一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：A.配制專生產(chǎn)菌絲用的菌絲培養(yǎng)基；B．將菌絲塊或者病健組織移至菌絲培養(yǎng)基中，于27~28℃條件下培養(yǎng)5~15天室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)菌絲；C．配制生產(chǎn)分生孢子用的產(chǎn)孢培養(yǎng)基；D．將生長茂盛的菌絲塊挑至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子；E．收獲分生孢子并致病力檢測。本發(fā)明有效解決了現(xiàn)有技術(shù)存在產(chǎn)孢時間長、產(chǎn)孢量少或不產(chǎn)孢、孢子致病力下降的問題。本發(fā)明的優(yōu)點是：分生孢子產(chǎn)出時間短、量大、純凈、致病力持久，能充分滿足各項試驗研究需要，大幅節(jié)約科研人員的時間。
【專利說明】
一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢領(lǐng)域，特別涉及一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]八角(Illicium verum Hook.f.)又稱大料、大茴香，是南亞熱帶地區(qū)特有的香料經(jīng)濟(jì)樹種，其產(chǎn)品主要是八角和茴油。廣西八角的栽培面積和產(chǎn)量均居全國之首，素有“世界八角之鄉(xiāng)”的美稱。八角炭疽病〔colletotrich coccdes(Wall) Ilughes〕是目前八角林中影響最嚴(yán)重的災(zāi)害性多頻發(fā)真菌性病害，可造成八角葉、枝、果枯斑，引起落葉落果、枝枯，甚至造成整株枯死，顆粒無收。
[0003]鑒于以上所述八角炭疽病對八角林的嚴(yán)重危害，研究該病的防治技術(shù)迫在眉睫且具有重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前，通常使用病原菌有致病力的分生孢子作為抗病品種篩選、發(fā)病規(guī)律研究和藥物篩選等防治技術(shù)研究的研究對象。然而，八角炭疽病分生孢子培養(yǎng)的現(xiàn)有技術(shù)，比如馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)法(PDA)，存在產(chǎn)孢時間長(常要40?50天)的缺陷，并且容易發(fā)生產(chǎn)孢量少或不產(chǎn)孢、孢子致病力下降等問題，導(dǎo)致時常發(fā)生開展試驗研究時需重新回到林地尋找新鮮發(fā)病材料進(jìn)行分離的情況。即便如此也受到人力物力和時宜的諸多限制，嚴(yán)重影響研究工作的開展甚至導(dǎo)致研究無法進(jìn)行。這對攻克八角炭疽病病害，培養(yǎng)優(yōu)良抗病品種，保障八角產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展是極為不利的。因此，如何獲得足量且保持致病力的分生孢子就變成了當(dāng)前八角炭疽病研究工作首要解決的問題和技術(shù)難點。發(fā)明一種能有效促使該病原菌快速產(chǎn)生分生孢子的培養(yǎng)方法，對促進(jìn)八角健康生長和農(nóng)業(yè)健康發(fā)展有著重要的意義，并且具有顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的方法，為該病的防治技術(shù)研究提供足量且能保持致病力的分生孢子，為相關(guān)研究工作奠定良好基礎(chǔ)，并為廣大科研工作人員節(jié)約寶貴的時間。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
A.配制專生產(chǎn)菌絲用的菌絲培養(yǎng)基，所述菌絲培養(yǎng)基為每1000毫升水中加入馬鈴薯18克、葡萄糖或蔗糖10克、硫酸鋅I克、酵母膏2克、玉米粉2.克，瓊脂20克，并且6-BA的濃度為150ppm的混合物；
B.將菌絲塊或者病健組織移至菌絲培養(yǎng)基中，于27?28°C條件下培養(yǎng)5?15天室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)菌絲；
C.配制生產(chǎn)分生孢子用的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基為每500毫升60?80°C的溫水浸泡8?15克八角器官I小時，然后再加入500毫升水、0.6克玉米粉、6克葡萄糖或蔗糖和20克瓊脂的混合物； D.將生長茂盛的菌絲塊挑至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子；
E.收獲分生孢子并致病力檢測。
[0006]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明實施例提供的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法進(jìn)一步包括下列技術(shù)特征的部分或全部:
作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟B中所述的菌絲塊是指在菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的菌絲體，病健組織是指在新鮮發(fā)病的枝葉中按組織分離法挑取的含病斑部位與健康部位的交接組織。
[0007]作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟C中所述八角器官為八角芽、葉和果實中的至少一種。
[0008]作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟C中所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基為每500毫升60?80°C的溫水浸泡8?15克八角器官I?2小時，然后再加入500毫升水、0.6克玉米粉、6克葡萄糖或蔗糖和20克瓊脂的混合物。
[0009]作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，在本發(fā)明的一個實施例中，所述分生孢子為黃褐色的。
[0010]作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，在本發(fā)明的一個實施例中，所述菌絲培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其配制方法均按病理試驗常規(guī)法配制，經(jīng)高壓消毒后使用。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果:與現(xiàn)有方案相比，本發(fā)明提供了一種八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的方法，利用兩種不同配方培養(yǎng)基分別生產(chǎn)菌絲和分生孢子(二級培養(yǎng)法)替代現(xiàn)有技術(shù)PDA—步培養(yǎng)。通過二級培養(yǎng)法所生產(chǎn)目的物效果顯著，分生孢子產(chǎn)出時間短(10天左右)、量大、純凈、致病力持久，能充分滿足各項試驗研究需要，大幅節(jié)約科研人員的時間。
[0012]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下結(jié)合優(yōu)選實施例，詳細(xì)說明如下。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的【具體實施方式】，其作為本說明書的一部分，通過實施例說明本發(fā)明的原理，本發(fā)明的其他方面、特征及其優(yōu)點通過該詳細(xì)說明將會變得一目了然。
[0014]實施例1
A.配制菌絲培養(yǎng)基
用于生產(chǎn)菌絲用的培養(yǎng)基簡稱菌絲培養(yǎng)基，其成分為:馬鈴薯18克、葡萄糖10克、硫酸鋅I克、酵母膏2克、玉米粉2克、6-芐氨基腺嘌呤:150ppm、水1000毫升、瓊脂20克;配法為:先將馬鈴薯去皮，搗碎，加入500毫升水煮沸30分鐘，過濾取液，加足上述材料煮融，裝瓶后置于滅菌壓力鍋中在120°C壓力0.12MPa條件下滅菌消毒備用。
[0015]B.將菌絲塊或者新鮮病健組織移至菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)，擴(kuò)大菌絲量
生長豐茂的菌絲體是大量產(chǎn)出分生孢子的基礎(chǔ)。將熱融的菌絲培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凝后將生長在菌絲培養(yǎng)基中的菌絲塊(大小0.5X0.5cm)移至菌絲培養(yǎng)基中，置于27°C的十旦溫箱內(nèi)培養(yǎng)6天。
[0016]C.配制產(chǎn)孢培養(yǎng)基； 配方是:八角葉9克、玉米粉0.6克，葡萄糖6克，瓊脂20克，水1000毫升。配法:先取500毫升60?80°C溫水浸泡上述八角器官1.5小時，然后再加入500毫升水、玉米粉、葡萄糖和瓊脂，煮融，裝瓶后置于滅菌壓力鍋中在120°C壓力0.12MPa的條件下消毒滅菌備用。
[0017]D.將在菌絲培養(yǎng)基中生長茂盛的菌絲塊挑至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子將在菌絲培養(yǎng)基中生長茂盛菌絲塊(大小IcmX Icm)挑至平放于產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，置于室內(nèi)27.5 °C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0018]E.收獲分生孢子。
[0019]菌絲塊移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后即獲得適合相關(guān)試驗研究用的黃褐色的分生孢子堆。
[0020]結(jié)果表明:致病力檢測接種效果與從林地新鮮組織分離獲得的分生孢子一致。
[0021]實施例2
A.配制菌絲培養(yǎng)基
用于生產(chǎn)菌絲用的培養(yǎng)基簡稱菌絲培養(yǎng)基，其成分為:馬鈴薯18克、葡萄糖10克、硫酸鋅I克、酵母膏2克、玉米粉2克、6-芐氨基腺嘌呤:150ppm、水1000毫升、瓊脂20克;配法為:先將馬鈴薯去皮，搗碎，加入500毫升水煮沸30分鐘，過濾取液，加足上述材料煮融，裝瓶后置于滅菌壓力鍋中在120°C壓力0.12MPa條件下滅菌消毒備用。
[0022]B.將菌絲塊或者新鮮病健組織移至菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)，擴(kuò)大菌絲量
生長豐茂的菌絲體是大量產(chǎn)出分生孢子的基礎(chǔ)。將熱融的菌絲培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凝后將病健組織(從林地中采回的新發(fā)病的的八角枝葉，剪取其病斑部位與健康部位的小塊組織，先在75%的酒精溶液中消毒3~5秒鐘，再轉(zhuǎn)移至0.1%的升汞溶液中消毒3~5分鐘)移至菌絲培養(yǎng)基中，置于28 V的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0023]C.配制產(chǎn)孢培養(yǎng)基；
配方是:八角芽、葉和果實的混合物12克、玉米粉0.6克，葡萄糖6克，瓊脂20克，水1000毫升。配法:先取500毫升60?80 V溫水浸泡上述八角器官1.5小時，然后再加入500毫升水、玉米粉、葡萄糖和瓊脂，煮融，裝瓶后置于滅菌壓力鍋中在120°C壓力0.12MPa的條件下消毒滅菌備用。
[0024]D.將在菌絲培養(yǎng)基中生長茂盛的菌絲塊挑至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子將在菌絲培養(yǎng)基中生長茂盛菌絲塊(大小IcmX Icm)挑至平放于產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，置于室內(nèi)28 °C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0025]E.收獲分生孢子。
[0026]菌絲塊移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后即獲得適合相關(guān)試驗研究用的黃褐色的分生孢子堆。
[0027]結(jié)果表明:致病力檢測接種效果與從林地新鮮組織分離獲得的分生孢子一致。
[0028]所述分生孢子致病力檢測方法為:在有病斑發(fā)生的八角樹上，選取同一方位葉片成熟的枝條，用無菌水將葉片上的污物噴洗干凈，插入裝有無菌水的三角瓶中，葉片自然干后，用經(jīng)酒精滅菌針狀物在每張葉片的中間刺五個梅花狀接種點，用吸管吸濃度為5?5.5 X14個孢子每毫升的分生孢子懸浮液對整個葉片涂液接種，并在針剌點蓋上吸飽1%葡萄水的棉花團(tuán)以利保濕，之后將三角瓶置于溫度在26?32°C的室內(nèi)觀測，每天相隔12小時噴霧無菌水兩次，觀測5?10天。用從林地新鮮組織分離得的分生孢子和無菌水同樣處理作對照；計量各處理的病斑面積;對所生產(chǎn)分生孢子和新鮮組織分離得的分生孢子進(jìn)行致病力差異性分析;差異不明顯，則生產(chǎn)得的分生孢子即可用于相關(guān)試驗研究。
[0029]與現(xiàn)有八角炭疽病原菌產(chǎn)孢方法相比，本發(fā)明根據(jù)生產(chǎn)菌絲和分生孢子不同階段對營養(yǎng)物質(zhì)不同需求的原理，配制兩種不同配方培養(yǎng)基分別生產(chǎn)菌絲和分生孢子，有效地提高了菌絲的生長速度、分生孢子的產(chǎn)出時間和致病力。2013?2016年，單位廣泛應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)分生孢子，并將獲得的分生孢子應(yīng)用于各種接種試驗中，結(jié)果表明:接種效果與從林地新鮮組織分離獲得的分生孢子一致。這充分表明，此技術(shù)實現(xiàn)了在室內(nèi)生產(chǎn)出與自然狀態(tài)性質(zhì)相同的八角炭疽病原菌分生孢子，且此技術(shù)生產(chǎn)分生孢子時間短、純凈、產(chǎn)孢量大，能充分滿足該病害防治研究過程對合格病原菌體的需求。該技術(shù)節(jié)省了科研人員寶貴的時間，提高了工作效率，同時降低了研發(fā)成本，對促進(jìn)有效解決八角炭疽病起到積極的作用。
[0030]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變動，這些改進(jìn)和變動也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: A.配制專生產(chǎn)菌絲用的菌絲培養(yǎng)基，所述菌絲培養(yǎng)基為每1000毫升水中加入馬鈴薯18克、葡萄糖(蔗糖)10克、硫酸鋅I克、酵母膏2克、玉米粉2.克，瓊脂20克，并且6-BA的濃度為150ppm的混合物； B.將菌絲塊或者病健組織移至菌絲培養(yǎng)基中，于27?28°C條件下培養(yǎng)5?15天室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)菌絲； C.配制生產(chǎn)分生孢子用的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基為每500毫升60?80°C的溫水浸泡8?15克八角器官I小時，然后再加入500毫升水、0.6克玉米粉、6克葡萄糖或蔗糖和20克瓊脂的混合物； D.將生長茂盛的菌絲塊挑至產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，室內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)分生孢子； E.收獲分生孢子并致病力檢測。2.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟B中所述的菌絲塊是指在菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的菌絲體，病健組織是指在新鮮發(fā)病的枝葉中按組織分離法挑取的含病斑部位與健康部位的交接組織。3.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述分生孢子為黃褐色的。4.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述菌絲培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其配制方法均按病理試驗常規(guī)法配制，經(jīng)高壓消毒后使用。5.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟C中所述八角器官為八角芽、葉和果實中的至少一種。6.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟C中所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基為每500毫升60?80°C的溫水浸泡8?15克八角器官卜2小時，然后再加入500毫升水、0.6克玉米粉、6克葡萄糖或蔗糖和20克瓊脂的混合物。7.如權(quán)利要求1所述的促使八角炭疽病原菌快速產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述分生孢子致病力檢測方法為:在有病斑發(fā)生的八角樹上，選取同一方位葉片成熟的枝條，用無菌水將葉片上的污物噴洗干凈，插入裝有無菌水的三角瓶中，葉片自然干后，用經(jīng)酒精滅菌針狀物在每張葉片的中間刺五個梅花狀接種點，用吸管吸濃度為5?5.5 X 14個孢子每毫升的分生孢子懸浮液對整個葉片涂液接種，并在針剌點蓋上吸飽1%葡萄水的棉花團(tuán)以利保濕，之后將三角瓶置于溫度在26?32°C的室內(nèi)觀測，每天相隔12小時噴霧無菌水兩次，觀測5?10天，用從林地新鮮組織分離得的分生孢子和無菌水同樣處理作對照;計量各處理的病斑面積;對所生產(chǎn)分生孢子和新鮮組織分離得的分生孢子進(jìn)行致病力差異性分析;差異不明顯，則生產(chǎn)得的分生孢子即可用于相關(guān)試驗研究。
【文檔編號】C12N3/00GK106047787SQ201610432498
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】黃乃秀, 覃世杰, 廖旺姣, 劉瑞新, 鄒東霞, 吳耀軍, 覃梅, 蔣曉萍, 周嬋, 黃華艷, 闕衍文, 常明山
【申請人】廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院