一種土壤樣品中微生物基因組的快速提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，特別涉及一種土壤樣品中微生物基因組的快速提取方法。
技術(shù)背景
[0002]土壤中的微生物是一個(gè)綜合體系，每克土壤(濕重)中大概有10的十次方到十一次方個(gè)微生物，而其中99%以上不可培養(yǎng)。傳統(tǒng)的土壤微生物群落的分析是利用微生物計(jì)數(shù)、分離培養(yǎng)、富集培養(yǎng)，并通過微生物代謝產(chǎn)物的生理生化分析來確定微生物的種類，從而確定土壤中有害、有益微生物的情況，再有針對(duì)性的進(jìn)行優(yōu)勢有益土壤微生物生態(tài)群落的構(gòu)建。但是常規(guī)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)有很大的局限性，因?yàn)槟壳暗姆蛛x方法可分離出的微生物種類僅占土壤微生物種類總數(shù)的0.1-1%，許多微生物不能被分離和鑒定;所以利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法僅能得到土壤生態(tài)系統(tǒng)中少量的微生物群落的信息，許多“存活但不能被培養(yǎng)”微生物信息丟失。此外，利用傳統(tǒng)方法來確定微生物種類時(shí)消耗時(shí)間較長，需要做梯度稀釋(一般為5-7個(gè)稀釋度)，并需要3-5個(gè)平行重復(fù)，因而工作量巨大，很難做到快速檢測和規(guī)?；僮?。
[0003]目前可以通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行土壤微生物生態(tài)群落檢測分析，如16SrRNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)等等。這些分子生物學(xué)檢測方法能更全面地反映出土壤微生物的信息。在進(jìn)行分子生物學(xué)分析時(shí)，首先需要從土壤中提取高質(zhì)量的微生物總基因組DNA。土壤中的無機(jī)鹽、有機(jī)物需要事先分離處理;此外，在DNA提取過程中殘留的腐殖酸和重金屬也會(huì)對(duì)后期分析生物學(xué)分析造成影響。
[0004]基于上述內(nèi)容，需要開發(fā)一種快速提取土壤樣品中的微生物基因組的方法，以用于通過分子生物學(xué)手段對(duì)土壤中微生物菌落進(jìn)行深入分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從土壤樣品中快速提取微生物基因組的方法。本方法對(duì)于土壤樣品中的微生物基因組通過物理研磨、酶解破碎、化學(xué)抽提、硅膠膜吸附純化，得到高質(zhì)量的微生物基因組，從而用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的，一種土壤樣品中微生物基因組的快速提取方法，其特征在于，包括以下基本步驟:
A)將土壤樣品在液氮環(huán)境中研磨粉碎；
B)在粉碎后的土壤樣品中加入土壤微生物基因組提取緩沖液，37°C水浴中溫育30min;
C)然后分別加入蛋白酶K溶液和SDS溶液，55°C水浴30min;
D)離心棄沉淀，收集上清液；
E)用苯酚第一次抽提，離心后收集上清液；
F)再用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液進(jìn)行第二次抽提，離心后收集上清液； G)向上述上清液中加入2倍體積的乙醇或0.8倍體積的異丙醇，混勻后，將全部液體離心通過DNA回收純化柱；
H)回收純化柱再次經(jīng)離心干燥；
I)最后加入DNA洗脫液，室溫孵育l-2min，經(jīng)離心得到微生物基因組樣品。
[0007]所述步驟B中，土壤微生物基因組提取緩沖液的工作濃度溶液中包括0.2M NaCl、0.05M EDTA、0.15 Tris_HCl和l_2mg/ml溶菌酶;并在加入后振蕩3_5min，隨之再進(jìn)行37°C水浴。
[0008]所述步驟C中，加入蛋白酶K至其工作濃度為0.02-0.05mg/ml、SDS工作溶液濃度為
0.2-0.5%;并在加入后，輕微混勻，隨之進(jìn)行55°C水浴。
[0009]所述步驟D中的離心速度為10000-12000 rpm，離心5_10min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4V。
[0010]所述步驟E中，用苯酚抽提的時(shí)間為5-10min;抽提后離心速度為10000-12000rpm，離心5-10min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C。
[0011]所述步驟F中的苯酚、氯仿和異戊醇混合液中各項(xiàng)的體積比為25:24:1;抽提的時(shí)間為5-10min;抽提后離心速度為10000-12000 rpm，離心5_10min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C。若完成該步驟后，上清液仍渾濁或者有少量蛋白殘留，可以重復(fù)此步驟一遍。
[0012]所述步驟G中，離心速度為10000-12000 rpm，離心3_5min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C。
[0013]所述步驟Η中，需要將回收純化柱放置新的收集管中，離心速度為10000-12000rpm，離心1 _2min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C。
[0014]所述步驟I中，DNA洗脫液為10 mM Tris-Cl, pH值在7.5-8.5之間。加入洗脫液后，室溫孵育l_2min，隨后離心收集微生物基因組樣品(離心速度為10000-12000 rpm，離心1-2min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C)。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明對(duì)于土壤樣品的粉碎是在液氮中完成的。其低溫導(dǎo)致土壤機(jī)構(gòu)疏松，方便研磨，使微生物細(xì)胞破碎，使DNA釋放完全;并且低溫情況下各酶處于低活性狀態(tài)，有利于抑制DNAase的作用，保護(hù)土壤微生物基因組。
[0016]2、本發(fā)明通過物理研磨、酶解破碎、化學(xué)抽提、硅膠膜吸附純化步驟提取土壤微生物基因組，采用的步驟較少而且試劑簡單，整個(gè)過程耗時(shí)2h左右，節(jié)約了時(shí)間。
[0017]3、本方法為直接法從土壤中提取微生物基因組，不涉及DNA的反復(fù)溶解，提高了產(chǎn)量，提取的基因組的產(chǎn)量可以達(dá)到80ug/g;DNA完整性高，大小在23kb以上；沒有RNA或者蛋白質(zhì)的污染，0D260/0D280接近標(biāo)準(zhǔn)值。
【附圖說明】
[0018]圖1為土壤微生物基因組凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0020]實(shí)施例1
土壤樣品:小麥田小麥根系周圍土壤，采樣時(shí)為小麥已成熟即將開鐮。[0021 ]分離提取土壤微生物基因組的具體過程如下:
(1)將2g的土壤樣品在液氮中研磨粉碎；
(2)將研磨好的樣品置于10ml離心管中，加入基因組提取緩沖液(包括0.2M NaCl、
0.05M EDTA,0.15 Tris-HCl和lmg/ml溶菌酶)，振蕩3min，混勻后，37°C水浴中溫育30min;
(3)向溶液中，分別加入蛋白酶K溶液和SDS溶液至終濃度為0.02mg/ml和0.2%，輕微混勻，55°C 水浴 30min;
(4)4°C情況下，lOOOOrpm，離心5min，收集上清液；
(5)上清液用等體積的苯酚，室溫抽提5min;
(6)4°C情況下，lOOOOrpm，離心5min，離心后收集上層水相；
(7)向收集得到的上層水相中加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液(三者的體積比為25:24:1),室溫抽提5min ；
(8)4°C情況下，lOOOOrpm，離心5min，離心后收集上層水相；
(9)向收集得到的上層水相中加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，將全部液體離心通過DNA回收純化柱;離心速度為lOOOOrpm，離心3min，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C;
(10)回收純化柱放置在新的干燥的收集管上，再次經(jīng)高速離心干燥，離心速度為lOOOOrpm，離心lmin，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C ；
(11)加入適量的DNA洗脫液(10mM Tris-Cl , pH值7.5)，經(jīng)離心(離心速度為lOOOOrpm，離心lmin，離心機(jī)設(shè)定溫度為4°C)得到微生物基因組樣品。
[0022]用分光光度計(jì)測得提取額土壤微生物基因組的0