)，該固定環(huán)一方面可用于將納米纖維膜 更好的固定在端面上，使其不脫落；另一方面，可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距 離，使細(xì)胞更好的形成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。
[0023] 優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)端口二包括向外延伸的邊緣，所述邊緣上設(shè)置有凸起，該凸 起的作用是便于抓持和/或移動所述支撐結(jié)構(gòu)，在一個具體的實(shí)施方式凸起可為便于抓持 的把手，可為條狀、柱狀、板狀，可為平整的或凹凸不平的，本實(shí)用新型對其形狀和結(jié)構(gòu)不作 具體限定。
[0024] 本實(shí)用新型中，可將支撐結(jié)構(gòu)端口二的邊緣放置在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔上，采用設(shè)置 在其上的把手方便的移動復(fù)合支架