抗人流感嗜血桿菌p6蛋白抗體及應(yīng)用該抗體的免疫層析試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體及應(yīng)用該抗體 檢測人流感嗜血桿菌的免疫層析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感嗜血桿菌(化emo地ilus influenzae，Hi)是感染人類的一種重要的呼吸道病 原微生物，該菌由波蘭細(xì)菌學(xué)家費佛博±在1892年的一次流行性感冒攝疫中發(fā)現(xiàn)的，在隨 后的時間里被研究者們廣泛研究?，F(xiàn)僅知人是該病原體的宿主。免疫力較差的老人和兒童 為易感人群，特別是5歲W下的嬰幼兒。Hi可引發(fā)肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥等， 在全球每年至少有300萬嚴(yán)重病例發(fā)生，可造成患兒致殘甚至死亡。Hi分為有芙膜的a、b、c、 d、e、f共6個血清型和無芙膜的不可分型流感嗜血桿菌（nontypeable Haemophi lus influenzae，Nrai)，一度W芙膜b型化最為流行。目前我國開展的化血清學(xué)檢查大多也只針 對侵襲力較強的芙膜b型。而由于該型菌株芙膜多糖疫苗的成功研發(fā)與應(yīng)用，其流行已被有 效控制。近來的研究多顯示，在感染化的患者中最常見的菌株是Ν???，其分離率已達(dá)50% W 上。
[0003] 臨床上由于化與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難W根據(jù)臨床表 現(xiàn)、X-射線檢查等得出結(jié)論，確診往往依賴于實驗室診斷。嬰幼兒疾病的特點是起病急、轉(zhuǎn) 歸快，因此敏感、快速、實用的化檢測對及早進(jìn)行有效的臨床干預(yù)具有非常重要的意義。
[0004] 盡管流感嗜血桿菌在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實驗室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的 種類極少。目前，Hi感染的診斷方法有血清學(xué)檢測法，核酸檢測法和病原體直接檢測法。檢 測血清中化IgG、IgA、IgM抗體常用的方法有:微量免疫巧光抗體檢測(MIF)，補體結(jié)合試驗 (CF)，重組酶免疫測定(rEIA)，血清補體結(jié)合一酶免疫測定試驗(SeroCF-EIA)等。然而化 抗體的檢出只能說明該個體感染過化，卻不能反映體內(nèi)是否仍有化活菌存在，并且血清學(xué) 特異性抗體檢測常需要根據(jù)IgM抗體的動態(tài)結(jié)果進(jìn)行判斷，需要較長的時間。更重要的是， 血清學(xué)檢測的主要檢測對象為抗芙膜抗體，而Ν???由于沒有芙膜，則會造成漏檢。同時，運 些技術(shù)均存在靈敏度低、操作步驟復(fù)雜、需要專業(yè)人員操作、重復(fù)性差、檢測時間長、檢測特 異性差、成本較高等缺陷，因而難W滿足臨床的實際需要。
[0005] 核酸檢測包括核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，核酸雜交檢測化的特異性強，但 敏感性不高，主要用于PCR結(jié)果的檢測、判定，尚未直接用于臨床標(biāo)本的檢測;PCR具有較高 的敏感性，但PCR實驗對實驗室有特殊要求，標(biāo)本處理、擴增和檢測要求嚴(yán)格，且易出現(xiàn)假陽 性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。
[0006] 病原體檢測方法主要為病原分離培養(yǎng)法，將標(biāo)本接種于添加了 V和X因子的巧克力 血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24小時培養(yǎng)后，挑取可疑菌落經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，用化鑒定卡、Vilek-60 細(xì)菌自動分析系統(tǒng)鑒定到種，系統(tǒng)自動進(jìn)行生物分型。但該法存在操作步驟復(fù)雜，細(xì)胞培養(yǎng) 時間長等明顯缺陷，并不適合臨床應(yīng)用。更重要的是，其中的芙膜腫脹實驗等僅限于對有芙 膜的菌株進(jìn)行鑒定，而無芙膜型(Ν???)則全部漏檢。
[0007] 因此，建立人流感嗜血桿菌特異性抗原的快速診斷方法十分必要。由于人流感嗜 血桿菌P6蛋白序列上的高度保守性，使其成為了一個重要的檢測標(biāo)的。因此獲得高特異性 的抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體就是一個十分重要的工作。目前，關(guān)于抗人流感嗜血桿菌 P6蛋白抗體報道得最多的為相應(yīng)的單克隆抗體及多克隆抗體。單克隆抗體最大的優(yōu)點就是 特異性高，但是制備方法繁瑣，生產(chǎn)成本高，限制了其應(yīng)用。多克隆抗體主要由基因工程表 達(dá)的P6蛋白免疫家兔等動物制備而成。其制備方法簡單，成本低，但是其具有特異性低、效 價低、純度低等缺陷。因此，低成本的制備高特異性、高效價的抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗 體就顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對【背景技術(shù)】中存在的運些技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供識別人流感嗜血桿 菌P6蛋白62-75位W及115-128位氨基酸所組成的兩個線性抗原表位的兩種抗體及應(yīng)用該 抗體的免疫層析試劑盒。
[0009] 抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體，其特征在于:所述抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體 是分別識別人流感嗜血桿菌P6蛋白62-75位W及115-128位氨基酸所組成的兩個線性抗原 表位的兩種抗體，所述人流感嗜血桿菌P6蛋白在GenBank序列號是AG冊2799.1;所述人流感 嗜血桿菌P6蛋白62-75位的14個氨基酸W及115-128位的14氨基酸的氨基酸序列分別為 VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA;將人流感嗜血桿菌P6蛋白62-75位的14個氨基酸W及 115-128位的14氨基酸的序列分別命名為P6A及P6B;所述抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體是 AbP6AW 及AbP6B。
[0010] -種基于如前所述的抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其 特征在于:所述試劑盒是基于量子點標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒或基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的 免疫層析試劑盒。
[0011] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的試劑盒是基于量子點標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時， 所述試劑盒的制備方法是：
[0012] 1)量子點標(biāo)記抗體AbP6A溶液：
[0013] 向微量離屯、管中依次加入0.4nmol簇基水溶性量子點和SOOnmol碳二亞胺抓C，W MES緩沖液定容為1ml，混合溶液，37 °C反應(yīng)5min后，再加入0.34mg的制備得到的抗體AbP6A， 避光反應(yīng)化，加入單端氨基聚乙二醇陽G2000-NH2至終濃度為l%(m/v)，封閉未反應(yīng)的活化 簇基位點，繼續(xù)避光反應(yīng)化；反應(yīng)后的樣品用超濾管離屯、（截留分子量100k)，6500g離屯、 5min，至體積200ul，將超濾后樣品轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)，離屯、除團聚，得到上部清液W及下部 沉淀，lOOOOg條件下離屯、3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待上部清液自 然流入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流 出時開始收集，收集1ml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管（截留分子量100k) W6500g 離屯、濃縮至200ul后轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)離屯、除團聚，對普通EP管進(jìn)行離屯、的條件是lOOOOg， 3min;獲取上清后W憐酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存?zhèn)溆茫恢链酥频昧孔狱c標(biāo)記抗體 AbP6A溶液；
[0014] 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/L MESW及0.74g/L EDTA，所述MES 緩沖液的抑7.4;
[0015] 所述憐酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼、 0.2g氯化鋼、Ig牛血清白蛋白BSA W及0.1 g化N3，溶解于90ml的去離子水中，用Imol/L NaOH 調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100ml;
[0016] 2)制備結(jié)合墊
[0017]將聚醋纖維膜浸入步驟1)所得到的量子點標(biāo)記抗體AbP6A溶液中化，取出，25°C干 燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0.6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆茫链酥频媒Y(jié)合墊；
[001引 3)制備樣品墊
[0019] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少化，再置于生 物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cmX2.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0020] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取〇.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼、 0.2g氯化鋼、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐溫-20、2g薦糖W及0.5g聚乙締化咯燒酬P(guān)VP-10，溶 解于90ml的去離子水中，用Imol/L NaOH調(diào)抑至7.3后用去離子水定容至100ml;
[0021] 4)制備檢測層
[0022] 將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將制備得到的抗體AbP6B和羊抗兔IgG用憐酸 鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2. Omg/mL及1. Omg/mL將稀釋好的抗體AbP6B裝入BI0D0T劃 膜儀噴頭中，設(shè)置1.化1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝 入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè)置1.化1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢 巧機間距為0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥化，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封干 燥保存;至此制得檢測層；
[0023] 所述憐酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼W 及0.2g氯化鋼，溶解于90ml的去離子水中，用Imol/L化0H調(diào)抑至7.3后用去離子水定容至 100ml；
[0024] 5)組裝檢測卡
[00巧]5.1)將底板裁剪成4cm X 7.3cm大小，備用；
[00%] 5.2)將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用；
[0027] 5.3)將步驟5.1)制備得到的底板