一種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株mhgc424及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424，該菌株的保藏名稱為：假單胞菌MHGC424(Pseudomonas sp.MHGC424)，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為：2009年8月28日，保藏編號為：CCTCC NO：M209188。該菌株具有高效有機物降解能力，能快速有效的去除受有機物污染海水中的有機物，并且對海水養(yǎng)殖生物沒有毒害致病作用。本發(fā)明對去除海水養(yǎng)殖環(huán)境中高濃度有機物污染具有安全、環(huán)保、高效的特點。CCTCC NO：M20918820090828
【專利說明】
-種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株 MHGC424及其在處理有機物污染海水中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，在海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展的同時，養(yǎng)殖"自身污染"問題日益凸現(xiàn)出 來，其中養(yǎng)殖過程產(chǎn)生的有機物污染物常常會引發(fā)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的水體發(fā)臭、沉積環(huán)境惡 化，導(dǎo)致水中溶解氧降低，養(yǎng)殖魚類死亡，水體生態(tài)平衡破壞。
[0003] 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)作為一種高密度、高投巧的人工養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)，影響?zhàn)B殖環(huán)境 最根本的原因在于養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量殘巧、糞便及死亡動植物殘骸等有機物的沉積。 目前的物理和化學(xué)去除有機污染物方法都存有一定的局限性。其中物理方法存在效率低 下，成本高的缺點;化學(xué)方法雖然見效快，但常引起二次污染。為達(dá)到對有機污染物快速、高 效去除，本發(fā)明擬從海水養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中富集分離純化獲得一株微生物，并將其用于對 有機物污染的治理中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株 MHGC424，該菌株具有高效的有機物降解能力，能快速有效地去除海水環(huán)境中的有機物。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供上述用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424 在處理海水中有機污染物中的應(yīng)用。
[0006] 經(jīng)試驗證實，本發(fā)明所述的假單胞菌菌株MHGC424對海水養(yǎng)殖生物沒有毒害致病 作用。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種用于海洋有機物降解的 假單胞菌菌株MHGC424,該菌株的保藏名稱為：假單胞菌MHGC424( Pseudomonas sp .MHGC424)，保臧單位為：中國典型抬養(yǎng)物保臧中屯、，保臧地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保 藏日期為:2009年8月28日，保藏編號為:CCTCC N0:M209188。
[000引本發(fā)明中的用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424的篩選分離鑒定過程 為:取海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖場區(qū)的沉積物，在實驗室利用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分離純化菌株，根據(jù) 菌株對巧料有機物降解能力的強弱，最終篩選出一株對巧料有機物有較強降解能力的菌 株，編號為MHGC424,然后根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征，及其 leSrDNA基因序列經(jīng)與Genbank中已登陸的基因序列進行對比分析發(fā)現(xiàn)，菌株MHGC424經(jīng)鑒 定為假單胞菌屬，命名為假單胞菌MHGC424(Pseudomonas SP.MHGC424)。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述用于海洋有機物降解的 假單胞菌菌株MHGC424在處理海水中有機污染物中的應(yīng)用。
[0010] 在處理有機物污染海水中的具體過程為：取經(jīng)上述分離純化的假單胞菌 (Pseudomonas SP. )MHGC424單菌落，于活化擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-4化，按海水與菌液體積 比為40-60:1，將假單胞菌MHGC424(Pseudomonas SP.MHGC424)接種于含巧料有機物的海水 中，25-28 °C恒溫振蕩培養(yǎng)3-5d。
[0011] 上述活化擴大培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為：蛋白腺5 . Og，酵母膏1. Og，憐酸高鐵0.1 g，陳 海水lOOOmL，抑 7.6-8.2，121°(：滅菌2〇111111。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點:本發(fā)明從海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物中篩選得 到的新菌株，對有機污染物尤其是巧料有機物有較強的降解能力，在l-5d內(nèi)對巧料有機物 的COD去除率達(dá)23.6~40.9%。
【附圖說明】
[0013]圖1是實施例帥菌株MHGC424的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；
[0014] 圖2是實施例3中菌株M服C424的電鏡圖片；
[0015] 圖3是實施例5中投加菌株MHGC424的高濃度巧料有機物海水中的生化耗氧量 (B0D)變化圖；
[0016] 圖4是實施例5中投加菌株MHGC424的高濃度巧料有機物海水中的化學(xué)耗氧量 (COD)變化圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不W任何形式限制本發(fā)明。
[001引實施例1
[0019] 用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424的篩選
[0020] 一、材料準(zhǔn)備
[0021] 1、菌源和實驗廢水
[0022] (1)菌源有20多年養(yǎng)殖歷史的深圳市大鵬澳海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場區(qū)的沉積物。
[0023] (2)實驗廢水（含高濃度巧料有機物海水）：雜魚糜5g，陳海水1000mL，pH7.6~ 8.2，121°(：滅菌2〇111111。
[0024] 2、培養(yǎng)基
[0025] (1)選擇培養(yǎng)基:雜魚糜20g，陳海水lOOOmUpH 7.6~8.2，121°(：滅菌2〇111111。
[0026] (2)分離及斜面培養(yǎng)基：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高鐵O.lg，瓊脂粉20g，陳海水 lOOOmL，地 7.6~8.2。
[0027] (3)活化擴大培養(yǎng)基：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高鐵0.1 g，陳海水lOOOmL，pH 7.6 ~8.2，12rC 滅菌 20min。
[00巧]3、實驗儀器和設(shè)備
[00巧]美國HACH B0D Trak測定儀；
[0030] 廣東海利電磁式空氣壓縮機AC0-00犯；
[0031] 蘇州安泰超凈工作臺SW-CJ-1腳；
[0032] 上海精宏生化培養(yǎng)箱甜P-150;
[0033] 蘇州歐倍振蕩培養(yǎng)箱0BS-2F;
[0034] 德國 HYDR0-BI0S-KIEL 采泥器；
[0035] 日本HIRAYAMA高壓滅菌器HVN-85;
[0036] 日立H-7650透射電子顯微鏡；
[0037] PC818 型 PCR 儀；
[0038] 電泳儀及電泳槽；
[0039] 加熱板及滴定儀；
[0040] 凝膠紫外觀測儀等。
[0041] 二、菌株的分離與篩選
[0042] 1、菌株的富集
[0043] 取大鵬澳海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場沉積物表層W下5cm處的沉積物放入采樣袋，再放 入0°C冰盒中帶回實驗室。取250g沉積物加到化的富集瓶中，加入750mL滅選擇培養(yǎng)基，并加 入適量的纖維棉，在室溫條件下連續(xù)曝氣富集培養(yǎng)2個月，中間據(jù)情況不定期添加滅菌海水 和選擇培養(yǎng)基。
[0044] 2、有機物降解細(xì)菌的分離純化
[0045] 挑選并直接沖洗細(xì)菌附著量較大的纖維棉，得到富集菌液，適當(dāng)稀釋，均勻涂布于 分離培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)3d，待菌落長出后，挑取形態(tài)各異的單菌落，在分離培養(yǎng)基平 板上進行劃線分離，直至得到純的單菌落。將分離純化的細(xì)菌接種至斜面培養(yǎng)基中并于冰 箱4°C保存。
[0046] 3、有機物降解細(xì)菌的篩選
[0047] 通過用B0D及COD值來衡量菌株對巧料有機物的利用能力，W有機物的可生化降解 性(BODs/CODo)來表示5加寸間里細(xì)菌利用巧料有機物的降解能力。
[004引取分離純化得到的菌株于活化擴大培養(yǎng)基中25-28°C培養(yǎng)40-4化，按海水與菌液 體積比40-60:1，接種到含高濃度(5%，質(zhì)量百分含量)巧料有機物的海水中，取不接種菌液 的巧料有機物海水作為空白對照，25-28 °C溫度振蕩培養(yǎng)，反應(yīng)時間l-5d，監(jiān)測巧料有機物 海水的B0D及COD。
[0049] 經(jīng)過篩選獲得一株編號為MHGC424的菌株，即海洋有機物降解菌株MHGC424。
[00加]實施例2
[0051 ] 海洋有機物降解菌株MHGC424的鑒定
[0化2] 1、對海洋有機物降解菌株MHGC424的鑒定
[0化3] 對海洋有機物降解菌株MHGC424進行了生理生化的鑒定W及16S rDNA分子的鑒 定，從分子水平，并結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性分析確定菌株的種屬。
[0化4] 16S rDNA序列分析主要按照W下步驟：
[0055] (1)細(xì)菌核DNA的提?。?br>[0056] 1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于擴大培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5mL菌液于 Eppendorf管內(nèi)，8000巧m室溫離屯、5min，徹底除去上清。
[0057] 2)加 STE(Sodium-Tris-EDTA)緩沖液1.5mL洗涂一次，離屯、棄上清，再加入0.6血TE (化is-EDTA)緩溶液，重懸細(xì)菌。
[0化引 3)加30化lOmg/mL的溶菌酶，37°C水浴45min。
[0059] 4)加6扣L 10 %的SDS(十二烷基橫酸鋼），20mg/mL的蛋白酶K3化，50r水浴化，至 溶液變清。
[0060] 5)加入等體積酪氯仿抽提=次，直至看不到蛋白質(zhì)為止。
[0061 ] 6)在上清液中加入1 /10體積的3M的NaAc (p冊.2)。
[0062] 7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細(xì)絲，再用體積百分含量 為70%的乙醇洗涂一次，自然驚干，并將DNA溶于10化L TE溶液中。
[0063] 8)加入終濃度為50yg/mL的化ase(RNA酶），37°C，30min，去除RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0064] (2)168 rDNA基因的PCR擴增
[00化]P1(上游引物）：27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')
[0066] P2(下游引物）：1492R(5'-AAG TCG TAA CAA GGT AAC C-3')
[0067] 在50化的反應(yīng)體積中，加入化L模板DNA(0. lug)，0.5化P巧日P2(終濃度為0.5咖），1 化dNTP(每種NTP0.2mM)，0.扣LTaq聚合酶(2U)和扣L10 XPCR緩沖液。PCR擴增條件為:94°C 預(yù)變性5min，在94°C變性30s，61-65°C退火30s，72°C延伸Imin，循環(huán)30次;最后72°C終延伸 10min〇
[0068] (3)PCR產(chǎn)物的回收
[0069] 將PCR產(chǎn)物W1%瓊脂糖凝膠(質(zhì)量百分比)進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收 片段的凝膠，放入1.5mL離屯、管中力日2倍體積TE，65°C水浴lOmin后加等體積水飽和酪抽提一 次離屯、后取上層水相再用酪-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸 錠和2倍體積無水乙醇沉淀，離屯、，用體積百分含量為70%的乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于 適量滅菌雙蒸水。
[0070] (4)168 rDNA的部分序列測定和分析
[0071] P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；
[00。] P-r:GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
[0073] 加入化L模板DNA(<0.化g)，PCR擴增30個循環(huán)（94°Clmin，55°C30s，72°C2min)。采 用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem373A DNA測 序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子 水平上確定該菌的種屬。
[0074] 2、16S rDNA序列測定
[0075] 本發(fā)明采用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進行分子水平的鑒定。W細(xì) 菌的核DNA為模板，W16S rDNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度 為1498bp的擴增帶用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序 列。
[0076] 0077 * 0079 0080 0081 12345
2
[007引實施例3 3 海洋有機物降解菌株MHGC424菌落形態(tài)、生理和生化特征 4 海洋有機物降解菌株MHGC424菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1;細(xì)胞形態(tài)見圖2。 5 表1海洋有機物降解菌株MHGC424的菌落形態(tài)特征W及主要的生理生化特征
[0090] 海洋有機物降解菌株MHGC424的應(yīng)用
[0091] 應(yīng)用實例一：
[0092] 取實施例1中經(jīng)分離純化的假單胞菌屬(Pseudomonas sp. )MHGC424單菌落，于活 化擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-48h，按海水與菌液體積比為40-60:1，接種到含巧料有機物的海水 中，設(shè)空白對照，攬拌子攬拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-28°C，連續(xù)監(jiān)測巧料有機物海水的B0D(生化 耗氧量），反應(yīng)2-7d。
[0093] 從圖3可W看出，接種假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MHGC424菌株的巧料有機物 海水中的B0D隨時間逐漸增大，4-7d維持穩(wěn)定。假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MHGC424菌株 在4-7d對有機物有較強的降解能力。
[0094] 應(yīng)用實例二：
[00巧]取實施例1中經(jīng)分離純化的假單胞菌屬(Pseudomonas sp. )MHGC424單菌落，于活 化擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-48h，按海水與菌液體積比為40-60:1，接種到含巧料有機物的海水 中，設(shè)空白對照，攬拌子攬拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-28°C，連續(xù)監(jiān)測巧料有機物海水中的COD(化 學(xué)耗氧量），反應(yīng)l-5d。
[0096] 從圖4可W看出，接種假單胞菌屬(Pseudomonas sp. )MHGC424菌株的巧料有機物 海水中的COD隨時間逐漸減少，直至第4d降為最低，海水中的COD去除率為40.9%。假單胞菌 屬(Pseudomonas sp. )MHGC424菌株能迅速有效地降低巧料有機物海水中的COD。
[0097] 應(yīng)用實例
[009引取實施例1中經(jīng)分離純化的假單胞菌(Pseudomonas sp. )MHGC424單菌落，于活化 擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-4化，按海水與菌液體積比為40-60:1，接種到裝有化過濾海水的玻璃 圓缸中，并W不加菌液的過濾海水為對照，分別放養(yǎng)有40尾體長約1cm的班節(jié)對郵(Penaeus monodon)郵苗和20尾體長約3cm的黑觸（Sparus macrocephalus)仔魚，各分3個平行實驗 組，水溫25-28 °C，9化后，經(jīng)統(tǒng)計分析郵苗存活率在75 %~85.5 %，仔魚存活率在在75 %~ 85.5%，存活率在實驗組與對照組的之間無顯著差異?？梢?，假單胞菌(Pseudomonas sp.) MHGC424對海水養(yǎng)殖生物沒有毒害致病作用。
[0099]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424,其特征是：該菌株的保藏名稱 為:假單胞菌MHGC424(Pseudomonas sp.MHGC424)，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為：2009年8月28日，保藏編號為：CCTCC NO: M209188。2. 權(quán)利要求1所述的用于海洋有機物降解的假單胞菌菌株MHGC424在處理海水中有機 污染物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C02F3/34GK106047765SQ201610596713
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610596713.8, CN 106047765 A, CN 106047765A, CN 201610596713, CN-A-106047765, CN106047765 A, CN106047765A, CN201610596713, CN201610596713.8
【發(fā)明人】古小莉, 黃洪輝, 孟霞
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所