一種中華絨螯蟹的delta6去飽和酶基因及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因及其 克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸(PUFA)是生物膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，同時對人類的健康也具有 重要作用，膳食中攝入的PUFA對心律失常有抑制作用，并且PUFA對心血管疾病的輔助治療 和預(yù)防也發(fā)揮了一定作用。此外，LC-PUFA與人體的健康更加密切相關(guān)，如二十二碳六烯酸 (DHA)可關(guān)系到胎兒的生長，發(fā)育，某些LC-PUFA還可以降低炎癥、癌癥及心腦血管疾病的發(fā) 病率等。
[0003] 當(dāng)前常見的多不飽和脂肪酸EPA和DHA的來源主要是深海魚油，然而隨著市場需求 的迅速增長和海洋可捕撈魚類資源的日益減少，該途徑已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。此外環(huán)境 污染等原因致使魚油中的重金屬含量越來越高。因此，尋找更為持續(xù)穩(wěn)定的EPA和DHA來源 已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。探索利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，例如使轉(zhuǎn)基因的物種成為"綠色工廠"，穩(wěn)定、高 效地生產(chǎn)EPA和DHA是一個重要途徑。
[0004] 脂肪酸去飽和酶(Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD)是生物體合成PUFA的關(guān)鍵酶，可 催化飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸?；溕系碾p鍵的形成，使脂肪酸不飽和程度得以提高。 目前已知的多不飽和脂肪酸合成的過程示于圖5中，其中delta6去飽和酶是PUFA合成過程 中的限速酶，能夠催化飽和脂肪酸的第一步去飽和過程，它催化亞油酸(LA)生成γ-亞油酸 (GLA)，以及催化α-亞麻酸(ALA)生成十八碳四稀酸(stearidnoic acid)，它們是ΕΡΑ及其后 DHA生成的關(guān)鍵酶。目前研究已經(jīng)從秀麗隱桿線蟲、小鼠、斑馬魚、虹鱒、軍曹魚、大西洋鮭 魚、鱸魚、鮑魚、金頭鯛魚等中克隆到delta6去飽和酶基因，但是目前有效利用于轉(zhuǎn)基因物 種的商業(yè)化應(yīng)用的delta6去飽和酶數(shù)量不多，且選擇范圍小，因此繼續(xù)克隆并篩選具有較 高底物專一性和催化活性的delta6去飽和酶使當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。
[0005] 中華絨螯蟹由于其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，深受廣大群眾的喜愛，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中 的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種。其肝胰腺中脂肪含量達(dá)50%，脂肪對中華絨螯蟹的生長和性腺發(fā)育具有 重要的作用，其中EPA和DHA等PUFA是中華絨螯蟹等蟹類所必需的脂肪酸，因此探索中華絨 螯蟹PUFA合成酶的功能具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。
[0006] 本發(fā)明通過對中華絨螯蟹de 1 ta6去飽和酶基因的克隆、基因的序列分析，對該去 飽和酶基因在中華絨螯蟹中的可能作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，為中華絨螯蟹PUFA的合成以 及轉(zhuǎn)基因研究開發(fā)，例如利用轉(zhuǎn)基因物種穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)PUFA所必須的去飽和酶基因，提 供了一個基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因編碼的蛋白。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因的克隆方法。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] (1)根據(jù)Genebank中華絨螯蟹和菁夜蛾的delta6去飽和酶基因進(jìn)行對比，獲得的 保守序列，設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物FAD6-F1( + )和FAD6-R1(-)，以中華絨螯蟹肝胰腺總RNA反轉(zhuǎn) 錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得delta6去飽和酶基因片段核心片段，將所 述核心片段克隆到載體上并測序，
[0012] FAD6-F1( + )的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，F(xiàn)AD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0013] ⑵根據(jù)獲得的delta6去飽和酶基因核心片段設(shè)計(jì)5'和3'RACE引物FAD6-5'（_)和 FAD6-3 '（ + )，以中華絨螯蟹肝胰腺總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的5'-cDNA和3'-cDNA第一鏈為模板，進(jìn) 行RACE反應(yīng)，獲得5'和3'末端片段，將獲得的末端片段分別連接至載體后克隆并測序，
[0014] FAD6-5'（_)的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，F(xiàn)AD6-3'（ + )的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0015] (3)將5'和3'末端片段分別與核心片段進(jìn)行拼接得到delta6去飽和酶基因全長序 列。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，步驟（1)和(2)中總RNA是從中華絨螯蟹肝胰腺中 通過Trizol法提取得到的。
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(1)和(2)中所述載體是pGEM-Τ質(zhì)粒。
[0018]本發(fā)明還提供一種載體，其包括中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因。
[0019 ]本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其包括上述載體。
[0020] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其表達(dá)上述蛋白。
[0021] 在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)染細(xì)胞為大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、金斯 瑞酵母等中的一種，優(yōu)選為大腸桿菌。
[0022] 與現(xiàn)有的去飽和酶基因相比，本發(fā)明的基因具有以下特點(diǎn)：
[0023] 本發(fā)明得到的中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因 cDNA的全長序列包括183bp的5' UTR區(qū)域、1326bp的0RF和801bp的3 ' UTR區(qū)域，共編碼442個氨基酸，其中3 ' UTR區(qū)域具有典型 的加尾信號AATAAA及po lyA尾。
[0024]本發(fā)明首次報(bào)道從中華絨螯蟹中分離克隆了delta6去飽和酶基因，并且首次通過 構(gòu)建表達(dá)載體來驗(yàn)證該基因的功能，并證實(shí)了該基因能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)， 且后續(xù)蛋白水平上的研究表明，該基因編碼的蛋白具有能夠?qū)A和ALA分別轉(zhuǎn)化為γ-亞麻 酸和十八碳四烯酸的活性，從而為ΕΡΑ和DHA等PUFA的合成奠定了底物基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究 中華絨螯蟹PUFA的合成提供了一定的依據(jù)。
[0025] delta6去飽和酶基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列包括:三個組氨酸簇保守區(qū)、一 個細(xì)胞色素 b5結(jié)構(gòu)域以及血紅素結(jié)合域HPGG，delta6去飽和酶基因編碼的氨基酸還含有四 次跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過序列比對，發(fā)現(xiàn)得到的中華絨螯蟹delta6去飽和酶與NCBI上已報(bào)道的 中華絨螯蟹、羅非魚、尖吻鱸、大西洋鮭、虹鱒、菁夜蛾及小鼠等物種的delta6去飽和酶氨基 酸相似性在40%_76%內(nèi)。
[0026]使用MAGE對上述物種delta6去飽和酶基因相關(guān)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果 如圖3所示。中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因與菁夜蛾聚為一支，其余物種聚為一大支。
【附圖說明】：
[0027]圖1顯示了中華絨螯蟹的delta6去飽和酶基因的核苷酸序列。
[0028]圖2顯示了中華絨螯蟹的delta6去飽和酶的氨基酸序列。
[0029]圖3顯示了中華絨螯蟹與其它物種delta6去飽和酶基因氨基酸序列比對。
[0030]圖4顯示了中華絨螯蟹delta6去飽和酶與其它物種FAD6氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。 [0031]圖5顯示了目前已知的多不飽和脂肪酸合成的過程。
[0032]圖6-a顯示了未加底物(亞油酸和α-亞麻酸)的BL21/pC〇ld_fad6菌株脂肪酸圖譜。 [0033]圖6-b顯示了空載體BL21/pCold菌株脂肪酸圖譜。
[0034]圖6-c顯示了加亞油酸的BL21/pC〇ld-fad6菌株脂肪酸圖譜，其中1表示亞油酸，2 表示γ-亞麻酸）。
[0035] 圖6-d顯示了加 α-亞麻酸的BL21/pCold_fad6菌株脂肪酸圖譜，其中1表示α-亞麻 酸，2表示十八碳四烯酸。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 克隆中華絨螯蟹delta6去飽和酶基因
[0039] (1)根據(jù)Genebank中華絨螯蟹和菁夜蛾的delta6去飽和酶基因進(jìn)行對比，獲得的 保守序列，設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物FAD6-Fl( + )(其核苷酸序列如SEQ ID勵:3)所示和?六06-1?1 (_)(其核苷酸序列如SEQ ID N0:4)，以Trizol法提取的中華絨螯蟹肝胰腺總RNA反轉(zhuǎn)錄合 成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得delta6去飽和酶基因核心片段。PCR加樣體系為 cDNA模板 1.0yL，dNTP Mixture 4.0yL，兩種引物（ΙΟμΜ)各0.5yL，10XPCR Buffer(Mg2+ Plus)2·5yL，rTaq E(5U/yL)0·25yL，ddH20 16·25μΙ^ΡΟ?條件為94°C預(yù)變性5min，后進(jìn)行30 個循環(huán)，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)結(jié)束后再72°C延伸lOmin。獲得的中 華絨螯蟹Elovl6基因核心片段克隆到pMD-19T載體并測序。
[0040] (2)根據(jù)獲得的delta6去飽和酶基因核心片段設(shè)計(jì)5'和3'RACE引物FAD6-5'（-) (其核苷酸序列如SEQ ID N0:5)和FAD6-3'（ + )(其核苷酸序列如SEQ ID N0:6)。以Trizol法 提取的中華絨螯蟹肝胰腺總RNA反轉(zhuǎn)錄合成5 ' -cDNA和3 ' -cDNA第一鏈，分別以此cDNA為模 板，進(jìn)行RACE反應(yīng)，獲得5 '和3 '末端片段。將獲得的末端片段分別連接至載體后克隆并測 序。
[0041 ] 5'-RACE反應(yīng)體系為5' -cDNA模板2 · 5yL，ΙΟμΜ的5'-RACE引物0.5以1^，10\1]?]\1(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）5.0yL，10mM dNTP Mix 1.0yL，50XAdvantage 2Polymerase Mix 1.0yL，10XAdvantage 2PCR buffer緩沖液5.0yL，加滅菌去離子水至總體積50yL。反 應(yīng)條件：94°C30s，72°C2min，5 個循環(huán)；94°C30s，70°C30s，72°C2min，5 個循環(huán)；94°C30s，68°C 30s，72°C2min，28 個循環(huán)；72°C 10min。
[0042] 3 ' -RACE反應(yīng)體系為3 ' -cDNA 模板2 · 5yL，10μΜ的 3 ' -RACE引物0.541^，10\1]卩]\1(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3,)5.0yL,10m M dNTP Mix 1.OyL,50X Advantage 2Polymerase Mix 1.