用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法,專用引物包括如下兩組引物1)S19,其序列為ACCCCCGAAG;S43,其序列為GTCGCCGTCA。2)ISSR引物:UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG;UBC811,其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC。方法為先建立野牡丹指紋圖譜,再將擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳和指紋圖譜進(jìn)行比較。它具有如下優(yōu)點(diǎn):采用引物S19和S43組合以及UBC857和UBC811的組合,可以準(zhǔn)確鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。
【專利說明】
用于綜合鑒別野壯丹屬種的專用引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 野牡丹科(Melastomaceae)植物全世界約240個屬,共3000余個種。野牡丹屬 (Melastoma)屬于野牡丹科,大約有100個種,分布中屯、處于東南亞一帶,我國有9個種和1個 變種,主要分布帶處于長江W南各個省區(qū)。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系,花 期長、花量大,株型從地被、灌木到小喬木均有分布,具備良好的觀賞性狀;此外,該屬植物 的藥用價值近來也有陸續(xù)的深入研究,發(fā)展前景廣泛。目前,絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未 被人工開發(fā)利用,已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評價、栽培技術(shù)、脫毒育苗、傳粉特性W 及種子發(fā)育等方面進(jìn)行研究。
[0003] 目前,針對野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、抱粉學(xué)、細(xì) 胞學(xué)、表型多樣性等方面,利用分子標(biāo)記對野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進(jìn)行研究還比較少。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明提供了一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物和方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的所采用的技術(shù)方案是:
[0006] -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物,其特征在于:它包括兩組引物:
[0007] 1 )RAro引物:S19,其序列為ACCCCCGAAG; S43,其序列為 GTCGCCGTCA;
[000引 2)ISSR引物:UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG;UBC811,其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC0
[0009] -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法,包括如下步驟:
[0010] 1)根據(jù)前述的S19和S43引物,建立野牡丹RAPD指紋圖譜;根據(jù)權(quán)利要求1所述的 UBC857和UBC811引物,建立野牡丹ISSR指紋圖譜;
[00川 2)提取野牡丹基因組DNA;
[0012] 3)提供前述的UBC857和UBC811引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;S19和S43引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;
[OOK] 4)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳,分析條帶,并與野牡丹RAPDW及ISSR指紋圖譜比對,確定野 牡丹屬種。
[0014] 前述一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法,其特征在于,步驟3)S19和S43引物擴(kuò) 增,在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行:
[0015] 30ng/uLDNA模板0.7uL,10Xbuffer化L,10mMdNTP0.6uL,10uM引物0.8uL,抓/ uL Taq酶0. luL,d地20定容至20uL,反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0016] 前述一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法,其特征在于,步驟3)UBC857和UBC811 引物擴(kuò)增,在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行:
[0017] 30ng/uLDNA模板0.7uL,10Xbuffer化L,10mMdNTP0.6uL,10uM引物0.8uL,抓/ uL Taq酶0. luL,d地20定容至20uL,反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0018] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比,它具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0019]利用引物S19可W鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源,利用引物S43可W鑒別出29份野 牡丹種質(zhì)資源,而采用引物S19和S43組合可W鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。利用 運(yùn)2條RAPD核屯、引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源的指紋圖譜,每個品種都有唯一的指紋圖 譜。
[0020] 利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源,利用引物UBC851可W鑒別出 42份野牡丹屬種質(zhì)資源,而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出供試的44份野牡丹 種質(zhì)資源。
[0021] 綜合應(yīng)用運(yùn)兩種指紋圖譜,可W準(zhǔn)確鑒別野牡丹的種質(zhì)資源。
【附圖說明】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0023] 圖1 S19引物對供試樣品的ISSR圖譜。M:分子量標(biāo)記;1-44見表1中的序號。
[0024] 圖2基于引物S19和S43擴(kuò)增結(jié)果的44份野牡丹屬種質(zhì)資源基因組DNA的RAPD指紋 圖譜。
[0025] 圖3 UBC857引物對44份供試樣品的ISSR圖譜。M:分子量標(biāo)記;1-44見表1。(后Ξ泳 道非供試樣)。
[0026] 圖4基于引物UBC811和UBC857擴(kuò)增結(jié)果的44份野牡丹屬種質(zhì)資源基因組DNA的 ISSR指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 參見表1,本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共44份,來源于福建、廣東、廣 西、海南、云南五個省份。采集新鮮葉片凍于液氮,保存在-80°C。
[0029] 表1野牡丹屬44份供試種質(zhì)資源
[0030] Table 1 44 individuals of Melastoma
[0031]
[0034] 實(shí)施例2 DM提取
[0035] 采用前期試驗(yàn)確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DM,主要步驟為:
[0036] (1)取約Ig新鮮嫩葉,放入預(yù)冷的研鉢中,在液氮中迅速研磨成粉末,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 1 OmL離屯、管中,加入4mL預(yù)熱至65 °C的CTAB抽提液,同時加入80化β-琉基乙醇,緩慢上下顛 倒混勻,65°C水浴60min(期間每lOmin顛倒混勻1次)。
[0037] (2)取出離屯、管冷卻至室溫,加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1),混勻,放在水平搖 床上緩慢搖晃30min,靜置后于4°C、7 500g離屯、5min,回收上(水)相。
[0038] (3)在回收的上層相中加入1/10體積的CTAB/NaCl溶液(65°C),顛倒混勻。重復(fù)步 驟2。若上清混濁,將上清液轉(zhuǎn)入另一只lOmL離屯、管中,再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1), 混勻,放在水平搖床上緩慢搖晃30min,靜置后于4°C、7 500g離屯、5min。
[0039] (4)加入1倍體積的CTAB沉淀液,顛倒混勻。如果看不到沉淀,于65°C溫育30min。然 后于4°C、9 OOOg離屯、5min。用0.5mL高鹽TE緩沖液重懸沉淀,如果沉淀難重懸,于65°C溫育 30min,重復(fù),直至所有的或大部分沉淀溶解。
[0040] (5)加入0.6體積預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置后于4°C、7500g離屯、15min,棄上清得到白 色DNA,加入ImL 80%乙醇漂洗2次,再加入11^無水乙醇漂洗1次,風(fēng)干0魁沉淀,加入0.11111 TE緩沖液,待DNA沉淀溶解后,于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用分光光度法定量后,-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[00創(chuàng) PCR反應(yīng)
[0043] PCR反應(yīng) ISSR反應(yīng)體系:DNA 模板(30ng/uL)0.7uL,10Xbuffer^L,dNTP(10mM) 0.6uL,引物(1 OuM)0.8uL,Taq酶(5U/uL)0. luL,d地20定容20uL,反應(yīng)程序:反應(yīng)程序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin;53°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0044] 引物篩選:從116條ISSR隨機(jī)引物中篩選出11條多態(tài)性好、條帶清晰的引物: UBC857、UBC848、UBC842、UBC841、UBC821、UBC820、UBC811、CW32506、CW32488、CW32451、 CW32447〇
[0045] RAPD反應(yīng)體系:DNA模板(20ng/ul)l.扣laOXTaq Green Buffer(含Mg化)2ul,引 物(10uM)0.7ul,dNTP( 10mM)0.4ul,Taq DNA聚合酶(5υ/μ1 )0.3μ1,d地20定容20μ1。反應(yīng)程 序:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin;38°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min;45°C 循環(huán);最后 72°C 延 伸5min后于4°C保存。引物篩選:篩選出16條多態(tài)性好、條帶清晰的RAPD引物(如表2)。
[0046] 表2 RAPD隨機(jī)引物序列
[0047] Table 2 Primer sequence of RAPD
[004引
[0049] 指紋圖譜建立
[0050] 根據(jù)兩種分子標(biāo)記方法通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的條帶圖片,對同一引物所擴(kuò)增出遷 移率相同的條帶計為一個位點(diǎn),有條帶的位置計為"Γ,無條帶位置計為"0",所得數(shù)據(jù)輸入 Excel2003工作表建成原始"0/Γ數(shù)據(jù)矩陣,利用NTSl^聚類分析軟件進(jìn)行聚類分析。針對所 有供試品種,對11條ISSR引物和16條RAPD引物擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行比對,選出鑒別能力較強(qiáng) 的引物,然后對由運(yùn)些引物經(jīng)PCR反應(yīng)跑出的電泳條帶進(jìn)行形象化處理,同一位點(diǎn)上記為 "Γ的電泳條帶用黑色方塊表示,記為"0"的條帶用白色方塊表示,據(jù)此構(gòu)建出供試的44份 野牡丹屬種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。見圖2和圖4。
[0化1] 實(shí)施例3
[0052] 本研究W前期試驗(yàn)篩選出的11條ISSR隨機(jī)引物對供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源 進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測,總共擴(kuò)增出91條清晰度好,重復(fù)性高的譜帶,其中多態(tài)性譜帶有90條, 多態(tài)性條帶比例為98.9%(見表2)。擴(kuò)增結(jié)果表明,擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物為郵〔857、118〔811 和CW32506,位點(diǎn)數(shù)均為12個。其中引物UBC857對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖1。
[0053] 由于ISSR引物的多態(tài)性,同一引物擴(kuò)增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯 差異。比對結(jié)果表明:利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源,利用引物UBC851 可W鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源,而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出供試的44 份野牡丹種質(zhì)資源。
[0054] 實(shí)施例4
[0055] RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果,16條引物共擴(kuò)增出113條譜帶,其中101條多態(tài)性條帶,多態(tài)性 比率為89.38%。擴(kuò)增產(chǎn)物大小集中在2 006口~20006口之間。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物是51、 S19、S43,位點(diǎn)數(shù)均為9。其中引物S19對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖1。
[0056] 從篩選16條RAPD引物中選擇多態(tài)性好、鑒別效率高的核屯、引物S19和S43,建立44 份野牡丹屬種質(zhì)資源的指紋圖譜(圖2)。利用引物S19可W鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源, 利用引物S43可W鑒別出29份野牡丹種質(zhì)資源,而采用引物S19和S43組合可W鑒別出供試 的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。由圖2可知,利用2條RAPD核屯、引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源 的指紋圖譜,每個品種都有唯一的指紋圖譜。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的專用引物,其特征在于:它包括兩組引物: 1. RAPD 引物:S19,其序列為ACCCCCGAAG; S43,其序列為GTCGCCGTCA; 2. ISSR引物:UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG;UBC811,其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC〇2. -種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法,包括如下步驟: 1) 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S19和S43引物,建立野牡丹RAPD指紋圖譜;根據(jù)權(quán)利要求1所 述的UBC857和UBC811引物,建立野牡丹ISSR指紋圖譜; 2) 提取野牡丹基因組DNA; 3) 提供所述的UBC857和UBC811引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;以及提供S19和S43引物,進(jìn)行PCR擴(kuò) 增; 4) 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳,分析條帶,并與野牡丹RAH)以及ISSR指紋圖譜比對,確定野牡丹 屬種。3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于綜合鑒別野牡丹屬種的方法,其特征在于,步驟2)的基 因組DNA來自葉片。4. 如權(quán)利要求2所述的一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法,其特征在于,步驟3)S19 和S43引物擴(kuò)增,在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行:30ng/uL DNA模板0.7uL,10 X buf f er 2uL,10mM dNTP 0.6uL,1 OuM引物0.8uL,5U/uL Taq酶0. luL,ddH20定容至20uL,反應(yīng)程序:94 °C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin; 53°C 退火 40sec; 72°C 延伸 2min。5. 如權(quán)利要求2所述的一種綜合用于鑒別野牡丹屬種的方法,其特征在于,步驟3) UBC857和UBC811引物擴(kuò)增,在如下反應(yīng)條件下進(jìn)行: 30ng/uL DNA模板0.7uL,10 X buffer 2uL,10mM dNTP 0.6uL,10uM引物0.8uL,5U/uL Taq酶0 . luL,ddH20定容至20uL,反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ; 94°C變性lmin ; 53 °C退火 40sec; 72°C 延伸 2min。
【文檔編號】C12N15/11GK106011226SQ201610230086
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】鄭濤, 陳振東, 林秀香, 林藝華
【申請人】福建省熱帶作物科學(xué)研究所