一種利用精制蛋白粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，公開了一種利用精制蛋白粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，通過金色鏈霉菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過純種培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵生成金霉素，以精制蛋白粉100%替代黃豆餅粉比全用黃豆餅粉放罐化學(xué)效價(jià)提高2.3%，放罐產(chǎn)量較改進(jìn)前提高了1.8%，有效的提高了產(chǎn)量，通過成本核算后得到每罐可降低原料投入成本約540元，效果良好，穩(wěn)定提高了發(fā)酵生產(chǎn)水平，為工業(yè)化生產(chǎn)此類抗生素及科學(xué)研究提供一個(gè)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
【專利說明】
-種利用精制蛋白粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及發(fā)酵生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，特別是一種利用精制蛋白粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金霉素(化lodetra巧Cline,即CTC)是屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素，在醫(yī)療、 畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途。尤其在畜牧業(yè)上是用于飼料藥物添加劑的八大抗生素產(chǎn)品 (金霉素，泰樂星和±霉素等)之一，金霉素 W其抑菌、促生長(zhǎng)、飼料利用率高，在機(jī)體內(nèi)殘留 量低等特點(diǎn)，成為了目前及今后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)在飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長(zhǎng)劑。我國(guó) 金霉素產(chǎn)品已出口到歐洲和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家。近年來，四環(huán)素類抗生素在抗腫瘤、抑制骨吸 收、促進(jìn)骨形成等方面的研究，拓寬了運(yùn)類產(chǎn)品在醫(yī)藥方面的應(yīng)用范圍。在工業(yè)生產(chǎn)中，金 霉素的發(fā)酵水平長(zhǎng)期維持在一定水平(金霉素發(fā)酵效價(jià)常在ISOOOiig ? mL~1左右），因此提 高金霉素的發(fā)酵水平很有必要?？股匕l(fā)酵水平的提高，主要依賴于菌種選育及培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件的優(yōu)化。
[0003] 關(guān)于金霉素的研究多是從影響金霉素發(fā)酵的工藝條件或者代謝調(diào)控方面著手，而 其中鏈霉菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究報(bào)道，僅僅采用單因素法，如研究接種量、種齡、酵母粉、溫 度、抑等對(duì)金霉素發(fā)酵的影響，也有通過物理或化學(xué)誘變選育金霉素高產(chǎn)菌的研究，及通過 原生質(zhì)體誘變金霉素鏈霉菌育種的研究，目前，還沒有專口針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成方面的研 究報(bào)道。
[0004] 金霉素的發(fā)酵生產(chǎn)需要氮源，黃豆餅粉為主要有機(jī)氮源之一，其為細(xì)胞生長(zhǎng)及含 氮代謝物的合成提供氮源，還提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的維生素、氨基酸等。黃豆餅粉在發(fā)酵工 業(yè)中被普遍使用，但是與其它有機(jī)氮源比較，其價(jià)格相對(duì)較高，造成原料成本偏高。因此，在 穩(wěn)定生產(chǎn)的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，需要尋找新的適宜氮源進(jìn)行替換。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用精制蛋白粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，通過外在條 件的控制并調(diào)整培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分來達(dá)到高效生產(chǎn)金霉素的目的，為工業(yè)化生產(chǎn)此類抗生 素及科學(xué)研究提供一個(gè)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了利用精制蛋白粉替代黃 豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，由金色鏈霉菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過純種培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵生成 金霉素，工藝步驟包括了母瓶抱子液制備保存工序、子瓶斜面抱子液制備工序、一級(jí)種子制 備工序和發(fā)酵制備工序： 發(fā)酵制備工序中發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基水溶液中含有:花生餅粉18~22g、精制蛋白粉8 ~12g、玉米淀粉58~62g、氯化鋼1~3g、硫酸錠3~5g、碳酸巧3~5g、酵母粉4~6g、玉米漿6 ~8g、硫酸儀0.1~0.3g、憐酸二氨鐘0.1~0.3g、豆油0.1~0.2g。
[0007] 優(yōu)選的，發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基水溶液中含有:花生餅粉20.Og、精制蛋白粉10.Og、 玉米淀粉60.0g、氯化鋼2.0g、硫酸錠4.0g、碳酸巧4.0g、酵母粉5.0g、玉米漿7.0g、硫酸儀 0.2邑、憐酸二氨鐘0.2邑、豆油0.11邑。
[0008] 其中，精制蛋白粉為棉巧蛋白粉，棉巧蛋白粉制備工藝流程如下： 預(yù)處理:稱取棉巧巧粉洗凈、破碎、通過100目篩后，備用； 堿液浸提:取預(yù)處理過的棉巧巧粉末加入適量蒸饋水，調(diào)節(jié)pH值為10，控制液固比為 12:1，在提取溫度為55~65°C下提取為50~70分鐘； 離屯、分離:對(duì)堿液浸提混合物進(jìn)行離屯、分離，得到提取液經(jīng)濃度95%乙醇洗涂后在pH值 為4.8條件下進(jìn)行酸沉得到固渣，經(jīng)純水洗至中性后冷凍干燥，即得。
[0009] 其中，發(fā)酵制備工序中發(fā)酵生產(chǎn)工藝如下:將培養(yǎng)基滅菌，滅菌完成后溫度降至30 ~35°C時(shí)，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子移入發(fā)酵罐，移種后發(fā)酵生產(chǎn)采取變溫控制，接種后培養(yǎng)溫 度控制在28~34°C，菌絲長(zhǎng)好后降溫至26~32°C，培養(yǎng)壓力控制在0.01~0.04Mpa，發(fā)酵培 養(yǎng)粘度控制在1~35秒，發(fā)酵周期為80~130小時(shí)。
[0010] 其中，母瓶抱子液制備保存工序的步驟為:將待保存的菌種斜面，在無菌條件下用 接種伊將菌種斜面菌層刮下娠散后按照保存需求加入適量甘油水或無菌水，攬拌均勻后用 漏斗過濾，濾下的菌液即為母瓶抱子液，按照要求分裝于不同規(guī)格冷凍管中，標(biāo)識(shí)后置冰箱 保存待用。
[0011] 其中，子瓶斜面抱子液制備工序的步驟為:從母瓶冷凍管1~2支，溶解于2~3ml/ 支無菌水中，攬拌均勻，用玻璃伊沾取抱子液接入子瓶斜面培養(yǎng)基上，接好的斜面標(biāo)識(shí)后放 于溫度31~33°C，濕度40~60%的恒溫室培養(yǎng)4~5天，成熟后同母瓶抱子液制備保存工序中 刮取制備子瓶抱子液置冰箱保藏，且同時(shí)進(jìn)行無菌檢查、活抱子計(jì)數(shù)及隧菌體檢查，合格備 用。
[0012] 其中，一級(jí)種子制備工序的步驟為:在無菌條件下，將合格的40~60mL子瓶抱子液 W火焰法接種到一級(jí)種子罐中，溫度控制在26~33°C，罐壓控制在0.04~0.06Mpa，攬拌轉(zhuǎn) 速在110~14化pm條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間22~28小時(shí)，種子生長(zhǎng)良好可移入發(fā)酵罐。
[0013] 本發(fā)明具有W下有益效果： 1.本發(fā)明通過合理優(yōu)化外在條件的控制并調(diào)整培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分來達(dá)到高效生產(chǎn)金 霉素的目的，通過W精制蛋白粉100%替代黃豆餅粉比全用黃豆餅粉放罐化學(xué)效價(jià)提高 2.3%，放罐產(chǎn)量平均提高144Kg/罐，比改進(jìn)前提高了 1.8%，效果良好，通過成本核算后得到 每罐可降低原料投入成本約540元。
[0014] 2.經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，通過調(diào)整氮源輸入，W精制蛋白粉100% 替代現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)中使用的黃豆餅粉，有效的提高了產(chǎn)量，降低了原料成本，效果良好，穩(wěn) 定提高了發(fā)酵生產(chǎn)水平，為工業(yè)化生產(chǎn)此類抗生素及科學(xué)研究提供一個(gè)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017]實(shí)施例1 如圖1所示，本發(fā)明公開了利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，由金 色鏈霉菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過純種培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵生成金霉素，工藝步驟包括了母瓶抱子液 制備保存工序、子瓶斜面抱子液制備工序、一級(jí)種子制備工序和發(fā)酵制備工序： 母瓶抱子液制備保存工序的步驟為:將待保存的菌種斜面，在無菌條件下用接種伊將 菌種斜面菌層刮下娠散后按照保存需求加入適量甘油水或無菌水，攬拌均勻后用漏斗過 濾，濾下的菌液即為母瓶抱子液，按照要求分裝于不同規(guī)格冷凍管中，標(biāo)識(shí)后置冰箱保存待 用。
[0018]子瓶斜面抱子液制備工序的步驟為:從母瓶冷凍管1~2支，溶解于2~3ml/支無菌 水中，攬拌均勻，用玻璃伊沾取抱子液接入子瓶斜面培養(yǎng)基上，接好的斜面標(biāo)識(shí)后放于溫度 31~33°C，濕度40~60%的恒溫室培養(yǎng)4~5天，成熟后同母瓶抱子液制備保存工序中刮取制 備子瓶抱子液置冰箱保藏，且同時(shí)進(jìn)行無菌檢查、活抱子計(jì)數(shù)及隧菌體檢查，合格備用。 [0019] -級(jí)種子制備工序的步驟為：在無菌條件下，將合格的40~60mL子瓶抱子液W火 焰法接種到一級(jí)種子罐中，溫度控制在26~33°C，罐壓控制在0.04~0.06Mpa，攬拌轉(zhuǎn)速在 110~14化pm條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間22~28小時(shí)，種子生長(zhǎng)良好可移入發(fā)酵罐。
[0020] 發(fā)酵制備工序中發(fā)酵生產(chǎn)工藝如下：將培養(yǎng)基滅菌，滅菌完成后溫度降至30~35 °C時(shí)，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子移入發(fā)酵罐，移種后發(fā)酵生產(chǎn)采取變溫控制，接種后培養(yǎng)溫度控 制在28~34°C，菌絲長(zhǎng)好后降溫至26~32°C，培養(yǎng)壓力控制在0.01~0.04Mpa，發(fā)酵培養(yǎng)粘 度控制在1~35秒，發(fā)酵周期為80~130小時(shí)，發(fā)酵制備工序中發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基水溶液 中含有:花生餅粉18~22g、精制蛋白粉8~12g、玉米淀粉58~62g、氯化鋼1~3g、硫酸錠3~ 5g、碳酸巧3~5g、酵母粉4~6g、玉米漿6~8g、硫酸儀0.1~0.3g、憐酸二氨鐘0.1~0.3g、豆 油0.1~0.2g。
[0021] 其中，精制蛋白粉為棉巧蛋白粉，棉巧蛋白粉制備工藝流程如下： 預(yù)處理:稱取棉巧巧粉洗凈、破碎、通過100目篩后，備用； 堿液浸提:取預(yù)處理過的棉巧巧粉末加入適量蒸饋水，調(diào)節(jié)pH值為10，控制液固比為 12:1，在提取溫度為55~65°C下提取為50~70min; 離屯、分離:對(duì)堿液浸提混合物進(jìn)行離屯、分離，得到提取液經(jīng)濃度95%乙醇洗涂后在pH值 為4.8條件下進(jìn)行酸沉得到固渣，經(jīng)純水洗至中性后冷凍干燥，即得。
[0022] 實(shí)施例2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簽榱蓑?yàn)證不同配比的培養(yǎng)基對(duì)金霉素發(fā)酵生產(chǎn)的影響，本實(shí)施例通過對(duì)比 精制蛋白粉100%代替黃豆餅粉和100%黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵配方，并進(jìn)行相應(yīng)的金霉素效 價(jià)測(cè)定及成本核算。
[0023] 實(shí)驗(yàn)方法:采用實(shí)施例1中的培養(yǎng)方法，將實(shí)施精制蛋白粉100%代替黃豆餅粉的金 霉素發(fā)酵配方組別定義為精致蛋白粉組，將實(shí)施100%黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵配方組別定義 為黃豆餅粉組，在相同條件下改變發(fā)酵制備工序中發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基配比，具體配比如 下： 精制蛋白粉組:花生餅粉20g、精制蛋白粉lOg、玉米淀粉60g、氯化鋼2g、硫酸錠4g、碳酸 巧4g、酵母粉5g、玉米漿7g、硫酸儀0.2g、憐酸二氨鐘0.2g、豆油O.llg。
[0024] 黃豆餅粉組:花生餅粉20g、黃豆餅粉lOg、玉米淀粉60g、氯化鋼2g、硫酸錠4g、碳酸 巧4g、酵母粉5g、玉米漿7g、硫酸儀0.2g、憐酸二氨鐘0.2g、豆油O.llg。
[00巧]連騎結(jié)果：
從上表中可W對(duì)比看出，通過調(diào)堅(jiān)氮源輸入，W精制籃白粉100%音代現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)中 使用的黃豆餅粉，有效的提高了產(chǎn)量，降低了原料成本，效果良好，穩(wěn)定提高了發(fā)酵生產(chǎn)水 平，為工業(yè)化生產(chǎn)此類抗生素及科學(xué)研究提供一個(gè)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
[0026] W上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，由金色鏈霉菌作為出發(fā)菌 株，經(jīng)過純種培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵生成金霉素，工藝步驟包括了母瓶孢子液制備保存工序、子瓶 斜面孢子液制備工序、一級(jí)種子制備工序和發(fā)酵制備工序，其特征在于： 發(fā)酵制備工序中發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基水溶液中含有:花生餅粉18~22g、精制蛋白粉8 ~12g、玉米淀粉58~62g、氯化鈉1~3g、硫酸銨3~5g、碳酸|丐3~5g、酵母粉4~6g、玉米衆(zhòng)6 ~8g、硫酸鎂0.1~0.3g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、豆油0.1~0.2g。2. 如權(quán)利要求1所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征 在于，所述的發(fā)酵罐內(nèi)每升培養(yǎng)基水溶液中含有:花生餅粉20.0g、精制蛋白粉10.0g、玉米 淀粉60.0g、氯化鈉2.0g、硫酸銨4.0g、碳酸|丐4.0g、酵母粉5.0g、玉米楽7.0g、硫酸鎂0.2g、 磷酸二氫鉀〇.2g、豆油O.llg。3. 如權(quán)利要求1或2所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特 征在于:所述的精制蛋白粉為棉籽蛋白粉，所述的棉籽蛋白粉制備工藝流程如下： 預(yù)處理:稱取棉籽柏粉洗凈、破碎、通過100目篩后，備用； 堿液浸提：取預(yù)處理過的棉籽柏粉末加入適量蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為10，控制液固比為 12:1，在提取溫度為55~65°C下提取為50~70分鐘； 離心分離:對(duì)堿液浸提混合物進(jìn)行離心分離，得到提取液經(jīng)濃度95%乙醇洗滌后在pH值 為4.8條件下進(jìn)行酸沉得到固渣，經(jīng)純水洗至中性后冷凍干燥，即得。4. 如權(quán)利要求3所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征 在于:所述的發(fā)酵制備工序中發(fā)酵生產(chǎn)工藝如下:將培養(yǎng)基滅菌，滅菌完成后溫度降至30~ 35 °C時(shí)，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子移入發(fā)酵罐，移種后發(fā)酵生產(chǎn)采取變溫控制，接種后培養(yǎng)溫度 控制在28~34°C，菌絲長(zhǎng)好后降溫至26~32°C，培養(yǎng)壓力控制在0.01~0.04Mpa，發(fā)酵培養(yǎng) 粘度控制在1~35秒，發(fā)酵周期為80~130小時(shí)。5. 如權(quán)利要求1所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征 在于:所述的母瓶孢子液制備保存工序的步驟為:將待保存的菌種斜面，在無菌條件下用接 種鏟將菌種斜面菌層刮下碾散后按照保存需求加入適量甘油水或無菌水，攪拌均勻后用漏 斗過濾，濾下的菌液即為母瓶孢子液，按照要求分裝于不同規(guī)格冷凍管中，標(biāo)識(shí)后置冰箱保 存待用。6. 如權(quán)利要求5所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征 在于:所述的子瓶斜面孢子液制備工序的步驟為:從母瓶冷凍管1~2支，溶解于2~3ml/支 無菌水中，攪拌均勻，用玻璃鏟沾取孢子液接入子瓶斜面培養(yǎng)基上，接好的斜面標(biāo)識(shí)后放于 溫度31~33°C，濕度40~60%的恒溫室培養(yǎng)4~5天，成熟后同母瓶孢子液制備保存工序中刮 取制備子瓶孢子液置冰箱保藏，且同時(shí)進(jìn)行無菌檢查、活孢子計(jì)數(shù)及噬菌體檢查，合格備 用。7. 如權(quán)利要求6所述的利用精制蛋白粉替代黃豆餅粉的金霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征 在于:所述的一級(jí)種子制備工序的步驟為:在無菌條件下，將合格的40~60mL子瓶孢子液以 火焰法接種到一級(jí)種子罐中，溫度控制在26~33°C，罐壓控制在0.04~0.06Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速 在110~140rpm條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間22~28小時(shí)，種子生長(zhǎng)良好可移入發(fā)酵罐。
【文檔編號(hào)】C12R1/49GK106047977SQ201610694105
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月22日
【發(fā)明人】楊占英, 吳新芝, 陳浩然, 向玉華, 朱忠斌
【申請(qǐng)人】浦城正大生化有限公司