一類glp?1r/gcgr雙重激動劑在用于降糖和減肥藥物中的運用
【專利摘要】本發(fā)明涉及與糖尿病與肥胖相關(guān)的藥物領(lǐng)域，具體涉及胰高血糖素(Glu)相關(guān)的GLP?1R/GCGR雙重激動劑、其制備方法、以及該類化合物為活性成分的藥物組合物以及它們在制備抗糖尿病與肥胖藥物中應(yīng)用。
【專利說明】
一類GLP-1R/GCGR雙重激動劑在用于降糖和減肥藥物中的 運用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激 動劑制備用于降糖和減肥藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥胖是2型糖尿病、高血脂和高血壓等的重要危險因素。目前全球有三分之一的人 超重或肥胖，預(yù)計到2025年將增加至5億。目前關(guān)于肥胖的治療主要通過手術(shù)治療，有關(guān)肥 胖的治療藥物非常有限。
[0003] 胰高血糖素原基因位于2號染色體長臂，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，在胰腺和 腸道L細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，生成由160個氨基酸組成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖 素原在胰腺和腸道中裂解后轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物不同。PG在腸道中主要裂解為：腸高血糖素 (Glicentin:PGl~69)，腸高血糖素分子繼續(xù)裂解為GRPP(PG1~30)和胃泌酸調(diào)節(jié)素 (0叉71^〇111〇(1111丨11 :?633~69);插入肽-2(1?-2:?6111~123);胰高血糖素樣肽-2(61^-2 : PG126~158);和GLP-1(1~37)-OH(PG72~108)。
[0004] 胰高血糖素 (Glu):含29個氨基酸組成的，胰臟胰島α-細(xì)胞分泌的激素。肽序結(jié)構(gòu) 為:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH。它能激活 GLP-1 受體(GLP-1R)和胰高血糖素受體 (GCGR)，其中對GCGR的激動活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對GLP-1R的激動活性，因此主要表現(xiàn)出GCGR激動 活性，表現(xiàn)出升糖效果，具有很好的減肥作用。
[0005] Glu是一種促進(jìn)分解代謝的激素，作用途徑如下：
[0006] Glu具有很強(qiáng)的促進(jìn)糖原分解和糖異生作用，使血糖明顯升高。胰高血糖素通過 cAMP-PK系統(tǒng)，激活肝細(xì)胞的磷酸化酶，加速糖原分解。加速氨基酸進(jìn)入肝細(xì)胞，并激活糖異 生過程有關(guān)的酶系，糖異生增強(qiáng)，促進(jìn)氨基酸的代謝分解。胰高血糖素還可激活脂肪酶，促 進(jìn)脂肪分解，同時又能加強(qiáng)脂肪酸氧化，使酮體生成增多。胰高血糖素可促進(jìn)胰島素和胰島 生長抑素的分泌。藥理劑量的胰高血糖素可使心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加，心肌收縮增強(qiáng)。表 現(xiàn)出一定的生熱作用，能一定程度降低體重。
[0007] 因此通過對Glu進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，改變兩受體的激活比率，有可能使得激動GLP-1R表 現(xiàn)出降糖作用，很好的克服激活GCGR引起的升糖作用，并協(xié)同發(fā)揮降低體重效果。本發(fā)明基 于Glu，采用丙氨酸、半胱氨酸等定點替換方法，打破傳統(tǒng)，獲得更優(yōu)減肥療效并且具有很好 降糖效果的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及一類胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑。其序列為：
[0009] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：1)；
[0010] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：2)；
[0011] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：3)；
[0012] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：4)；
[0013] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：5)；
[0014] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 6)
[0015] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 7)
[0016] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 8)
[0017] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 9)
[0018] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：10)
[0019] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：11)
[0020] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：12)
[0021 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：13)；
[0022] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)；
[0023] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：15)；
[0024] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)；
[0025] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：17)
[0026] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：18)
[0027] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19)
[0028] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：20)
[0029] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO:21)
[0030] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:22)
[0031] 本發(fā)明的第二個目的是提供了胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽的 制備方法，本發(fā)明采用微波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略高效快速地合成得到胰高 血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽的肽鏈。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0033] 1.微波促進(jìn)固相合成的胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽的肽鏈大 大的提高了偶合反應(yīng)速率，常規(guī)固相合成方法充分偶合一個氨基酸到樹脂上去，往往需要2 小時到20小時不等，甚至更長。而微波促進(jìn)則平均只需要10分鐘左右;常規(guī)固相合成方法脫 Fmoc保護(hù)基，往往需要30分鐘到1小時不等，而微波促進(jìn)則平均只需要5分鐘左右，這極大的 提高了多肽合成的效率，縮短了合成周期。
[0034] 2.微波促進(jìn)固相合成胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽得到肽鏈的 粗品的純度大于60%，較常規(guī)固相合成方法大大提高，這方便了后續(xù)的純化工作。
[0035] 3.微波促進(jìn)固相方法合成GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽，其成本低，由于偶合效率 較高，所需要保護(hù)氨基酸平均只需要2倍過量，較常規(guī)固相合成方法需要4到5倍過量大為降 低。
[0036] 4.微波促進(jìn)固相合成GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽的方法易于實現(xiàn)自動化、大規(guī) ?；?，這使其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0037]因此用本發(fā)明提供的微波促進(jìn)固相合成技術(shù)制備的GLP-1R/GCGR雙重激動劑，收 率高、合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動化生產(chǎn)。制備得到的GLP-1R/ GCGR雙重激動劑，協(xié)同發(fā)揮兩受體的激動作用，克服了天然胰高血糖素可能引起高血糖的 風(fēng)險，表現(xiàn)出更好的減肥和降糖效果。
【具體實施方式】
[0038]在本說明書全文中采用以下縮寫：
[0039] Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基嗎啉；DIEAJ，^-二異丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺； DMS0:二甲亞砜;DCM:二氯甲烷;Fmoc:N-9-芴甲氧羰基;DIC:N，N'_二異丙基碳二亞胺;CDI: N，N'_羰基二咪唑;DMAP:4-二甲氨基吡啶;H0SU:N-羥基琥珀酰亞胺;EDC.HC1:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽;HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-Ν,Ν,Μ，^_四甲基脲六 氟磷酸酯;HBTU:苯并三氮唑-Ν,Ν,Υ-四甲基脲六氟磷酸酯;HCTU: 6-氯苯并三氮唑-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯;Η0ΑΤ: 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑;Η0ΒΤ: 1-羥基-苯并三氮唑； PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷;HPLC:高效液相色譜;ESI-MS:電噴霧 質(zhì)譜;Gly:甘氨酸;Ser:絲氨酸;Ala:丙氨酸;Thr:蘇氨酸;Val:纈氨酸；Ile:異亮氨酸;Leu: 亮氨酸;Tyr:酪氨酸;Phe:苯丙氨酸;Hi s:組氨酸;Pro:脯氨酸;Asp:天門冬氨酸;Met:蛋氨 酸;Glu:谷氨酸;Trp:色氨酸;Lys:賴氨酸;Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺;Gin:谷氨酰胺。 [0040]本發(fā)明是通過下列實施例來進(jìn)行說明的，但這些實施例不做任何限制本發(fā)明的解 釋。
[0041 ] 實施例1
[0042] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO: 1)的微波促進(jìn)固 相合成
[0043] (1)樹脂的溶脹
[0044] 稱取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0 · 4mmol/g)，經(jīng)7mL DCM溶脹 30min，抽濾去DCM，再用lOmL NMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM，NMP 7mL沖洗干凈。
[0045] (2)微波促進(jìn)Fmoc保護(hù)基的脫除
[0046] 將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0.1M Η0ΒΤ的25%哌啶/NMP(V/V)溶液， 在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在50°C以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓 縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液;再加入7mL含0.1M Η0ΒΤ的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微 波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣 冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的樹脂。
[0047] (3)微波促進(jìn)Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide-MBHA Resin的合成
[0048] 將Fmoc-Thr(tBu)-OH(0·04mmo1)，HBTU(0·04mmo1)，Η0ΒΤ(0·04mmo1)和DIPEA (0.08mmol)溶于lOmL NMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)7min，微 波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng) 液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。
[0049] (4)偶合效率的檢測
[0050]用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下 一個偶合循環(huán)。
[0051 ] 茚三酮法:取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5 %茚三酮乙醇、KCN 吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀釋于98ml吡啶中）、80 %苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加熱5分 鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。
[0052] 溴酚蘭法:取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1 %的 溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。
[0053] (5)肽鏈的延長
[0054]按照多肽的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合 微波促進(jìn)反應(yīng)時間5~20min不等。得到連有Cys13-Glu-NH2的樹脂。
[0055] (6)樹脂上多肽的裂解
[0056]將上述得到的連有（SEQ. ID NO: 1)多肽序列的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑 Reagent K( TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/ED T，82 · 5: 5 : 5 : 5: 2 · 5，V/V) 1 OmL，先在0 °C 下振搖 3〇min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液 加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。最終得到Cys 13-GI11NH2粗品 63 · 2mg，收率為94 · 3 %。
[0057]將上述多肽粗品溶于2mL水中，直接進(jìn)制備液相色譜純化，色譜條件為:C18反相柱 (320mmX28mm，5ym);流動相Α:0· 1 %TFA/水(V/V)，流動相Β:0· 1 %TFA/乙腈(V/V);流動相 梯度:流動相B 40%~90%，20min;流速為6mL/min檢測波長為214nm。收集的溶液凍干得 純品3011^。理論相對分子質(zhì)量為3421.7』51-]\^111/2 4〇1111(1[]\1+3!1]3+1141.0，[]\1+4!1]4+ 855.9;calcu[M+3H]3+l 141.6，[M+4H]4+856.4。
[0058] 實施例2~22
[0059] 根據(jù)實施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實施例2~22的胰高血糖素相 關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。
[0060] 實施例2
[0061 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：2)；
[0062] 理論相對分子質(zhì)量為3471 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 158 · 0，[M+4H]4+868 · 6; calcu[M+3H]3+l 158· 2，[M+4H]4+868·9〇
[0063] 實施例3
[0064] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：3)；
[0065] 理論相對分子質(zhì)量為3468 · 6iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 157 · 5，[M+4H]4+868 · 3; calcu[M+3H]3+l 157· 2，[M+4H]4+868·6〇
[0066] 實施例4
[0067] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：4)；
[0068] 理論相對分子質(zhì)量為3495 · 6iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 166 · 2，[M+4H]4+875 · 0; calcu[M+3H]3+l 166· 2，[M+4H]4+874·9〇
[0069] 實施例5
[0070] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：5)；
[0071 ]理論相對分子質(zhì)量為3426 · 5iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 143 · 8，[M+4H]4+858 · 3; calcu[M+3H]3+l 143· 2，[M+4H]4+857 ·6〇
[0072] 實施例6
[0073] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：6)
[0074] 理論相對分子質(zhì)量為3426 · 5iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 144 · 6，[M+4H]4+857 · 6; calcu[M+3H]3+l 143· 2，[M+4H]4+857 ·6〇
[0075] 實施例7
[0076] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:7);
[0077] 理論相對分子質(zhì)量為3513 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 172 · 1，[M+4H]4+879 · 0; calcu[M+3H]3+l 172 · 3，[M+4H]4+879 · 5〇
[0078] 實施例8
[0079] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:8);
[0080] 理論相對分子質(zhì)量為3456 · 6dESI-MS m/z :found[M+3H]3+l 153 · 2，[M+4H]4+865 · 2; calcu[M+3H]3+l 153· 2，[M+4H]4+865 · 2〇
[0081 ] 實施例9
[0082] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:9);
[0083] 理論相對分子質(zhì)量為3469 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 157 · 3，[M+4H]4+867 · 6; calcu[M+3H]3+l 157 · 6，[M+4H]4+868 · 5〇
[0084] 實施例10
[0085] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：10)；
[0086] 理論相對分子質(zhì)量為3437 · 7 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 146 · 4，[M+4H]4+860 · 3; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 4。
[0087] 實施例11
[0088] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ.ID NO：11)；
[0089] 理論相對分子質(zhì)量為3485 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 162 · 6，[M+4H]4+872 · 2; calcu[M+3H]3+l 162·9，[M+4H]4+872·4。
[0090] 實施例12
[0091 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：12)；
[0092] 理論相對分子質(zhì)量為3456 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 153 · 0，[M+4H]4+865 · 1; calcu[M+3H]3+l 153· 2，[M+4H]4+865 · 2〇
[0093] 實施例13
[0094] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：13)；
[0095] 理論相對分子質(zhì)量為3389 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 130 · 6，[M+4H]4+848 · 2; calcu[M+3H]3+l 130 · 9，[M+4H]4+848 · 4〇
[0096] 實施例14
[0097] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)；
[0098] 理論相對分子質(zhì)量為3439 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 147 · 5，[M+4H]4+860 · 8; calcu[M+3H]3+l 147·6，[M+4H]4+860 ·9〇
[0099] 實施例15
[0100] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：15)；
[0101 ]理論相對分子質(zhì)量為3347 · 8 ASI-MS m/z : found[M+3H]3++l 146 · 7，[M+4H]4+860 · 4; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 5 〇
[0102] 實施例16
[0103] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)；
[0104] 理論相對分子質(zhì)量為3396 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 133 · 0，[M+4H]4+850 · 1; calcu[M+3H]3+l 133· 2，[M+4H]4+850 · 2〇
[0105] 實施例17
[0106] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：17)
[0107] 理論相對分子質(zhì)量為3437 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 146 · 6，[M+4H]4+860 · 4; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 5 〇
[0108] 實施例18
[0109] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：18)
[0110] 理論相對分子質(zhì)量為3405 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 136 · 0，[M+4H]4+852 · 3; calcu[M+3H]3+l 136· 2，[M+4H]4+852·4。
[0111] 實施例19
[0112] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19)
[0113] 理論相對分子質(zhì)量為3453 · 8 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 152 · 1，[M+4H]4+864 · 1; calcu[M+3H]3+l 152 · 3，[M+4H]4+864 · 4〇
[0m] 實施例20
[0115] His-Ser-Gln-Gly-Thr-phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：20)
[0116] 理論相對分子質(zhì)量為3444 · 8 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 149 · 2，[M+4H]4+862 · 1; calcu[M+3H]3+l 149· 3，[M+4H]4+862· 2〇
[0117] 實施例21
[0118] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:21)
[0119] 理論相對分子質(zhì)量為3460 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 154 · 5，[M+4H]4+866 · 1; calcu[M+3H]3+l 154 · 6，[M+4H]4+866 · 2〇
[0120] 實施例22
[0121 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:22)
[0122] 理論相對分子質(zhì)量為3530 · 0 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 177 · 4，[M+4H]4+883 · 2; calcu[M+3H]3+l 177 · 6，[M+4H]4+883 · 5〇
[0123] 實施例23
[0124] GLP-1R/GCGR雙重激動劑的GLP-1R和GCGR受體激動活性篩選
[0125] HEK293細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染編碼GLP-1R或GCGR的cDNA，細(xì)胞系表達(dá)并利用Western Blot檢測已構(gòu)建的HEK293細(xì)胞中GLP-1R或GCGR的蛋白水平，以考察是否建立了穩(wěn)定高表達(dá) 細(xì)胞株HEK293。
[0126] 測定化合物的試驗中，提前2h將細(xì)胞種于96孔板中，化合物用DMS0溶解，使用含有 0.1 %牛血清蛋白的培養(yǎng)基稀釋至不同倍數(shù)，加入共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。細(xì)胞孵化20min后，使用 Cisbo公司的ELI SA試劑盒，使用酶標(biāo)儀測定熒光讀數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將熒光讀數(shù)轉(zhuǎn)化為相 應(yīng)的cAMP數(shù)值，使用Graphpad Prism 5.0軟件的非線性回歸計算化合物的EC5Q數(shù)值。
[0127] 如表1所示，得到的絕大部分化合物較原型胰高血糖素相比，對GLP-1R的激動活性 有不同程度的提高，而略降低了GCGR的激動活性。其中SEQ. ID NO: 4和SEQ. ID NO: 16對GLP-1R激動活性提高明顯，分別提高了 7.17和9.68倍。
[0128] 表1 GLP-1R/GCGR雙重激動劑對GLP-1R和GCGR激動活性
[0129]
[0130] 實施例24
[0131 ] GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽的體內(nèi)降血糖活性
[0132]同時給予葡萄糖、受試化合物：10周齡雄性ICR小鼠，隨機(jī)分組，每組6只。只給飲 水，禁食過夜。一組按照小鼠體重每千克腹腔注射18mmo 1的葡萄糖溶液(濃度20 % )和生理 鹽水;其他組按照小鼠體重每千克腹腔注射18mmo 1的葡萄糖溶液和Ιμπιο 1 /L的胰高血糖素 類化合物溶液。在〇，15，30，45，60min用血糖儀測定血糖水平。
[0133] 如表2所示，絕大部分GLP-1R/GCGR雙重激動劑多肽其體內(nèi)降血糖活性明顯提高。 其中SEQ. ID N0:4和SEQ. ID N0:5表現(xiàn)出明顯的降糖活性，很好的克服了Glu的升糖風(fēng)險，與 這些化合物有較好的GLP-1R激動活性，而適度降低了 GCGR激動活性有關(guān)。
[0134]表2胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑降血糖效應(yīng)
[0135]
[0136] n = 6, X±S-*P<0.05,**P<0.01 ,***P<0.001 vs saline as control
[0137] 實施例25
[0138] 胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑長期給藥體內(nèi)控制體重活性
[0139] 雄性清潔級小鼠16_20g，隨機(jī)分組，8只為一組，共8組。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，飼養(yǎng)期間， 皮下給生理鹽水0.25ml，使小鼠適應(yīng)。給藥前一天為第0天，第0天晚上小鼠禁食不禁水，次 日腹腔給藥后，正常給食給水。分別在第3,5,7,9,11和13天繼續(xù)給藥（重復(fù)第1天實驗方 案），測試第14天各組小鼠的空腹體重，考察各組小鼠的平均體重變化。
[0140] 由表3可以看出，由于選取的小鼠是8周齡小鼠還處于生長期，因此所有給藥組小 鼠體重均增加。絕大部分化合物體重增加值緩慢，表現(xiàn)出明顯的控制體重增長，尤其以 SEQ.ID N0:4、SEQ.ID N0:5、SEQ.ID N0:7、SEQ.ID N0:15和SEQ.ID N0:16控制體重最顯著， 明顯優(yōu)于對照Glu和0ΧΜ，該結(jié)果與我們所獲得的化合物具有較好的GLP-1R/GCGR的激動活 性數(shù)據(jù)相一致。
[0141 ]表3胰高血糖素相關(guān)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑的長期給藥體重變化情況
[0142]
[0144] *ρ<0·05，**ρ<0·01 and***p<0.001 compared with respective saline controls；#p<0.05?##p<0.01 and###p<0.001 compared with Glu〇
【主權(quán)項】
1. 一種含有式I結(jié)構(gòu)的GLP-1R/GCGR雙重激動劑，其序列為： His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~Xaa5-Xaa6 _Xaa7_Xaa8_Xaa9_Xaaio_Xaan _Xaai2_Trp_Leu_Met_Asn _Thr_NH2 (式I) Xaai: Ala，Cys 或 Tyr Xaa2: Ala，Cy s 或 Leu Xaa3: Ala，Cy s 或 Asp Xaa4:Cys 或 Ser Xaas: Ala，Cy s 或 Arg Xaa6:Cys 或 Arg Xaa7：Ala?^cCys Xaa8:Gys 或 Gin Xaa9: Ala，Cy s 或 Asp Xaaio: Ala，Cys 或 Phe Xaaii :Ala，Cys 或 Val Xaai2:Cys 或 Gin 在所述SEQ. ID NO: 1 多肽的氨基酸位置Xaai、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、 Xaa9、Xaaio、Xaaii、Xaai2中的1或2個氨基酸取代。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列： His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：1)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：2)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：3)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：4)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：5)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO： 6) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln -Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO： 7) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 8) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO:9) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：10) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：11) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO： 1 2) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-ThT-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ. ID NO：13)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ. ID NO：15)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO:17) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：18) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：20) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：21) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln -Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr_NH2(SEQ· ID NO:22) 〇3. -種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR雙重激動 劑和其藥學(xué)上可接受的鹽。4. 一種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR雙重激動 劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。5. 權(quán)利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR雙重激動劑和其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于 降糖和減肥藥物中的運用。6. 權(quán)利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR雙重激動劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑在 制備用于降糖和減肥藥物中的運用。7. 權(quán)利要求1和2中所述的GLP- 1R/GCGR雙重激動劑的制備方法，包括生物表達(dá)、液相合 成和固相合成制備方法。
【文檔編號】A61P3/10GK106084031SQ201610397275
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610397275.2, CN 106084031 A, CN 106084031A, CN 201610397275, CN-A-106084031, CN106084031 A, CN106084031A, CN201610397275, CN201610397275.2
【發(fā)明人】黃文龍, 錢海, 周潔, 戴雨軒, 孫李丹
【申請人】中國藥科大學(xué)