苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽和藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽和藥物組合物。所述苯丙素類化合物結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，所述藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)如式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示。所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽具有抑制細(xì)胞炎癥因子NO的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF?α,IL?1β,IL?6的表達(dá)作用，具有對(duì)羥基自由基的(?OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活性，在制備治療與上述因子相關(guān)疾病，例如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽和藥物組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接 受的鹽和藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 從天然藥物中提取分離得到的成分結(jié)構(gòu)多樣、活性顯著，對(duì)其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu) 修飾、改造和全合成，一直是新藥研發(fā)的一個(gè)主要思路。
[0003] TNF-α:是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄 今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常嚴(yán) 重。
[0004] IL-Ιβ:在局部低濃度時(shí)協(xié)同刺激APC和T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，進(jìn) 行免疫調(diào)節(jié)。大量產(chǎn)生時(shí)有內(nèi)分泌效應(yīng):誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成，引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。
[0005] IL-6:人類IL-6基因位于第7號(hào)染色體上；IL-6分子量在21~30KD之間。主要由單 核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗 體;刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化;刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng);促進(jìn)血細(xì)胞發(fā) 育。
[0006] IL-6可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核一巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。IL-6作用的靶細(xì)胞很多，包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T細(xì) 胞、活化的B細(xì)胞和漿細(xì)胞等;其生物效應(yīng)也十分復(fù)雜。
[0007] 0H為生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧物質(zhì)，能導(dǎo)致細(xì)胞及生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)氧化損傷。
[0008] 巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，其中，N0為重要的細(xì)胞炎癥因子，N0 參與多種生理病理過程，過量NO會(huì)促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，并且還能誘導(dǎo)其他炎癥 因子。
[0009] 因此，尋求新的化合物，以抑制細(xì)胞炎癥因子N0的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-α， IL-Ιβ，IL-6的表達(dá)作用，抑制羥基自由基(-OH)的活性，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，是非常 有必要的。
[0010] 千斤拔藥材為豆科(Leguminosae)千斤拔屬(Flemingl .Roxb.或Moghania)植物大 葉千斤拔(]/[0811311丨31]^(31'(^117113(￥；[11(1.)0.1(111^26)的干燥根，在我國主要分布于東南部 地區(qū)。該植物在中國植物志（1995，41: 313)、中國臺(tái)灣植物志（1977，3 : 258)、海南植物志 (1965,2:311)、《中國高等植物圖鑒》（1972,2:510)、中國主要植物圖說（1955，？?707)和廣 州植物志（1956，pp361)中均有收錄。千斤拔藥材為廣西地區(qū)的道地藥材，史載于《植物名實(shí) 圖考》，有著廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。其性味甘，微澀，平，具有清熱除濕等功效，主要用于治療 風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、慢性腎炎、痛經(jīng)和白帶多等婦科疾病。該藥材目前已收載入2005年版 《中國藥典》附錄。
[0011]大葉千斤拔已報(bào)道的成分主要有黃酮類、留類、萜類、蒽醌類、揮發(fā)油類成分，均具 有一定的藥理活性，其藥理活性多樣，報(bào)道較多的有神經(jīng)保護(hù)作用，抗炎、抗氧化作用，對(duì)病 原微生物的驅(qū)蟲作用、類激素作用、細(xì)胞毒作用，抗菌作用以及免疫增強(qiáng)作用、抗疲勞作用。
[0012] 千斤拔目前廣泛應(yīng)用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)，如婦科千金片、婦科 千金膠囊、金雞沖劑、金雞膠囊等，此類中成藥主要用于婦科病(痛經(jīng)、子宮寒冷不孕、子宮 下垂、盆腔炎、乳腺炎、白帶多、產(chǎn)后血虛、關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰膝痛、缺乳和乳瘡等），虛弱貧血 (婦女貧血，氣血虛弱和病后氣虛等）。近年來，臨床報(bào)道較多的是婦科千金片在治療婦科炎 癥方面的作用。
[0013] 目前，在千斤拔的文獻(xiàn)中，報(bào)道苯丙素類化合物的文獻(xiàn)極少，尋找有效的苯丙素類 新化合物，對(duì)其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)修飾和合成，開發(fā)新藥，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，意義 重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的 鹽。
[0015] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供所述苯丙素類化合物和/或藥學(xué)上可接受的 鹽的藥物組合物。
[0016] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0017] 提供一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu) 式如式(I)所示，所述藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)如式（Π )或式(m)所示：
[0019] 其中，R為無機(jī)酸，辦或辦或辦為磺酸根、堿金屬離子或銨根中的任意一種或任意兩 種或任意三種。
[0020] 優(yōu)選地，所述無機(jī)酸為鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸或乳 酸;所述磺酸根為具有芳基的磺酸根;所述堿金屬離子為鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子或 鋰離子。
[0021 ]優(yōu)選地，所述具有芳基的磺酸根為苯磺酸根或?qū)妆交撬岣?br>[0022] 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為銨鹽。
[0023] 本發(fā)明同時(shí)提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有上述式（I)所示苯丙素類 化合物和/或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0024] 優(yōu)選地，所述藥物組合物含有上述式（I)所示苯丙素類化合物和/或其藥學(xué)上可接 受的鹽、以及藥學(xué)上允許的輔料和/或載體。
[0025] 優(yōu)選地，所述藥物組合物含有上述式（I)所示苯丙素類化合物和/或其藥學(xué)上可接 受的鹽、以及其他藥性成分。
[0026] 優(yōu)選地，所述藥物組合物還含有金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨 參中的一種或幾種。
[0027] 優(yōu)選地，所述藥物組合物還含有金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨 參中的一種或幾種的提取物。
[0028] 所述提取物為按專利公告號(hào) CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、 〇附296071(：、0附321631(：、0附296072(：、0價(jià)296073(：的任意一件或幾件專利文件中所述的提 取方法制備得到。
[0029] 所述藥物組合物的劑型可以為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、 糖漿劑、注射劑、軟膏劑、栓劑或噴霧劑，以及其他現(xiàn)有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)的劑型。
[0030] 所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽具有抑制細(xì)胞炎癥因子N0的含量，抑 制細(xì)胞炎癥因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6的表達(dá)作用，具有對(duì)羥基自由基的(-OH)的抑制作用，進(jìn) 而具有抗炎及抗氧化活性，可應(yīng)用于制備治療炎癥性疾病的藥物，所述炎癥性疾病包括但 不限于宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等。
[0031 ]本發(fā)明的目的是從傳統(tǒng)的中藥處方中，通過從婦科千金片及婦科千金膠囊的處方 中，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化制得一種新化合物，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 其可以應(yīng)用于炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等 疾病的治療。
[0032]具體地，發(fā)明人通過從婦科千金片、婦科千金膠囊的處方中，選取大葉千斤拔的干 燥根，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化，得到本發(fā)明所述苯丙素類化合物， 然后對(duì)該化合物進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)細(xì)胞炎癥因子NO，TNF-a，IL-Ιβ，IL-6及羥基自由 基(-OH)的抑制程度，實(shí)驗(yàn)表明，該苯丙素類化合物在濃度(8.75-15.75yg/mL)范圍內(nèi)對(duì)LPS 引起的N0含量升高有明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。在濃度(8.75-15.75 yg/mL)范圍內(nèi)LPS引起的Raw 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-a，IL-Ιβ，IL-6含量均有明顯的抑制 作用(P<〇.〇5)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，在濃度(5.25-15.75以 8/111〇范圍內(nèi)對(duì)1^弓| 起的0H含量變化有明顯的抑制作用(p <0.05 )，并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
[0033]本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 本發(fā)明提供了一種新的苯丙素類化合物，同時(shí)提供了所述苯丙素類化合物藥學(xué)上 可接受的鹽，該苯丙素類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以抑制細(xì)胞炎癥因子N0的含量， 抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-a，IL- 1β，IL-6的表達(dá)作用，具有對(duì)羥基自由基的（-OH)的抑制作用， 進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活性，可很好地應(yīng)用于制備治療炎癥性疾病方面的藥物，包括但不 限于如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的治療藥 物，為抗炎藥物的發(fā)展提供有力的技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振氫譜圖。
[0036] 圖2為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振碳譜圖。
[0037] 圖3為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)細(xì)胞活性的影響圖。
[0038]圖4為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)Ν0的抑制作用圖。
[0039]圖5為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)TNF-a的抑制作用圖。
[0040]圖6為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)IL-1邱勺抑制作用圖。
[0041]圖7為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)IL-6的抑制作用圖。
[0042] 圖8為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對(duì)0H的抑制作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，本實(shí)施例所用的原料和設(shè)備均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的原 料和設(shè)備。
[0044] 本發(fā)明的化合物是所述式（I)所示的苯丙素類化合物及式（Π )或式（ΙΠ )所示該化 合物藥學(xué)上可接受的鹽。該化合物可以采用本發(fā)明提供的以大葉千斤拔為原料提取的方法 制備得到，也可以根據(jù)本發(fā)明提供的結(jié)構(gòu)式結(jié)合采用本領(lǐng)域的化學(xué)合成等方法制備得到。
[0045] 作為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的鹽，只要是藥學(xué)上可接受的鹽即可，可列舉為 與鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸等無機(jī)酸形成的無機(jī)酸鹽;與 磺酸形成的磺酸鹽;與鉀、鈉、鈣、鎂、鋰等堿金屬的氫氧化物形成的堿金屬鹽，與銨形成的 銨鹽等。
[0046] 本發(fā)明苯丙素類化合物可用作如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/ 或關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的治療藥物。
[0047] 本發(fā)明化合物可以與藥學(xué)上允許的輔料和/或載體一起用作藥物組合物，也可以 在加入藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下與金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、 當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種中藥材或提取物的組合用作藥物組合物，本發(fā)明化合物還可以 與其他藥學(xué)上可接受的藥效成分一起用作藥物組合物。
[0048] 作為藥物組合物，可以是片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿 劑、注射劑、軟膏劑、栓劑、噴霧劑等。
[0049] 進(jìn)一步地，片劑可以是在添加藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下制成的糖衣 片、薄膜衣片、腸溶性包衣片或雙層片、多層片。
[0050] 本發(fā)明的輔料和/或載體可以如下：
[0051 ]制成固體制劑，可以使用添加劑，例如蔗糖、乳糖、纖維素糖、麥芽糖醇、葡萄糖、淀 粉類、瓊脂、海藻酸鹽類、甲殼素、殼聚糖類、果膠類、阿拉伯樹膠類、明膠類、膠原類、酪蛋 白、白蛋白、磷酸鈣、山梨糖醇、甘氨酸、甘油、聚乙二醇、碳酸氫鈉、滑石等。
[0052] 制成半固體制劑，可以使用動(dòng)植物性油脂(橄欖油、玉米油、蓖麻油等）、礦物性油 月旨(凡士林、白凡士林、固態(tài)石蠟等）、蠟類(霍霍巴油、巴西棕櫚蠟、蜂蠟等）、部分合成或全 合成的甘油脂肪酸酯（月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等)等。
[0053] 制成液體制劑，可使用添加劑，例如氯化鈉、葡萄糖、山梨糖醇、甘油、橄欖油、丙二 醇、乙醇等。尤其制成注射劑的情況下，可以使用無菌水溶液，例如生理鹽水、等滲液、油性 液，如麻油、大豆油。另外，還可以根據(jù)需要，并用適當(dāng)?shù)闹鷳覄?，如羧甲基纖維素鈉，非離子 表面活性劑、助溶劑，如苯甲酸芐酯、苯甲醇等。
[0054]這些制劑的有效成分的量為制劑的0.01~80重量％，適宜為1~50重量％，給藥量 根據(jù)患者的癥狀、體重、年齡等不同而變化。
[0055]實(shí)施例1苯丙素類化合物的制備
[0056]本實(shí)施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0057] SI.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)8倍量60%的乙醇回流 提取3次，每次2小時(shí)，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0058] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于10L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對(duì)其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為水，洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0059] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個(gè)柱體積，按每3個(gè)柱體積收集一個(gè)流分的洗脫液，按順序 收集 6 個(gè)流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0060] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml/min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為25:75: 0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個(gè)流分，分別命名為MM-121，麗-122，^-123，MM-124，MM-125，MM-126，MM-127,備用；
[0061 ] S5 .將步驟S4中收集到的流分MM-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0062] 實(shí)施例2苯丙素類化合物的制備
[0063] 本實(shí)施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0064] S1.取大葉千斤拔40kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)6倍量50%的乙醇回流 提取2次，每次1小時(shí)，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0065] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于5L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對(duì)其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為15:85,洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0066] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為20:80，洗脫18個(gè)柱體積，按每3個(gè)柱體積收集一個(gè)流分的洗脫液，按順序 收集 6 個(gè)流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0067] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 0mm* 2 5 0mm，流速：10m 1 /m i η，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為3 5: 65:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個(gè)流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0068] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0069] 實(shí)施例3苯丙素類化合物的制備
[0070] 本實(shí)施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0071] S1.取大葉千斤拔60kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。7倍量70%的乙醇回流提 取4次，每次3小時(shí)，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0072] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于8L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對(duì)其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用； [0073] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為30:70，洗脫18個(gè)柱體積，按每3個(gè)柱體積收集一個(gè)流分的洗脫液，按順序 收集 6 個(gè)流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0074] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 0mm* 2 5 0mm，流速：10m 1 /m i η，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為3 0: 70:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個(gè)流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0075] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0076] 實(shí)施例4苯丙素類化合物的制備
[0077] 本實(shí)施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0078] S1.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量60%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時(shí)，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0079] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對(duì)其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為5:95,洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用； [0080] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個(gè)柱體積，按每3個(gè)柱體積收集一個(gè)流分的洗脫液，按順序 收集 6 個(gè)流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0081 ] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 Omm* 2 5 Omm，流速：1 Om 1 /m i η，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為2 5: 75:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個(gè)流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0082] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0083] 實(shí)施例5苯丙素類化合物的制備
[0084] 本實(shí)施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0085] S1.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量80%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時(shí)，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0086] S2.將步驟S1中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用D101大孔吸附樹脂柱對(duì)其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，命名為MM-1，備用；
[0087] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-1用反相0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為28:72，洗脫18個(gè)柱體積，按每3個(gè)柱體積收集一個(gè)流分的洗脫液，按順序 收集 6 個(gè)流分，分別命名為:MM-11，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0088] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 2 Omm* 2 5 Omm，流速：1 Om 1 /m i η，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為10: 90:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個(gè)流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0089] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0090]將實(shí)施例1至實(shí)施例5制備得到的化合物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜 的檢測(cè)，結(jié)果證明所得化合物為:4,5_吡喃環(huán)-Γ烯_2'_葡萄糖基-Γ，3'_二羥基-2-甲氧 基-3-羥基苯甲酸。其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：
[0092]其質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜的譜圖數(shù)據(jù)如下：
[0093] HR-ESMS顯示[M+Na]+為m/z453.1158，結(jié)合核磁特征，可得分子式為C18H22〇 12，不 飽和度為8。
[0094] 4-^^(60011^,0)300):6.14(8,110,4.73((1,110,4.71^110,3.79(8,3103.00-4.00(H-2'-6'），2.59(d，2H)。
[0095] 13C-NMR(150MHz，CD30D): 154.6(C-1),153.3(C-2),131.4(C-4),115.6(C-5)， 131 ·4(C-3)，128.2(C-6)，114.7(C-2'），104.8(C-r)，93.2(C-r)78.7(C-3'），76.8-61.2 (C-2"-6"），50.4(C-4，）。
[0096] 實(shí)施例6苯丙素類化合物鹽的制備
[0097] 苯丙素類化合物鹽酸鹽的制備：
[0098]攪拌下將該苯丙素類化合物甲醇溶液中滴加飽和鹽酸至pH值2-3,攪拌下滴加乙 腈，抽濾，干燥得到白色粉末固體，即為苯丙素類化合物的鹽酸鹽。
[0099]苯丙素類化合物磺酸鹽的制備：
[0100] 在含有該苯丙素類化合物、溶劑、磺酸、中性油和促進(jìn)劑的反應(yīng)體系中加入堿金屬 的氫氧化物，加入溶劑、低級(jí)醇和助促進(jìn)劑，通入二氧化碳，分離得到白色粉末固體，即為苯 丙素類化合物的磺酸鹽。
[0101] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽的制備：
[0102] 將溶于乙醇中的Κ0Η或NaOH加入該苯丙素類化合物中，攪拌下加熱回流反應(yīng)，冷制 室溫，攪拌下滴加乙腈，抽濾，干燥得白色固體，即為該苯丙素類化合物的鉀鹽或鈉鹽。
[0103] 苯丙素類化合物銨鹽的制備：
[0104] 攪拌下將該苯丙素類化合物甲醇溶液中滴加飽和氨水至pH值9-11，攪拌下滴加乙 腈，抽濾，干燥得到白色固體，即為苯丙素類化合物的銨鹽。
[0105] 上述化合物鹽的譜圖數(shù)據(jù)：
[0106] 苯丙素類化合物鹽酸鹽：ESIMS顯示m/z 466.89，核磁特征1!1-匪1?(60(^取， CDSODh^-NMRWOOMHz.CDsOD) :6.17(s，lH)，4.77(d，lH)，4.70(t，lH)，3.78(s，3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.44(d，2H)。
[0107] 苯丙素類化合物磺酸鹽：ESIMS顯示為m/z 494.27，核磁特征咕-麗1?(6001〇^， CDSODh^-NMRWOOMHz.CDsOD) :6.17(s，lH)，4.78(d，lH)，4.89(t，lH)，3.66(s，3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.51(d，2H)。
[0108] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽：
[0109] 鉀鹽：ESMS顯示m/z 468 · 33，核磁特征1H-匪R(600MHz，CD30D): 匪R(600MHz， CD30D):6.11(s，lH)，4.69(d，lH)，4.66(t，lH)，3.73(s，3H)3.00-4.00(H-2，-6，），2.50(d， 2H)〇
[0110] 鈉鹽:ESMS顯示m/z 452 · 63，核磁特征1H-NMR(600MHz，CD30D): 6 · 17(s，1H)，4 · 50 (d，lH)，4.61(t，lH)，3.40(s，3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.10(d，2H)。
[0111] 苯丙素類化合物銨鹽:ESMS顯示m/z 445.26，核磁特征1H-NMR(600MHz，CD30D): ^-NMRWOOMHz.CDsOD) :6.18(s，lH)，4.78(d，lH)，4.46(t，lH)，3.46(s，3H)3.00-4.00(H-2，-6，），2.51(d，2H)。
[0112] 上述苯丙素類化合物鹽的結(jié)構(gòu)式如式(IV)~式(VI)所示。
[0115]其中，式(IV)為制備得到的苯丙素類化合物鹽酸鹽，式（V)為制備得到的苯丙素 類化合物的其中一種磺酸鹽，式（VI)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鉀鹽，式 (νπ)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鈉鹽，式(VI)為制備得到的苯丙素類化合物 的其中一種銨鹽。
[0116] 實(shí)驗(yàn)例7應(yīng)用試驗(yàn)
[0117] 本發(fā)明所述化合物以及鹽對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎癥的影 響。（為了實(shí)驗(yàn)過程中記錄方便，以下將本發(fā)明所述的苯丙素類化合物標(biāo)號(hào)為:藥物MM-126， 即本發(fā)明中所述的藥物MM-126即是指本發(fā)明式（I)所示苯丙素類化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽。）
[0118] 1材料與方法
[0119] 1.1藥品及儀器
[0120] 脂多糖（11卩〇卩〇1}^&(^]1&1^(16，1^：)3)，]\11'1'購自3181]1&公司；小鼠巨卩策細(xì)胞1^￥ 264.7 購自湘雅細(xì)胞庫;PBS; DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素;全自動(dòng)酶標(biāo)儀;恒溫 C02培養(yǎng)箱。
[0121] 小鼠白介素 l-f3(IL-1-f3)ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：2014/06(96T);小鼠白介素6 (IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：2014/06(96T);小鼠腫瘤壞死因子-a(TNF-a)ELISA檢測(cè)試 劑盒，批號(hào)：2014/06(96T);小鼠一氧化氮(NO)ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：2014/10(96T);小鼠 羥基自由基(OH)ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào):2014/10(96T)。
[0122] 1.2藥物制備
[0123] 首先用少量DMS0溶解，然后用DMEM稀釋至一定的濃度，使終濃度中DMS0含量少于 1%0 〇
[0124] 1.3細(xì)胞培養(yǎng)
[0125] 小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7培養(yǎng)于含10%熱滅活（56°C，30min)的胎牛血清（FBS)、 10U/mL青霉素鈉、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % C02恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長(zhǎng)。
[0126] 1.4細(xì)胞活力測(cè)定
[0127] 細(xì)胞活力通過MTT法來測(cè)定。將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于96孔板(1 X 104個(gè)/孔)孵 育24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞2h，然后再加入LPS(30yg/mL)刺激 24h，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100yL的MTT(0.5mg/mL)繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入 150yL的DMS0，搖床振搖10min，在490nm處測(cè)定吸光度。
[0128] 1.5 N0含量測(cè)定
[0129] Raw 264.7細(xì)胞接種于96孔板24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì) 胞2h，然后再加入LPS( 30yg/mL)刺激24h，最后收集上清液，并于lOOOOrpm離心5min，分裝上 清并置于_80°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^小鼠 N0試劑盒測(cè)定N0含量。
[0130] 1.6炎癥因子了陬-€[，幾-10，幾-6測(cè)量
[0131 ] 樣品取1.5制備好的樣品用于后續(xù)炎癥因子測(cè)定。細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，IL-Ιβ，IL-6的 量通過小鼠 TNF-a，IL-Ιβ，IL-6試劑盒來測(cè)定。
[0132] 1.7 0H含量測(cè)定
[0133] 樣品取1.5制備好的樣品用于0H因子測(cè)定。通過0H試劑盒測(cè)定含量。
[0134] 1.8統(tǒng)計(jì)分析
[0135] 采用SPSS17.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s表示;所得數(shù)據(jù)通過用單因素方差分析，方 差齊性用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett T3檢驗(yàn)。
[0136] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0137] 2.1細(xì)胞活力
[0138] 藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響通過MTT法來評(píng)價(jià)。如圖3所示，藥物MM-126在1.75-15.75μ g/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)Raw 264.7細(xì)胞活力沒有顯著影響；因此在此范圍濃度下的藥物濃度對(duì) 于后續(xù)實(shí)驗(yàn)是合適的。
[0139] 2.2藥物抑制N0的產(chǎn)生
[0140] 如圖4所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，其產(chǎn)生N0(65.81 ±2.93IU/mL)含量與正 常組勵(lì)(33.61±2.1911]/1^)相比明顯升高化<0.01)。藥物麗-126在濃度(8.75-15.754 8/ mL)范圍內(nèi)對(duì)LPS引起的N0含量升高有明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
[0141] 2 · 3藥物抑制TNF-α，IL-Ιβ, IL-6的產(chǎn)生
[0142] 如圖5至圖7所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，Raw 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-a (132 · 16 ± 5 · 28pg/mL)，IL-10(358 · 80 ± 24 · 64pg/mL)，IL-6(198 · 39 ± 5 · 97pg/mL)含量與正 常組TNF-a (65 · 41 ±6 · 29pg/mL)，IL-10( 172 · 67 ± 10 · 06pg/mL)，IL-6( 103 · 34± 2 · 88pg/mL) 相比含量明顯升高(P<〇.01);說明LPS能夠刺激Raw 264.7細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子。
[0143] 藥物麗-126在濃度(8.75-15.75以8/1^)范圍內(nèi)對(duì)1^3刺激1^￥ 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥 因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6含量均有明顯的抑制作用(p<0.05)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān) 系。
[0144] 2.4藥物抑制0H的產(chǎn)生
[0145] 如圖8所示，通過LPS刺激Raw 264 · 7細(xì)胞，其產(chǎn)生0H(113 · 58±6 · 03ng/mL)含量與 正常組0H(63 · 40± 1 · 19ng/mL)相比明顯升高（p<0 · 01)。
[0146] 藥物MM-126在濃度(5.25-15.75以8/11^)范圍內(nèi)對(duì)1^3引起的0!1含量變化有明顯的 抑制作用(P <〇. 05 )，并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
[0147] 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)體外培養(yǎng)，研究了藥物MM-126對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞N0，TNF-α，IL-Ιβ，IL-6，0H 生成的影響。
[0148] 藥物MM-126需在中高濃度時(shí)對(duì)如，了冊(cè)-€1，幾-1|3，幾-6的含量有明顯抑制效果，說 明其發(fā)揮抗炎活性需要較高藥物濃度實(shí)現(xiàn);其對(duì)0H的抑制活性明顯，說明其有一定的抗氧 化活性。
[0149] 實(shí)施例8
[0150] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0151] 實(shí)施例9
[0152] 散劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得式(I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 常規(guī)散劑制法制成散劑。
[0153] 實(shí)施例10
[0154]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以 及利用該化合物與無機(jī)酸（如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸） 或磺酸或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨 制成的鹽，按該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制成膠 囊劑或顆粒劑。
[0155] 實(shí)施例11
[0156] 注射劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該 化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或 堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽， 按常規(guī)注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射劑。
[0157] 實(shí)施例12
[0158] -種藥物組合物，含有實(shí)施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0159] 實(shí)施例13
[0160] -種藥物組合物，含有實(shí)施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0161] 實(shí)施例14
[0162] -種藥物組合物，含有實(shí)施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按專利公告號(hào) CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、 CN1296072C、CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0163] 實(shí)施例15
[0164] -種藥物組合物，含有實(shí)施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按 專利公告號(hào) CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、 CN1296072C、CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0165] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā) 明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述苯丙素類化合物的 結(jié)構(gòu)式如式(I)所示，所述藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)如式（n)或式(m)所示：其中，R為無機(jī)酸，Ri或R2或R3為磺酸根、堿金屬離子或銨根中的任意一種或任意兩種或 任意二種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述無機(jī) 酸為鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸或乳酸;所述磺酸根為具有芳基 的磺酸根;所述堿金屬離子為鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子或鋰離子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述具有 芳基的磺酸根為苯磺酸根或?qū)妆交撬岣?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述藥學(xué) 上可接受的鹽為銨鹽。5. -種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述苯丙素類化合物和/或 其藥學(xué)上可接受的鹽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還含有藥學(xué)上允許的 輔料和/或載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，還含有金櫻根、單面針、雞血藤、功 勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還含有金櫻根、單 面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種的提取物。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的劑型為片劑、膠 囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注射劑、軟膏劑、栓劑或噴霧劑。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK106046072SQ201610153529
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年3月17日 公開號(hào)201610153529.6, CN 106046072 A, CN 106046072A, CN 201610153529, CN-A-106046072, CN106046072 A, CN106046072A, CN201610153529, CN201610153529.6
【發(fā)明人】龔云, 張鵬, 夏博候, 彭開鋒, 李亞梅, 佘娜
【申請(qǐng)人】株洲千金藥業(yè)股份有限公司