抑制lncRNA用于治療黑素瘤的制作方法
【專利說(shuō)明】抑制IncRNA用于治療黑素瘤 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)?jiān)O(shè)及癌癥領(lǐng)域，具體地設(shè)及黑素瘤領(lǐng)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與黑素細(xì)胞相比，在黑 素瘤(而非其它腫瘤）中，一種特定的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(IncRNA)特異地上調(diào)。在黑素瘤細(xì)胞中 抑制該IncRNA可W導(dǎo)致調(diào)亡的誘導(dǎo)，是黑素瘤醫(yī)治中的一種新的治療策略。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 皮膚惡性黑素瘤是導(dǎo)致皮膚癌相關(guān)死亡的主要原因。其發(fā)生率在全世界范圍增加 得比任何其它癌癥都要快，該病對(duì)于患有遠(yuǎn)距離腫瘤轉(zhuǎn)移疾病的患者來(lái)說(shuō)，5年存活率不到 20%。改善運(yùn)種具有侵略性、抵抗化療和放療的疾病的臨床治療結(jié)果一直是一個(gè)重大的臨 床挑戰(zhàn)。然而，人們?cè)诹私夂谒亓龅牟∫驅(qū)W和遺傳基礎(chǔ)上取得了顯著的進(jìn)展。運(yùn)些進(jìn)展最近 導(dǎo)致在對(duì)該疾病祀向治療的測(cè)試中獲得了滿意的效果。Ras/Raf/MEK/E服通路已經(jīng)被鑒定 為黑素瘤中細(xì)胞增殖的主要調(diào)控因子，在多達(dá)90%的人黑素瘤中，ERK被過(guò)度激活?；钚?NRAS突變是激活該通路的常見(jiàn)途徑;影響第61位密碼子的突變(NRASQ61K)最為普遍。作為3 個(gè)人類RAF基因之一的BRAF也常在黑素瘤中發(fā)生突變，最普遍的突變是在第600位上谷氨酸 對(duì)鄉(xiāng)氨酸的替換(V600E)dBRAFV600E刺激組成型E服信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致黑素細(xì)胞過(guò)度增殖。使 用新的1類RAF選擇性抑制劑化X4032的早期臨床經(jīng)驗(yàn)顯示了在患BRAFV600E陽(yáng)性黑素瘤的 患者中前所未有的80%的抗腫瘤反應(yīng)率;不幸的是，患者在最初反應(yīng)的幾個(gè)月內(nèi)獲得抗藥 性，目前研究者在研究與MEK抑制劑的組合療法。
[0004] 主要由p53基因自身的失活性突變或等位基因丟失導(dǎo)致的p53通路失活是人類癌 癥最普遍的分子缺陷。令人感興趣的是，在超過(guò)95%的黑素瘤病例中，p53座位完整無(wú)缺，從 而對(duì)黑素瘤腫瘤形成的病因?qū)W中p53的致病相關(guān)性產(chǎn)生疑問(wèn)。同時(shí)，有越來(lái)越多的證據(jù)支持 p53在黑素瘤形成中的相關(guān)作用。p53缺失與BRAFV600E及活化HRASV12G的黑素細(xì)胞特異性 過(guò)量表達(dá)協(xié)同促進(jìn)小鼠中黑素瘤的產(chǎn)生，而致癌性NRAS與p53缺失協(xié)同在斑馬魚中產(chǎn)生黑 素瘤。保持了野生型p53表達(dá)的癌癥?？蒞發(fā)現(xiàn)替代途徑來(lái)破壞p53的功能，運(yùn)可通過(guò)上游 調(diào)節(jié)因子的失調(diào)和/或下游效應(yīng)子的失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。MDM2是編碼控制p53水平和功能19的E3泛 素連接酶，其在人黑素瘤中（但僅在3%-5%的有記錄的病例中）擴(kuò)增。最近，MDM4上調(diào)也被 鑒定為人黑素瘤中p53功能受損的關(guān)鍵決定因子。
[0005] 其它可W成為治療性干預(yù)的祀標(biāo)的通路有經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和/或由黑素細(xì)胞 譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子MITF調(diào)控的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。MITF誘導(dǎo)基因表達(dá)模式，該表達(dá)模式通過(guò)激活 黑色素生物合成中的重要基因（例如Mclr ,Tyr ,Dct和化P-I)和黑素體形成中的重要基因 (例如化el)，促進(jìn)黑素細(xì)胞分化和起始色素產(chǎn)生。重要的是，M口F水平和/或其轉(zhuǎn)錄活性的 失調(diào)對(duì)黑素瘤的發(fā)生具有貢獻(xiàn)。據(jù)此提出了MITF作用的變阻器模型，其中MITF的較高表達(dá) 與增殖相關(guān)，而較低的MITF水平與轉(zhuǎn)移/入侵及衰老相關(guān)。在10-20%的轉(zhuǎn)移性黑素瘤中發(fā) 現(xiàn)的MITF擴(kuò)增/過(guò)量表達(dá)，與5年存活率的降低相關(guān)。MITF的一個(gè)關(guān)鍵的促致癌作用設(shè)及其 能夠通過(guò)促進(jìn)抗調(diào)亡基因8化-2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)黑素瘤生存。Wnt/e-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)直接調(diào) 控MITF的表達(dá)，Wnt/e-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組成型激活可W增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞的增殖(伴隨著 MITF依賴性的產(chǎn)克隆生長(zhǎng)的增加），提示該通路是黑素瘤發(fā)展的促進(jìn)因子。
[0006] 由于其獲得抗藥性的能力、其化學(xué)抗性，也因?yàn)楹谒亓鍪且环N高度變化和遺傳上 異質(zhì)的腫瘤，迫切需要新的治療策略和組合療法。事實(shí)上已經(jīng)有幾個(gè)針對(duì)黑素瘤的編碼蛋 白質(zhì)的治療祀標(biāo)被鑒定出來(lái)，包括MAP激酶通路的組分，例如BRAFV600E、MEK W及p53通路的 調(diào)節(jié)子MDM4。然而，運(yùn)些分子的祀向仍僅適用于有限數(shù)量的病例(例如，對(duì)抗攜帶BRAFV600E 突變或過(guò)量表達(dá)MDM4并含有野生型TP53的腫瘤）。
[0007] 找到不限于一小部分病例或依賴于特定突變存在的新型祀標(biāo)，將是有利的。此外， 如果運(yùn)些祀標(biāo)特異針對(duì)黑素瘤細(xì)胞壞存在于黑素細(xì)胞中）將是有利的，由此它們的抑制將 導(dǎo)致選擇性殺死黑素瘤細(xì)胞。 發(fā)明概要
[0008] 作為最致命的人類癌癥之一，黑素瘤在原發(fā)性腫瘤的體積小至1立方毫米時(shí)就能 夠進(jìn)行遠(yuǎn)距離和致命的轉(zhuǎn)移。目前，缺少便于檢測(cè)良性和惡性黑素細(xì)胞壞死間的差異和有 助于預(yù)知其生物學(xué)行為的分子標(biāo)記。
[0009] 此外，目前對(duì)于轉(zhuǎn)移性黑素瘤沒(méi)有有效的長(zhǎng)期治療方法。黑素瘤由激活有絲分裂 原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變（即服AFV600E，NRASQ6化)驅(qū)動(dòng)。MEK或E服的失活對(duì) 于殺死黑素瘤細(xì)胞非常有效，不幸的是，許多正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存也依賴于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)，從而使得肥1(和6服抑制劑對(duì)患者具有非常大的毒性。
[0010] 祀向活化的BRAFV600E可W導(dǎo)致前所未有的、顯著的和快速的腫瘤消退，該情形在 幾個(gè)月后重新惡化，并由于激活其它因子中的突變而具有抗性，其中所述突變導(dǎo)致可W繞 開MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)活化BRAF的需要?？蒞避開因祀向MAPK通路的特定組分而引起的遺傳 抗性和與正常細(xì)胞中MAPK失活相關(guān)的毒性的一個(gè)可替代策略，是鑒定僅作用于黑素瘤細(xì)胞 (而不作用于正常細(xì)胞)且獨(dú)立于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活方式的療法。
[0011] 本文描述了一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄自LINCOl212 aka RPll-460N16.1基因，在絕大多數(shù)的黑素瘤中表達(dá)(不在正常/非轉(zhuǎn)化的黑素細(xì)胞或其它腫瘤類型 中表達(dá)），且不管MAP激酶如何被激活(BRAF或NRAS突變或MEK激活）W及TP53是野生型還是 突變的，其都對(duì)黑素瘤細(xì)胞的生存是必需的。
[0012] 敲低化D)該IncRNA可W誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞調(diào)亡而不依賴于TP53的狀態(tài)（運(yùn)與例如 MDM4的治療性抑制形成對(duì)照，后者僅在TP53為野生型時(shí)才能成功)且不依賴于MAP激酶通路 如何被激活。
[0013] 不束縛于特別的機(jī)制，可W看出，LINC01212 KD導(dǎo)致經(jīng)典Wnt通路的關(guān)鍵組分MITF (及其一些祀標(biāo)例如DCT、TYRP1)及MEKl和MEK2的下調(diào)，伴隨著p53/p63信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激 活、W及關(guān)鍵的促調(diào)亡/腫瘤抑制子p53/p63祀標(biāo)例如BAX、APAF-1、PUMA、GADD45A或PERP的 表達(dá)誘導(dǎo)。
[0014] 運(yùn)為治療黑素瘤W及那些不具有例如BRAF V600E突變特征的黑素瘤提供了巨大 潛力。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是，提供LINCO1212基因功能性表達(dá)的抑制劑。運(yùn)種抑制劑可W 在DNA水平或在RNA(即基因產(chǎn)物)水平上起作用。由于LINC01212是非編碼基因，該基因沒(méi)有 蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0016] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供LINC01212功能性表達(dá)的抑制劑用作藥物。根據(jù)另一個(gè)方 面，提供LINC01212功能性表達(dá)的抑制劑用于治療癌癥，尤其是皮膚癌(例如BCC、SCC)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，提供抑制劑用于治療黑素瘤。
[0017] 運(yùn)等于說(shuō)是提供了治療有需要的受試者的黑素瘤的方法，該方法包括對(duì)所述受試 者施用LINC01212功能性表達(dá)的抑制劑。
[0018] 抑制劑的性質(zhì)對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不重要，只要它抑制LINC01212基因的功能性表達(dá) 即可。根據(jù)特定的實(shí)施方案，抑制劑選自旨曰91116'、3111?熱、311?熱^1?18?1?^41^6曬^鋒指核酸 酶。
[0019] 根據(jù)可選但非唯一的特定實(shí)施方案，抑制劑選擇性地誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞調(diào)亡。運(yùn)特 別是指，其誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞調(diào)亡但不誘導(dǎo)非正常（非轉(zhuǎn)化的）黑素細(xì)胞調(diào)亡。根據(jù)其它特定 的實(shí)施方案，抑制劑誘導(dǎo)調(diào)亡不依賴于p53、BRAF、NRAS或MEK的狀態(tài)，例如不依賴于運(yùn)些蛋 白是否具有特定的突變，或不依賴于它們的表達(dá)水平。
[0020] 即使LINC01212的抑制足W實(shí)現(xiàn)治療效果，即實(shí)現(xiàn)癌癥細(xì)胞的調(diào)亡，本文顯示，當(dāng) 施用LINC01212的抑制劑與其它化療劑時(shí)，可W獲得更強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。運(yùn)對(duì)于B-raf激酶抑 制來(lái)說(shuō)尤其如此。
[0021] 根據(jù)另一個(gè)方面，提供了可鑒別腫瘤是否適于WLINC01212功能性表達(dá)的抑制劑 治療的方法。運(yùn)些方法通常具有W下步驟：
[0022] -測(cè)定腫瘤或腫瘤細(xì)胞樣品中LINC01212的表達(dá)是否增加；
[0023] -確立腫瘤是否適于治療，其中增加的表達(dá)是治療適宜性的指示。
[0024] 表達(dá)的增加通常是與合適的對(duì)照的比較，所述對(duì)照例如對(duì)照細(xì)胞群體，諸如但不 限于皮膚細(xì)胞或非轉(zhuǎn)化的黑素細(xì)胞。值得注意的是，如果對(duì)照不表達(dá)LINC01212,則只要樣 品中存在LINCO1212 RNA就相當(dāng)于增加的表達(dá)。
[0025] 因此，運(yùn)些方法可能需要提供腫瘤細(xì)胞樣品的第一步驟。測(cè)定步驟可W完全在體 外進(jìn)行，即，沒(méi)有在人或動(dòng)物身體上相互作用的步驟。
[0026] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，腫瘤是黑素瘤。
[0027] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，在確定腫瘤適于治療后，方法還可W包括對(duì)存在腫瘤的受 試者施用LINCO1212功能性表達(dá)抑制劑的步驟，W治療腫瘤。
[0028] 本文還提供了在受試者中診斷黑素瘤的存在的方法，包括W下步驟：
[0029] -測(cè)定所述受試者的樣品中LINC01212的水平；
[0030] -將所述樣品中LINC01212的水平與黑素瘤的存在相關(guān)聯(lián)。
[0031] 在該方法中，LINC01212的存在(或增加的表達(dá))指示，樣品所取自的受試者存在黑 素瘤。，盡管不一定要排除體內(nèi)的方法，但典型地運(yùn)些方法在體外進(jìn)行。通常通過(guò)測(cè)定所述 樣品中LINCO1212 RNA的水平來(lái)確定LINCO1212的水平。
[0032] 樣品可W是組織樣品（例如皮膚biopt)，但是，如本文中示，在黑素瘤患者中， LINC01212也在血液中循環(huán)。因此，也可W在血液或血清中檢測(cè)LINC01212,由此，樣品可W 是血液樣品或血清樣品。
[0033] LINC01212 RNA的水平隨著疾病的不同階段而變化（圖6)。因此，在確定黑素瘤存 在的方法中，可W包括另外的步驟，該步驟將LINC01212的水平與疾病的嚴(yán)重程度、疾病階 段(例如黑素瘤階段)或疾病進(jìn)展關(guān)聯(lián)起來(lái)。
[0034] 附圖簡(jiǎn)述
[0035] 圖I顯示MITF座位下游LINC01212基因的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的arrayCGH分析。
[0036] 圖2:不同細(xì)胞系中LINC01212基因的表達(dá)分析，突出了黑素瘤細(xì)胞系和正常的人 表皮黑素細(xì)胞(NHEM)。
[0037] 圖3:LINC01212表達(dá)的長(zhǎng)同種型的熱圖，基于來(lái)自TCGA的>200個(gè)人黑素瘤樣品的 RNA-se