一種觀察不同生理狀態(tài)pc12細(xì)胞之間相互影響的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種觀察不同生理狀態(tài)PCl 2細(xì)胞之間相互影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境是保持細(xì)胞正常增殖、分化、代謝和功能活動(dòng)的重要條件。細(xì)胞對(duì)外界的微環(huán)境非常敏感，在同一共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞之間或細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的直接接觸可以影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。近幾十年來(lái)，在放射生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)，當(dāng)少數(shù)細(xì)胞受到射線照射時(shí)，沒有受到射線直接照射的周圍細(xì)胞也能表現(xiàn)出一些損傷效應(yīng)。
[0003]大量研究已經(jīng)證明在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中確實(shí)存在損傷傳遞效應(yīng)。例如，慢性粒細(xì)胞白血病患兒的脾部在接受放射線照射治療時(shí)，胸骨骨髓細(xì)胞發(fā)生了損傷；局部氧化損傷可以通過(guò)GJIC在內(nèi)皮細(xì)胞之間傳遞。有人提出用腫瘤自殺基因治療腫瘤，當(dāng)部分腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因后，在藥物啟動(dòng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞自殺后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞及周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均被殺滅。近年來(lái)，有人發(fā)現(xiàn)局部氧化損傷可以通過(guò)細(xì)胞間縫隙連接通訊(GJIC)在上皮細(xì)胞間傳遞。以上所述存在著一個(gè)共同的現(xiàn)象，就是某些有害因素引起的靶細(xì)胞損傷不僅僅局限于靶細(xì)胞本身，還可以引起周圍正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷。暴露于有害因素的細(xì)胞群會(huì)出現(xiàn)明顯的生物效應(yīng)，這種效應(yīng)在暴露細(xì)胞群和周圍未暴露細(xì)胞群都會(huì)發(fā)生，這一現(xiàn)象人們稱之為旁觀者效應(yīng)(bystander effect，BE)。
[0004]旁觀者效應(yīng)是指正常細(xì)胞在直接受到有害因素?fù)p害的靶細(xì)胞誘導(dǎo)下發(fā)生的諸如細(xì)胞死亡、基因突變、染色體不穩(wěn)定等反應(yīng)，這些經(jīng)誘發(fā)而發(fā)生效應(yīng)的正常細(xì)胞成為旁觀者細(xì)胞。由于旁觀者效應(yīng)的存在，使靶細(xì)胞的損傷效應(yīng)得以延續(xù)與放大，從而使損傷明顯加重。這些研究提醒人們:機(jī)體對(duì)損傷的反應(yīng)不僅僅是單個(gè)獨(dú)立細(xì)胞或者組織，而是具有群體性。對(duì)于旁觀者效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)已有幾十年，但至今為止，旁觀者效應(yīng)的確切機(jī)制尚未闡明。越來(lái)越多研究表明，旁觀者效應(yīng)可能與縫隙連接蛋白(connexin，Cx)介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊(gap-junct1nal intercellular communicat1n，GJIC)有密切關(guān)系。
[0005]目前國(guó)外內(nèi)研究中，普遍采用對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞整體染毒，采用cBX抑制縫隙連接，在損傷細(xì)胞的情況下，檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡情況，探尋在損傷過(guò)程中的信號(hào)傳遞機(jī)制，但此種方法未能有效區(qū)分染毒與未染毒細(xì)胞。還有人通過(guò)輻射照射培養(yǎng)皿中的部分細(xì)胞，觀察未被照射細(xì)胞的凋亡情況，但這種研究方法只限于輻射暴露，未能應(yīng)用到溶于培養(yǎng)液中的化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響。如何有效區(qū)分共培養(yǎng)細(xì)胞中染毒和未染毒細(xì)胞是急需解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種觀察不同生理狀態(tài)PC12細(xì)胞之間相互影響的方法，該方法可以區(qū)分不同生理狀態(tài)細(xì)胞在同一培養(yǎng)環(huán)境下，染毒與未染毒PC12細(xì)胞的生理狀態(tài)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0008]一種觀察不同生理狀態(tài)PC12細(xì)胞之間相互影響的方法，包括以下步驟:
[0009](I)、構(gòu)建GFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCl2細(xì)胞株
[0010]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗滌后加入適量Trypsin-EDTA，消化后接種至六孔板，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)前，每孔細(xì)胞換成新鮮的HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基，每株各選取一孔細(xì)胞加入30yL的Lent1-eGFP/Neo，充分搖勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)7小時(shí)后，吸去含有Lent1-eGFP/Neo的培養(yǎng)基，換成新鮮的HD+ 10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)，構(gòu)建得到GFP-PC12；
[0011](2)、共培養(yǎng)體系建立
[0012]設(shè)置兩個(gè)共培養(yǎng)體系:一是在GFP-PC12中加入毒性因子培養(yǎng)后，將PC12與經(jīng)MPb處理的GFP-PC12按等比例混合共培養(yǎng);二是將PC12與GFP-PC12按等比例混合共培養(yǎng)，兩個(gè)培養(yǎng)體系均于37 °C共培養(yǎng)20分鐘后，用PBS沖洗細(xì)胞2?3次；
[0013](3)、共培養(yǎng)體系的ROS水平、凋亡水平、線粒體跨膜電位檢測(cè)
[0014]分別在兩個(gè)共培養(yǎng)體系中加入H0eChst33342染料進(jìn)行核復(fù)染，激光共聚焦分析細(xì)胞中ROS水平；
[0015]分別在兩個(gè)共培養(yǎng)體系中加入TMRM進(jìn)行線粒體跨膜電位檢測(cè)；
[0016]分別在兩個(gè)共培養(yǎng)體系中加入AnnexinV-PE或7-AAD進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)。
[0017]在其中一些實(shí)施例中，步驟(I)中，所述PC12細(xì)胞消化后按lX105cells/9.6cm2的密度接種至六孔板上。
[0018]在其中一些實(shí)施例中，步驟(I)中所述培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為:37°C、5%CO2、95%相對(duì)濕度。
[0019]在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中共培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20% FBS 培養(yǎng)基。
[0020]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)中細(xì)胞中的ROS水平是使用帶有350nm激發(fā)波長(zhǎng)，460nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片的熒光顯微鏡進(jìn)行分析的。
[0021]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)中AnnexinV-PE進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)時(shí)，流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em = 578nm，使用FL2通道檢測(cè)。
[0022]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)中7-AAD進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)時(shí)，流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 546nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em = 647nm，使用FL3通道檢測(cè)。
[0023]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)中所述Hoechst33342染料的濃度為50μΜ。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0025]本發(fā)明的觀察不同生理狀態(tài)PC12細(xì)胞之間相互影響的方法將醋酸鉛染毒細(xì)胞與未染毒細(xì)胞直接接觸混合共培養(yǎng)后，加入不同的染料，由于染毒細(xì)胞基底顏色為綠色熒光，可與不同顏色熒光疊加，這樣就可區(qū)分出染毒細(xì)胞，從而可以觀察染毒細(xì)胞對(duì)周邊未染毒正常細(xì)胞正常生理狀態(tài)是否造成了影響，有效區(qū)分同一培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞的不同生理狀態(tài)，解決了之前不能有效區(qū)分同一培養(yǎng)環(huán)境下同種細(xì)胞不同染毒狀態(tài)的問(wèn)題。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]以下實(shí)施例中的原料如無(wú)特殊說(shuō)明，均來(lái)源于市售。
[0028]實(shí)施例1 一種觀察不同生理狀態(tài)PC12細(xì)胞之間相互影響的方法
[0029]包括以下具體步驟:
[0030](一)PC12 細(xì)胞復(fù)蘇
[0031]從液氮罐中取出PC12細(xì)胞凍存管，迅速投入37°C水浴中，并搖動(dòng)令其盡快融化，凍存管酒精消毒后用巴士吸管吸出細(xì)胞懸浮液，注入離心管并加入10倍的含有5%胎牛血清和5 %馬血清的DMEM培養(yǎng)液，混合后離心(100rpm，5min)，除去上清液，用培養(yǎng)液(含有5 %胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液)稀釋成I X 14個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶1ml，置于37°C、含5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0032](二)PC12 細(xì)胞培養(yǎng)
[0033]PCl 2細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞單層長(zhǎng)滿后，棄培養(yǎng)基，每瓶加Iml 0.25%胰酶_EDTA進(jìn)行消化，部分細(xì)胞脫落后加入含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞輕輕吹打分散至單細(xì)胞懸液后，移入1ml離心管中，混合后離心(1000rpm，5min)，棄上清液，用ImL含10%血清的完全培養(yǎng)液重懸，平均分成三份，接種于三個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中按上述步驟(一)方法培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0034](三)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建
[0035]1、PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備
[0036](1)將邢+10%?83培養(yǎng)基、1640+20%?83培養(yǎng)基、1\?83和1^7?8丨114014預(yù)先平衡至到室溫；
[0037](2)將傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞上清收集送檢無(wú)菌，待無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果確定后，通過(guò)傳代培養(yǎng)(使用HD+10 % FBS培養(yǎng)基或1640+20 % FBS培養(yǎng)基)進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)整，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后，吸去培養(yǎng)基，用I X PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的血清；
[0038](3)吸去PBS，加入適量Tryps in-EDTA，輕輕旋轉(zhuǎn)，使Tryps in-EDTA均勻覆蓋培養(yǎng)器皿表面，消化1-2分鐘使細(xì)胞脫壁，顯微鏡下可見細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，用手輕拍培養(yǎng)器皿的壁，立即加入2mL的HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基終止消化；
[0039](4)用吸管吸取液體，輕輕吹打培養(yǎng)器皿表面，反復(fù)3-5次，使細(xì)胞徹底脫離瓶皿底壁，將細(xì)胞移入離心管中，再向培養(yǎng)瓶中加入I XPBS洗1-2次，并將洗液一并轉(zhuǎn)移至離心管中；
[0040](5)244g離心4分鐘，吸去上清液；
[0041 ] (6)加入5mL的HD+10%FBS培養(yǎng)基或1640+20%FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管輕輕吹打收集的細(xì)胞懸液，取樣計(jì)數(shù)；
[0042](7)參照計(jì)數(shù)結(jié)果，取lX105cellS/9.6cm2的密度接種至六孔板，各接種2個(gè)孔。
[0043]2、GFP 轉(zhuǎn)導(dǎo) PC12 細(xì)胞
[0044](