用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法，專用引物包括如下兩組引物1)S19，其序列為ACCCCCGAAG；S43，其序列為GTCGCCGTCA。2)ISSR引物：UBC857，其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG；UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC。方法為先建立野牡丹指紋圖譜，再將擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳和指紋圖譜進(jìn)行比較。它具有如下優(yōu)點(diǎn)：采用引物S19和S43組合以及UBC857和UBC811的組合，可以準(zhǔn)確鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。
【專利說明】
用于綜合鑒別野壯丹屬種的專用引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 野牡丹科（Melastomaceae)植物全世界約240個屬，共3000余個種。野牡丹屬 (Melastoma)屬于野牡丹科，大約有100個種，分布中屯、處于東南亞一帶，我國有9個種和1個 變種，主要分布帶處于長江W南各個省區(qū)。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系，花 期長、花量大，株型從地被、灌木到小喬木均有分布，具備良好的觀賞性狀;此外，該屬植物 的藥用價值近來也有陸續(xù)的深入研究，發(fā)展前景廣泛。目前，絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未 被人工開發(fā)利用，已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評價、栽培技術(shù)、脫毒育苗、傳粉特性W 及種子發(fā)育等方面進(jìn)行研究。
[0003] 目前，針對野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、抱粉學(xué)、細(xì) 胞學(xué)、表型多樣性等方面，利用分子標(biāo)記對野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進(jìn)行研究還比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的所采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物，其特征在于:它包括兩組引物：
[0007] 1 )RAro引物:S19，其序列為ACCCCCGAAG; S43，其序列為 GTCGCCGTCA;
[000引 2)ISSR引物:UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG;UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC0
[0009] -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)根據(jù)前述的S19和S43引物，建立野牡丹RAPD指紋圖譜;根據(jù)權(quán)利要求1所述的 UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指紋圖譜；
[00川 2)提取野牡丹基因組DNA;
[0012] 3)提供前述的UBC857和UBC811引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增;S19和S43引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[OOK] 4)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，分析條帶，并與野牡丹RAPDW及ISSR指紋圖譜比對，確定野 牡丹屬種。
[0014] 前述一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟3)S19和S43引物擴(kuò) 增，在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行：
[0015] 30ng/uLDNA模板0.7uL，10Xbuffer化L，10mMdNTP0.6uL，10uM引物0.8uL，抓/ uL Taq酶0. luL，d地20定容至20uL，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0016] 前述一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟3)UBC857和UBC811 引物擴(kuò)增，在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行：
[0017] 30ng/uLDNA模板0.7uL，10Xbuffer化L，10mMdNTP0.6uL，10uM引物0.8uL，抓/ uL Taq酶0. luL，d地20定容至20uL，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0018] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019]利用引物S19可W鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物S43可W鑒別出29份野 牡丹種質(zhì)資源，而采用引物S19和S43組合可W鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。利用 運(yùn)2條RAPD核屯、引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源的指紋圖譜，每個品種都有唯一的指紋圖 譜。
[0020] 利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可W鑒別出 42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出供試的44份野牡丹 種質(zhì)資源。
[0021] 綜合應(yīng)用運(yùn)兩種指紋圖譜，可W準(zhǔn)確鑒別野牡丹的種質(zhì)資源。
【附圖說明】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0023] 圖1 S19引物對供試樣品的ISSR圖譜。M:分子量標(biāo)記；1-44見表1中的序號。
[0024] 圖2基于引物S19和S43擴(kuò)增結(jié)果的44份野牡丹屬種質(zhì)資源基因組DNA的RAPD指紋 圖譜。
[0025] 圖3 UBC857引物對44份供試樣品的ISSR圖譜。M:分子量標(biāo)記；1-44見表1。（后Ξ泳 道非供試樣）。
[0026] 圖4基于引物UBC811和UBC857擴(kuò)增結(jié)果的44份野牡丹屬種質(zhì)資源基因組DNA的 ISSR指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 參見表1，本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共44份，來源于福建、廣東、廣 西、海南、云南五個省份。采集新鮮葉片凍于液氮，保存在-80°C。
[0029] 表1野牡丹屬44份供試種質(zhì)資源
[0030] Table 1 44 individuals of Melastoma
[0031]

[0034] 實(shí)施例2 DM提取
[0035] 采用前期試驗(yàn)確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DM,主要步驟為：
[0036] (1)取約Ig新鮮嫩葉，放入預(yù)冷的研鉢中，在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 1 OmL離屯、管中，加入4mL預(yù)熱至65 °C的CTAB抽提液，同時加入80化β-琉基乙醇，緩慢上下顛 倒混勻，65°C水浴60min(期間每lOmin顛倒混勻1次）。
[0037] (2)取出離屯、管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，放在水平搖 床上緩慢搖晃30min，靜置后于4°C、7 500g離屯、5min，回收上(水)相。
[0038] (3)在回收的上層相中加入1/10體積的CTAB/NaCl溶液(65°C)，顛倒混勻。重復(fù)步 驟2。若上清混濁，將上清液轉(zhuǎn)入另一只lOmL離屯、管中，再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)， 混勻，放在水平搖床上緩慢搖晃30min，靜置后于4°C、7 500g離屯、5min。
[0039] (4)加入1倍體積的CTAB沉淀液，顛倒混勻。如果看不到沉淀，于65°C溫育30min。然 后于4°C、9 OOOg離屯、5min。用0.5mL高鹽TE緩沖液重懸沉淀，如果沉淀難重懸，于65°C溫育 30min，重復(fù)，直至所有的或大部分沉淀溶解。
[0040] (5)加入0.6體積預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置后于4°C、7500g離屯、15min，棄上清得到白 色DNA，加入ImL 80%乙醇漂洗2次，再加入11^無水乙醇漂洗1次，風(fēng)干0魁沉淀，加入0.11111 TE緩沖液，待DNA沉淀溶解后，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[00創(chuàng) PCR反應(yīng)
[0043] PCR反應(yīng) ISSR反應(yīng)體系：DNA 模板（30ng/uL)0.7uL，10Xbuffer^L，dNTP(10mM) 0.6uL，引物（1 OuM)0.8uL，Taq酶（5U/uL)0. luL，d地20定容20uL，反應(yīng)程序：反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin;53°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0044] 引物篩選：從116條ISSR隨機(jī)引物中篩選出11條多態(tài)性好、條帶清晰的引物： UBC857、UBC848、UBC842、UBC841、UBC821、UBC820、UBC811、CW32506、CW32488、CW32451、 CW32447〇
[0045] RAPD反應(yīng)體系：DNA模板（20ng/ul)l.扣laOXTaq Green Buffer(含Mg化）2ul，引 物（10uM)0.7ul，dNTP( 10mM)0.4ul，Taq DNA聚合酶（5υ/μ1 )0.3μ1，d地20定容20μ1。反應(yīng)程 序：94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin;38°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min;45°C 循環(huán)；最后 72°C 延 伸5min后于4°C保存。引物篩選:篩選出16條多態(tài)性好、條帶清晰的RAPD引物(如表2)。
[0046] 表2 RAPD隨機(jī)引物序列
[0047] Table 2 Primer sequence of RAPD
[004引
[0049] 指紋圖譜建立
[0050] 根據(jù)兩種分子標(biāo)記方法通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的條帶圖片，對同一引物所擴(kuò)增出遷 移率相同的條帶計為一個位點(diǎn)，有條帶的位置計為"Γ，無條帶位置計為"0"，所得數(shù)據(jù)輸入 Excel2003工作表建成原始"0/Γ數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSl^聚類分析軟件進(jìn)行聚類分析。針對所 有供試品種，對11條ISSR引物和16條RAPD引物擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行比對，選出鑒別能力較強(qiáng) 的引物，然后對由運(yùn)些引物經(jīng)PCR反應(yīng)跑出的電泳條帶進(jìn)行形象化處理，同一位點(diǎn)上記為 "Γ的電泳條帶用黑色方塊表示，記為"0"的條帶用白色方塊表示，據(jù)此構(gòu)建出供試的44份 野牡丹屬種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。見圖2和圖4。
[0化1] 實(shí)施例3
[0052] 本研究W前期試驗(yàn)篩選出的11條ISSR隨機(jī)引物對供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源 進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測，總共擴(kuò)增出91條清晰度好，重復(fù)性高的譜帶，其中多態(tài)性譜帶有90條， 多態(tài)性條帶比例為98.9%(見表2)。擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物為郵〔857、118〔811 和CW32506,位點(diǎn)數(shù)均為12個。其中引物UBC857對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖1。
[0053] 由于ISSR引物的多態(tài)性，同一引物擴(kuò)增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯 差異。比對結(jié)果表明：利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851 可W鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出供試的44 份野牡丹種質(zhì)資源。
[0054] 實(shí)施例4
[0055] RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果，16條引物共擴(kuò)增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性 比率為89.38%。擴(kuò)增產(chǎn)物大小集中在2 006口~20006口之間。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物是51、 S19、S43,位點(diǎn)數(shù)均為9。其中引物S19對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖1。
[0056] 從篩選16條RAPD引物中選擇多態(tài)性好、鑒別效率高的核屯、引物S19和S43,建立44 份野牡丹屬種質(zhì)資源的指紋圖譜（圖2)。利用引物S19可W鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源， 利用引物S43可W鑒別出29份野牡丹種質(zhì)資源，而采用引物S19和S43組合可W鑒別出供試 的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。由圖2可知，利用2條RAPD核屯、引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源 的指紋圖譜，每個品種都有唯一的指紋圖譜。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物，其特征在于:它包括兩組引物： 1. RAPD 引物：S19，其序列為ACCCCCGAAG; S43，其序列為GTCGCCGTCA; 2. ISSR引物：UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG;UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC〇2. -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法，包括如下步驟： 1) 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S19和S43引物，建立野牡丹RAPD指紋圖譜;根據(jù)權(quán)利要求1所 述的UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指紋圖譜； 2) 提取野牡丹基因組DNA; 3) 提供所述的UBC857和UBC811引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及提供S19和S43引物，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； 4) 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，分析條帶，并與野牡丹RAH)以及ISSR指紋圖譜比對，確定野牡丹 屬種。3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟2)的基 因組DNA來自葉片。4. 如權(quán)利要求2所述的一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟3)S19 和S43引物擴(kuò)增，在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行：30ng/uL DNA模板0.7uL，10 X buf f er 2uL，10mM dNTP 0.6uL，1 OuM引物0.8uL，5U/uL Taq酶0. luL，ddH20定容至20uL，反應(yīng)程序：94 °C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin; 53°C 退火 40sec; 72°C 延伸 2min。5. 如權(quán)利要求2所述的一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟3) UBC857和UBC811引物擴(kuò)增，在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行： 30ng/uL DNA模板0.7uL，10 X buffer 2uL，10mM dNTP 0.6uL，10uM引物0.8uL，5U/uL Taq酶0 . luL，ddH20定容至20uL，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ; 94°C變性lmin ; 53 °C退火 40sec; 72°C 延伸 2min。
【文檔編號】C12N15/11GK106011226SQ201610230086
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】鄭濤, 陳振東, 林秀香, 林藝華
【申請人】福建省熱帶作物科學(xué)研究所