一種提高孕婦血漿游離dna測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離dna占比的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種提高孕婦血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的方法，步驟如下：提取孕婦血漿游離DNA；在孕婦血漿游離DNA的兩端添加特異性序列標(biāo)簽獲得具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血漿游離DNA；對(duì)具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血漿游離DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該孕婦個(gè)體血漿游離DNA的原始文庫(kù)；在選定長(zhǎng)度范圍內(nèi)，對(duì)孕婦該原始文庫(kù)進(jìn)行回收，獲得用于高通量測(cè)序的回收文庫(kù)或者將多個(gè)不同個(gè)體孕婦所述孕婦原始文庫(kù)進(jìn)行混合后構(gòu)建回收文庫(kù)?？蓪?duì)孕婦外周血胎兒游離DNA含量過低的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，而且降低了每個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量，提高了一次測(cè)序反應(yīng)的樣本通量，降低了檢測(cè)成本，有利于大規(guī)模推廣。
【專利說(shuō)明】
-種提高孕巧血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)遺傳工程領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一種提高孕婦血漿游離DNA測(cè) 序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體非整倍體是指相對(duì)于人的正常的46條染色體而言，細(xì)胞中的某一條或幾條 染色體數(shù)目增加或減少，染色體數(shù)目特別是非整倍數(shù)的改變與人類一些疾病密切相關(guān)，也 與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切的關(guān)系。該類疾病隨著孕婦年齡的提高而提 高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)每年出生的染色體異常的新生兒約10萬(wàn)人，在活產(chǎn)嬰兒中，染色體異常 占比達(dá)到0.3%，染色體異常是造成大量先天缺陷的主要原因。其中異常主要是指染色體的 數(shù)目或者結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，其中最為常見的是唐氏綜合征(T21)、愛德華氏綜合征(T18)、帕陶 氏綜合征(T13)等，占染色體非整倍體崎變95% W上，運(yùn)些染色體異常占全部染色體異常的 80-90%。
[0003] 1997年，Lo等人化O Y.M.et al. ,1997)在孕婦的外周血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒的游離 DNA，使得科學(xué)家在理論上可W通過母親血液檢測(cè)胎兒DNA，從而檢測(cè)胎兒的出生缺陷。然而 血液中的游離DNA片段較短，一般為166bp左右，而且其中胎兒游離DNA的含量較少，一般能 夠占總的游離DNA的5-30%，因而給全面檢測(cè)胎兒游離DNA帶來(lái)了困難。
[0004] 目前，中國(guó)國(guó)內(nèi)對(duì)孕婦外周血游離DNA的研究多集中在富集胎兒游離DNA進(jìn)行相關(guān) 檢測(cè)。如吳雪花等在《孕婦血漿中胎兒游離DNA的提取》一文中通過膠回收法富集胎兒DNA進(jìn) 行Y染色體檢測(cè)，但同時(shí)也提到由于DNA含量低導(dǎo)致檢測(cè)成功率很低。近年來(lái)，隨著高通量測(cè) 序技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家可W通過測(cè)序技術(shù)來(lái)分析孕婦外周血中的胎兒游離DNA，運(yùn)時(shí)候，無(wú) 倉(cāng)化NA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)便從理論變成了現(xiàn)實(shí)。隨后大量的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了此技術(shù)，準(zhǔn)確率到 99%W 上。
[0005] 即便是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)具有運(yùn)么高的準(zhǔn)確率，但還是存在一些問題。目前無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前 檢測(cè)的樣本為全部的孕婦血漿游離DNA，但游離DNA中存在大量的母源游離DNA，胎兒游離 DNA含量因個(gè)體差異而大不相同，部分樣本胎兒游離DNA含量過低，導(dǎo)致準(zhǔn)確性降低、測(cè)序通 量低和檢測(cè)成本較高等。ACOG指南中強(qiáng)調(diào)，由于個(gè)體原因可能會(huì)導(dǎo)致胎兒游離DNA含量過 低，進(jìn)而無(wú)法獲得檢測(cè)結(jié)果，此時(shí)重復(fù)檢測(cè)獲得準(zhǔn)確結(jié)果的可能性只有50-60%，因此在胎 兒游離DNA含量過低的時(shí)候，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性也相對(duì)降低。為了保證每個(gè)樣本檢測(cè) 的準(zhǔn)確度，目前通用做法是提高樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)量，從而降低了每次測(cè)序運(yùn)行的樣本量，導(dǎo) 致檢測(cè)成本比較高，。運(yùn)就迫使急需開發(fā)一種新的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查方法，W有效提高孕婦外周 血胎兒游離DNA占比和提高一次檢測(cè)的樣本通量，降低檢測(cè)成本。
[0006] 2012年，Jiang等(Jiang FM.et al. ,2012)文章研究表明，當(dāng)孕婦外周血胎兒含量 低于3.5% W下時(shí)，檢測(cè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)需要W指數(shù)方式增加。進(jìn)而隨著人們對(duì)孕婦外周血 胎兒游離DNA的更深入研究，許多文獻(xiàn)研究表明胎兒DNA片段長(zhǎng)度相對(duì)短于母體血漿中游離 DNA長(zhǎng)度。2014年，Lo等人化O Y.M.et al. ,2014)文章報(bào)道表明，胎兒DNA片段長(zhǎng)度會(huì)比孕婦 外周血中游離DNA片段長(zhǎng)度小IObp左右，因此通過回收120-140bp左右片段，能夠提高胎兒 游離DNA的占比。Yin等人研究報(bào)道，胎兒游離DNA片段含量占比越大，需要的測(cè)序數(shù)據(jù)越少， 檢測(cè)準(zhǔn)確性越高；相反，則測(cè)序深度需要相對(duì)增加才能達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)（Yin A.H et al.， 2015)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于提供一種提高孕婦血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的 方法，使用所述方法進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，不但對(duì)孕婦外周血胎兒游離DNA含量過低的樣本進(jìn) 行準(zhǔn)確檢測(cè)，而且降低了樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)，提高了一次測(cè)序反應(yīng)的樣本通量，降低了檢測(cè)成 本，有利于大規(guī)模推廣。
[000引為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明方法為一種提高孕婦血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的方法，通 過對(duì)孕婦血漿游離DNA進(jìn)行特異性序列標(biāo)簽連接，擴(kuò)增后，富集特定片段范圍的測(cè)序文庫(kù)， 提高胎兒游離DNA的占比，再通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。所述方法具體包括如下步驟：
[0010] 提取孕婦血漿游離DNA;
[0011] 在孕婦血漿游離DNA的兩端添加特異性序列標(biāo)簽獲得具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血 漿游離DNA;
[0012] 對(duì)具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血漿游離DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該個(gè)體原始文庫(kù)；
[0013] 在選定的血漿游離DNA長(zhǎng)度范圍內(nèi)，對(duì)獲得的個(gè)體原始文庫(kù)中的DNA進(jìn)行回收，獲 得用于高通量測(cè)序的回收文庫(kù);或
[0014] 將多個(gè)不同孕婦個(gè)體的所述個(gè)體原始文庫(kù)進(jìn)行混合，獲得混合文庫(kù)，并在選定的 長(zhǎng)度范圍內(nèi)，對(duì)混合文庫(kù)中的DNA進(jìn)行回收，獲得用于高通量測(cè)序的回收文庫(kù)。
[0015] 進(jìn)一步的，所述特異性序列標(biāo)簽包括基于半導(dǎo)體測(cè)序法的Ion Torrent平臺(tái)的接 頭、引物和Ilhimina平臺(tái)的接頭、引物。
[0016] 進(jìn)一步的，所述Ion Torrent平臺(tái)的接頭包括：
[0017] Pl接頭和A接頭；
[001引 Pl接頭序列；
[0019] 5 '―CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3 '3 '―T*T* GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5 '；
[0020] A接頭序列：
[0021] 5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'
[0022] 3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'；
[0023] 其中 N為A、C、G或 T;
[0024] 所述Ion Torrent平臺(tái)的PCR擴(kuò)增引物序列包括Pl引物序列和A引物序列，
[0025] Pl引物序列：
[00%] CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT;
[0027] A引物序列：
[0028] CCATCTCATCCCTGCGTGTC。
[0029] 進(jìn)一步的，所述111皿ina平臺(tái)的接頭為：
[0030] 接頭序列：
[0031] TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
[0032] GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG；
[0033] 所述111皿ina平臺(tái)的引物為：
[0034] PCR引物序列：
[0035] 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC
[0036] 5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG，
[0037] 其中 N為A、C、G或 T。
[0038] 進(jìn)一步的，所述選定的血漿游離DNA長(zhǎng)度范圍為120-14化P。
[0039] 進(jìn)一步的，所述混合為等質(zhì)量混合，所述多個(gè)孕婦個(gè)體的數(shù)量?jī)?yōu)選為5個(gè)。
[0040] 進(jìn)一步的，所述回收為使用E-Gel貨瓊脂糖凝膠電泳W(wǎng)及具有同等功能的DNA片段 回收設(shè)備進(jìn)行回收。
[0041 ]本發(fā)明所述方法的有益效果如下：
[0042] 1.本發(fā)明所述方法能夠顯著提高孕婦外周血胎兒游離DNA含量占比，由于孕婦外 周血游離DNA分布范圍廣(75-25化P)，但是胎兒游離DNA的分布主要集中在15化pW下，致使 產(chǎn)生較多無(wú)效測(cè)序數(shù)據(jù);本發(fā)明首先是針對(duì)孕婦外周血游離DNA添加特異性序列標(biāo)簽，然后 進(jìn)行PCR擴(kuò)增達(dá)到一定量的積累，獲得原始文庫(kù)，原始文庫(kù)再進(jìn)行文庫(kù)固定DNA長(zhǎng)度范圍回 收，獲得回收文庫(kù)，回收的文庫(kù)胎兒游離DNA片段長(zhǎng)度為120-14化P，回收文庫(kù)與原始文庫(kù)上 機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)分析比較，前者比后者胎兒游離DNA含量占比提高1.7-3.2倍;研究表明，胎兒游 離DNA含量占比在3.5 % W上時(shí)，僅需要=百萬(wàn)測(cè)序片段就可作為準(zhǔn)確檢測(cè)樣本，而通過本 發(fā)明文庫(kù)回收，可使胎兒游離DNA片段含量占比在3.5% W上，運(yùn)使得測(cè)序數(shù)據(jù)量由原來(lái)的 五百萬(wàn)測(cè)序片段降低為=百萬(wàn)測(cè)序片段，可顯著提高一次上機(jī)測(cè)序樣本通量，可提高60% 的檢測(cè)通量。
[0043] 2.本發(fā)明所述方法能夠?qū)μ河坞xDNA含量過低的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。常規(guī)的 NIPT檢測(cè)對(duì)胎兒游離DNA含量占比在3%的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，而通過片段回收文庫(kù)樣本進(jìn)行 上機(jī)測(cè)序，可W將胎兒游離DNA含量占比提高到5% W上，從而可W準(zhǔn)確檢測(cè)。
[0044] 3.本發(fā)明所述方法能夠提高一次上機(jī)測(cè)序反應(yīng)通量。根據(jù)胎兒DNA占比提高倍數(shù) (1.7-3.2倍），可將檢測(cè)通量提高60 %，從而降低檢測(cè)成本，更加有利于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的大 規(guī)模推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1本發(fā)明所述方法的實(shí)驗(yàn)流程圖；
[0046] 圖2為原始文庫(kù)Agilent 2100bioanalyze;r檢測(cè)的片段分布圖；
[0047] 圖3為本發(fā)明回收文庫(kù)Agilent 210化ioanalyzer檢測(cè)的片段分布圖；
[004引圖4為本發(fā)明DNA片段回收的實(shí)驗(yàn)過程圖；
[0049] 圖5為15個(gè)原始文庫(kù)(半導(dǎo)體測(cè)序法)一次性上機(jī)測(cè)序檢測(cè)結(jié)果圖；
[0050] 圖6為本發(fā)明30個(gè)孕婦外周血樣本的回收文庫(kù)(半導(dǎo)體測(cè)序法)一次性上機(jī)測(cè)序檢 測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明方法W及流程，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做 進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施例均使用半導(dǎo)體測(cè)序法Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)。
[0052] 本發(fā)明所述的原始文庫(kù)是指對(duì)提取的孕婦血漿游離DNA兩端添加特異性序列標(biāo)簽 并經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的文庫(kù)。
[0053] 本發(fā)明所述的回收文庫(kù)是指對(duì)原始文庫(kù)或混合文庫(kù)進(jìn)行指定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的DNA片 段回收獲得的文庫(kù)。
[0化4] 實(shí)施例1
[0055] 不同數(shù)量原始文庫(kù)混合測(cè)序數(shù)據(jù)量比較
[0056] 實(shí)驗(yàn)方法
[0057] 1.采集54例孕婦血漿樣本并進(jìn)行游離DNA提取
[0化引（1)用抓TA抗凝采血管抽取孕齡為12-24周的孕婦靜脈血5ml，將抽完血的抓TA抗 凝采血管在4°C條件下，1600 Xg離屯、IOmin;吸取全部的上層血漿分裝于2ml離屯、管中，將第 一次離屯、分離得到的血漿在常溫條件下，leOOOXg離屯、lOmin，小屯、吸取第二次離屯、得到的 上層血漿于新的離屯、管中，用于游離DNA提??；
[0059] (2)吸取60化1經(jīng)過兩次離屯、的血漿樣品于新的2ml離屯、管中；
[0060] (3)向60化1 血漿中依次加入1000 iil Lysis Buffer，60iU Magnetic beads,3化 1 Proteinase K，14]il Ac巧I Carrier,震蕩，上下顛倒混勻IOmin后，置磁力架上靜置4min， 澄清后棄去管內(nèi)液體，取下離屯、管；
[0061 ] (4)向上一步的離屯、管中加入50化1 Wash Buffer I后混勻溶液，重懸磁珠，置磁 力架上靜置4min，吸附完全后，保留磁珠在離屯、管內(nèi)，將澄清液體棄去；
[0062] (5)向上一步的離屯、管中加入5(K)山Wash Buffer II，重懸磁珠，置磁力架上靜置 4min，吸附完全后，保留磁珠在離屯、管內(nèi)，將澄清液體棄去；
[0063] (6)向上一步的離屯、管中加入55化1 Wash Buffer III，盡量不要沖起磁珠，30s 后，置磁力架上靜置4min，保留磁珠在離屯、管內(nèi)，將澄清液體棄去；
[0064] (7)將上一步的離屯、管保持敞開狀態(tài)，室溫靜置2min，待管內(nèi)液體揮發(fā)干凈；
[00化](8)向上一步的離屯、管中加入35]il事先在60°C預(yù)熱的Elution Buffer,置于60°C 條件下重懸磁珠IOmin，期間輕輕晃蕩兩次充分洗脫，不要把液體彈到管壁上；
[0066] (9)將步驟(8)中在60°C反應(yīng)完的離屯、管置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后， 將溶液即提取出游離DNA的溶液吸到新的離屯、管內(nèi)即完成對(duì)血漿中游離DNA的提取，使用化 1含有游離DNA的溶液進(jìn)行Qubit定量檢測(cè)，經(jīng)Qubit定量檢測(cè)質(zhì)量合格的血漿游離DNA用于 下一步的文庫(kù)制備。
[0067] 2.文庫(kù)制備
[0068] 用提取到的血漿游離DNA構(gòu)建原始文庫(kù)，原始文庫(kù)構(gòu)建需要3步酶促反應(yīng)(末端修 復(fù)、連接反應(yīng)和PCR反應(yīng)）；每位孕婦的血漿游離DNA構(gòu)建一個(gè)原始文庫(kù)。
[0069] 1)末端修復(fù)
[0070] 取30化提取出的含游離DNA的溶液于1.5mL的離屯、管中，向管中加入表1中的試劑：
[0071] 表1
[0072]
[0073] 將離屯、管室溫靜置30min之后，加入Agencou;rt Ampure XP Beads 7扣1，進(jìn)行磁珠 純化，純化得32iU末端修復(fù)產(chǎn)物進(jìn)行下一步反應(yīng)；
[0074] 2)連接反應(yīng)
[0075] 在上一步純化得到的末端修復(fù)產(chǎn)物中加入表2中的試劑：
[0076] 表 2
[0077]
[0078] 特異性接頭X有30種，各自的序列如表3所示：[0079] 表 3
[0080]
[0081]
[0082] 將離屯、管室溫靜置30min之后，加入Agencou;rt Ampure XP Beads 7扣1，進(jìn)行磁珠 純化，純化得15iU接頭連接產(chǎn)物；
[0083] 3)PCR 反應(yīng)
[0084] 取部分上一步純化得到的接頭連接產(chǎn)物于0.2mL的PCR管中，并加入表4中的試劑：
[0085] 表 4
[0086]
[0087]
[008引
[0089]
[0090] PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR管中的液體轉(zhuǎn)移到I. 5mL的離屯、管中，向離屯、管中加入 Agencoud Ampure XP Beads 9化1，進(jìn)行磁珠純化，獲得25]il原始文庫(kù)，使用化1原始文庫(kù) 樣本進(jìn)行Qubit定量及Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)，合格的原始文庫(kù)片段范圍分布應(yīng)如 圖2所示，文庫(kù)的片段主峰應(yīng)該在26化P左右，副峰較小。
[0091 ] 3.原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0092] 對(duì)每位孕婦血漿游離DNA構(gòu)建的原始文庫(kù)進(jìn)行Qubit定量及在Agilent 2100生物 分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的原始文庫(kù)用于后續(xù)的測(cè)序，采用Ion Torrent測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行 測(cè)序，通過生物信息學(xué)的方法分析測(cè)序結(jié)果，計(jì)算每個(gè)原始文庫(kù)中胎兒游離DNA的含量占 比。
[0093] 4.文庫(kù)片段回收
[0094] 隨機(jī)挑選2個(gè)合格的原始文庫(kù)按照等質(zhì)量比進(jìn)行混合形成混合文庫(kù)，使用 E-Gei飯瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合文庫(kù)中的120-14化P的DNA片段進(jìn)行回收，回收的DNA片段 組成回收文庫(kù)，對(duì)回收文庫(kù)使用Agilent 2100生物分析儀W及如Cr定量方法進(jìn)行文庫(kù)質(zhì) 檢，Qpcr 定量試劑盒為KAPA Library Quantification Kits(for Ion Torrent platform)，本實(shí)施例中，還進(jìn)行了3個(gè)、4個(gè)…10個(gè)原始文庫(kù)的等質(zhì)量比混合，并對(duì)運(yùn)些混合 文庫(kù)進(jìn)行了120-140bp長(zhǎng)度范圍內(nèi)的DNA回收，獲得了相應(yīng)的回收文庫(kù)，圖4為從E-Gel電泳 系統(tǒng)回收的實(shí)驗(yàn)過程展示；圖3為對(duì)由5個(gè)原始文庫(kù)混合形成的回收文庫(kù)進(jìn)行生物分析，分 析的結(jié)果表明構(gòu)建的回收文庫(kù)合格。
[00M] 5.回收文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0096] 對(duì)構(gòu)建的每個(gè)回收文庫(kù)，采用Ion Torrent測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，通過生物信息學(xué)的 方法分析測(cè)序結(jié)果，計(jì)算回收文庫(kù)中胎兒游離DNA的含量占比。
[0097] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0098] 利用高通量測(cè)序技術(shù)，表6中為步驟3中的原始文庫(kù)測(cè)序結(jié)果和步驟5中回收文庫(kù) 的測(cè)序結(jié)果。
[0099] 測(cè)序數(shù)據(jù)分析比較結(jié)果表明，由5個(gè)隨機(jī)挑選的原始文庫(kù)按質(zhì)量比1:1:1:1:1的比 例進(jìn)行混合制備成的混合文庫(kù)，經(jīng)過DNA片段回收獲得的回收文庫(kù)，和每個(gè)原始文庫(kù)測(cè)序結(jié) 果一致，各個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)在五百萬(wàn)左右，結(jié)果最均一；由5個(gè)W上的隨機(jī)挑選的原始文庫(kù) 形成的回收文庫(kù)，出現(xiàn)測(cè)序數(shù)據(jù)不均一的現(xiàn)象(表6中的黑色斜體數(shù)據(jù)為測(cè)序數(shù)據(jù)偏多或偏 少的樣本）；由5個(gè)W下的隨機(jī)挑選的原始文庫(kù)混合可W達(dá)到與每個(gè)原始文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)均一 的效果，但是未能實(shí)現(xiàn)試劑的合理利用。因此，選擇5個(gè)隨機(jī)挑選的原始文庫(kù)按等質(zhì)量比混 合制備成一個(gè)混合文庫(kù)，再進(jìn)行固定范圍內(nèi)的DNA片段回收，是較優(yōu)的選擇。
[0100] 表6
[0101]
[i
[0103] 實(shí)施例2
[0104] 使用高通量測(cè)序技術(shù)及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)根據(jù)本發(fā)明方法構(gòu)建的孕婦血漿游離DNA 原始文庫(kù)及回收文庫(kù)中胎兒游離DNA含量占比的分析比較
[0105] 實(shí)驗(yàn)方法
[0106] 1.血漿樣本制備及DNA提取
[0107] 收集14例經(jīng)檢測(cè)懷有男胎的孕婦外周血樣本，按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行血漿分 離及游離DNA提取，使用Iul含有游離DNA的溶液樣本進(jìn)行Qubit定量檢測(cè)，檢測(cè)合格的血漿 游離DNA進(jìn)行下一步文庫(kù)制備。
[010引 2.文庫(kù)制備
[0109] 同實(shí)施例1中的文庫(kù)制備。
[0110] 3.原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0111] 同實(shí)施例1中的原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析。
[0112] 4.文庫(kù)片段回收
[0113] 隨機(jī)挑選5個(gè)經(jīng)過定量合格的原始文庫(kù)進(jìn)行混合，按照1:1:1:1:1的質(zhì)量比將5個(gè) 原始文庫(kù)制備成1個(gè)混合文庫(kù)，使用E-Gel⑧瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合文庫(kù)中的120 -14化P的 DNA片段進(jìn)行回收，回收的DNA片段組成回收文庫(kù)，對(duì)回收文庫(kù)使用Agilent 2100生物分析 儀W及如Cr定量方法進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，Qpcr定量試劑盒為KAPA Library Quantification Kits(for Ion Torrent platform); 14例孕婦血漿樣本構(gòu)建14個(gè)原始文庫(kù)，運(yùn)14個(gè)原始文 庫(kù)按照上述方法混合出對(duì)應(yīng)的回收文庫(kù)。
[0114] 5.回收文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0115] 將第4步中獲得的回收文庫(kù)，采用Ion Torrent測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行回收文庫(kù)樣本上機(jī)測(cè) 序，通過生物信息學(xué)的方法分析測(cè)序結(jié)果。
[0116] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0117] 利用高通量測(cè)序技術(shù)，表7為步驟3中的原始文庫(kù)測(cè)序結(jié)果和步驟5中的回收文庫(kù) 的測(cè)序結(jié)果，數(shù)據(jù)分析比較結(jié)果表明，回收文庫(kù)比相應(yīng)的原始文庫(kù)中的胎兒游離DNA含量占 比提局1.7-3.2倍，平均可提局2.44倍左右。
[011引表7.
[0119]
[0120] 表7中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明針對(duì)血漿游離DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到一定量的積累 再進(jìn)行DNA回收能夠滿足高通量測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量要求，可顯著提高胎兒游離DNA含量占比。
[0121] 實(shí)施例3
[0122] 本發(fā)明方法對(duì)孕婦血漿中不同含量占比的胎兒游離DNA檢測(cè)靈敏性
[0123] 實(shí)驗(yàn)方法
[0124] I.血漿樣本制備及游離DM提取
[0125] 收集經(jīng)測(cè)序，已知懷核型為21號(hào)染色體=體、男性胎兒的孕婦血漿樣本，且前期已 經(jīng)通過高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了血漿中胎兒游離DNA的含量，使用該已知胎兒DNA含量的血漿 樣本和未懷孕的血漿樣本進(jìn)行不同比例的血漿混合，制備胎兒游離DNA含量占比分別為 2%、3%、4%、5%和10%的混合血漿?；旌涎獫{制備見下表8:
[0126] 表8
[0127]
[0129」對(duì)表8混合巧的血漿孩脫實(shí)施例1中的提取萬(wàn)巧進(jìn)行游離DNA提取，使用1山曾有游 離DNA的溶液樣本進(jìn)行如bit定量檢測(cè)，檢測(cè)合格的血漿游離DNA進(jìn)行下一步的文庫(kù)制備。
[0130] 2.文庫(kù)制備
[0131] 同實(shí)施例1中的文庫(kù)制備。
[0132] 3.原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0133] 同實(shí)施例1中的原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析。
[0134] 4.文庫(kù)片段回收
[0135] 同實(shí)施例2中的文庫(kù)片段回收。
[0136] 5.回收文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0137] 同實(shí)施例1中的回收文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析。
[013引實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0139] 如表9所示，使用高通量測(cè)序檢測(cè)方法，對(duì)胎兒游離DNA含量占比低于2%的原始文 庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏性為0%，假陰性率為100%，而按照本發(fā)明方法將原始文庫(kù)混合后 再進(jìn)行回收，則回收后的文庫(kù)的檢測(cè)靈敏性為100%，假陰性率為0。
[0140] 表9
[01411
[0142] 表9中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明針對(duì)文庫(kù)片段選定范圍回收，可準(zhǔn)確檢測(cè)原始文庫(kù) 中胎兒游離DNA含量低至2%的孕婦外周血樣本。
[0143] 實(shí)施例4
[0144] 不同樣本數(shù)量同時(shí)檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性比較(15個(gè)和30個(gè)樣本通量）
[0145] 實(shí)驗(yàn)方法
[0146] 1.血漿樣本制備及游離DNA提取
[0147] 收集30例經(jīng)唐篩檢測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦外周血樣本，按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行血 漿分離及游離DNA提取，使用Iul含有游離DNA的溶液樣本進(jìn)行Qubit定量檢測(cè)，檢測(cè)合格的 血漿游離DNA進(jìn)行下一步文庫(kù)制備。
[014引 2.文庫(kù)制備
[0149] 同實(shí)施例1中的文庫(kù)制備。
[0150] 3.原始文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[0151] 經(jīng)過Qubit檢測(cè)后的原始文庫(kù)采用Ion Torrent測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行文庫(kù)樣本上機(jī)測(cè)序， 每次上機(jī)測(cè)序同時(shí)檢測(cè)15個(gè)原始文庫(kù)，通過生物信息學(xué)的方法分析測(cè)序結(jié)果。圖5為15個(gè)孕 婦血漿游離DNA構(gòu)建的15個(gè)原始文庫(kù)同時(shí)檢測(cè)的測(cè)序結(jié)果圖。
[0152] 4.文庫(kù)片段回收
[0153] 將30個(gè)經(jīng)過定量合格的原始文庫(kù)進(jìn)行混合，按照等質(zhì)量比將隨機(jī)挑選的5個(gè)原始 文庫(kù)混合制備成1個(gè)混合文庫(kù)，30個(gè)原始文庫(kù)共制備出6個(gè)混合文庫(kù)，使用E-Gel戚瓊脂糖 凝膠電泳對(duì)混合文庫(kù)中的120 -14化P的DNA片段進(jìn)行回收，回收的DNA片段組成回收文庫(kù)，對(duì) 回收文庫(kù)使用Agilent 2100生物分析儀W及如Cr定量方法進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，化Cr定量試劑盒 為KAPA Library Quantification Kits(for Ion Torrent platform)。
[0154] 5.回收文庫(kù)上機(jī)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
[01巧]將第4步中獲得的6個(gè)回收文庫(kù)，采用Ion Torrent測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行回收文庫(kù)樣本上 機(jī)測(cè)序，并通過生物信息學(xué)的方法分析測(cè)序結(jié)果。圖6為6個(gè)回收文庫(kù)一次測(cè)序的測(cè)序結(jié)果 圖。
[0156] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0157] 利用高通量測(cè)序技術(shù)，表10為步驟3中的原始文庫(kù)測(cè)序結(jié)果和步驟5中的回收文庫(kù) 的測(cè)序結(jié)果，結(jié)果顯示13、18和21號(hào)染色體Z值均在【-3,3】的范圍，即沒有異常出現(xiàn);運(yùn)說(shuō)明 回收文庫(kù)將樣本通量提高對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度沒有影響。
[015引 表10
[01 Wl [0
[0161] 表10中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明方法使用的回收文庫(kù)可W將樣本通量提高為30個(gè) 孕婦外周血樣本，進(jìn)而降低樣本測(cè)序成本。
[0162] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì) 本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可 W做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，運(yùn)里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予W窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高孕婦血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)中胎兒游離DNA占比的方法，其特征在于，該方 法包括如下步驟： 1) 提取孕婦血漿游離DNA; 2) 在孕婦血漿游離DNA的兩端添加特異性序列標(biāo)簽獲得具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血漿 游離DNA; 3) 對(duì)具有孕婦個(gè)體識(shí)別標(biāo)記的血漿游離DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該個(gè)體原始文庫(kù)； 4) 在選定的血漿游離DNA長(zhǎng)度范圍內(nèi)，對(duì)步驟3)獲得的個(gè)體原始文庫(kù)中的DNA進(jìn)行回 收，獲得用于高通量測(cè)序的回收文庫(kù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟4)進(jìn)一步包括將多個(gè)不同孕婦個(gè) 體的所述個(gè)體原始文庫(kù)進(jìn)行混合，獲得混合文庫(kù)，并在選定的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，對(duì)混合文庫(kù)中的 DNA進(jìn)行回收，獲得用于高通量測(cè)序的回收文庫(kù)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟2)所述特異性序列標(biāo)簽包括基于 半導(dǎo)體測(cè)序法的Ion Torrent平臺(tái)的接頭、引物和Illumina平臺(tái)的接頭、引物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述Ion Torrent平臺(tái)的接頭包括： P1接頭和A接頭；其中N為A、C、G或T; 所述Ion Torrent平臺(tái)的PCR擴(kuò)增引物序列包括P1引物序列和A引物序列， P1引物序列： CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT； A引物序列： CCATCTCATCCCTGCGTGTC。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于;所述11 lumina平臺(tái)的接頭為：其中N為A、C、G或T。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述選定的血漿游離DNA長(zhǎng)度范圍為 120-140bp〇7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述混合為等質(zhì)量混合，所述多個(gè)孕婦個(gè) 體的數(shù)量?jī)?yōu)選為5個(gè)。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述回收為使用E_Ge丨扎瓊脂糖凝膠電 泳以及具有同等功能的DNA片段回收設(shè)備進(jìn)行回收。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK105926043SQ201610243399
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日
【發(fā)明人】梁波, 孔令印, 申靜靜, 冒燕, 宣黎明, 劉慧敏
【申請(qǐng)人】蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司