利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種家蠶合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一 種利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜘蛛種類繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112個(gè)科，3905個(gè)屬，44000多種。 蜘蛛絲是由蜘蛛絲腺分泌的一種天然高分子蛋白纖維，具有優(yōu)良的機(jī)械性能，如彈性好、強(qiáng) 度大、韌性強(qiáng)、耐高溫和低溫、耐沖擊、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等優(yōu)良特性， 其獨(dú)特的綜合性能是其他天然纖維和合成纖維所無(wú)法相比的。典型的蜘蛛絲有7種類型， 分別由7種不同絲腺分泌的不同的蛋白質(zhì)分子組成。其中由大囊狀腺（Major ampullate gland)分泌的主牽引絲（dragline silk)，呈放射狀分布，構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)基本框架。牽引絲的 強(qiáng)度是鋼的5倍，因而擁有"生物鋼"之美譽(yù)。牽引絲的蛋白基因是高度保守的，主要由分 子量350kDa左右的、成對(duì)的牽引絲蛋白I(MaSpl)和牽引絲蛋白2 (MaSp2) 2種蛋白組成。
[0003] 黑寡婦蜘蛛（Latrodectus hesperus)牽引絲蛋白I (MaSpl)基因具有一個(gè) 單一外顯子，全長(zhǎng)9390bp，編碼3129個(gè)氨基酸，基因含有大量的重復(fù)單元，每1個(gè)重 復(fù)單元由4種初級(jí)類型重復(fù)序列Typel、Type2、Type3和Type4通過(guò)頭尾串聯(lián)而成 (Typel-Type2-Type3_Type4)，而每1種初級(jí)類型重復(fù)序列都包含了典型的（GA)n、An和GGX 蛋白基序。堿基和蛋白序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。MaSpl被認(rèn)為是牽引絲具有 很強(qiáng)強(qiáng)度的主要分子基礎(chǔ)。
[0004] 由于蜘蛛絲自身的產(chǎn)量低，且由于其相互殘殺而不能通過(guò)大規(guī)模的飼養(yǎng)獲得批量 的蜘蛛絲，所以限制了蜘蛛絲的廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和對(duì)蜘蛛絲的編碼序 列及吐絲機(jī)理的深入了解，已有采用各種異源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)蜘蛛絲蛋白的研究，異源表 達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母（Pichia pastoris)、昆蟲細(xì)胞（sf9、BmN)、倉(cāng)鼠的腎臟細(xì)胞、轉(zhuǎn) 基因土豆、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因山羊、轉(zhuǎn)基因老鼠、以及轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0005] 但是，至今為止使用的各種異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的蜘蛛絲蛋白的分子量較小， 有較多重組蛋白缺少一些關(guān)鍵的蛋白基序，有較多蛋白不是純的蜘蛛絲蛋白分子，而是與 熒光蛋白等分子融合的融合蛋白，這些因素最終影響了外源蛋白的機(jī)械性能。因此，現(xiàn)有技 術(shù)缺少了一種方法能分泌出盡可能長(zhǎng)的、單一蜘蛛絲蛋白分子的蜘蛛絲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決【背景技術(shù)】中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出了一種利用家蠶絲腺生 物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的方法，利用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將黑寡婦蜘蛛牽 引絲蛋白1基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)，并在家蠶絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開發(fā)出能合成分泌單 一的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的家蠶，獲得以家蠶絲為本底的黑寡婦蜘蛛牽引絲，用于蜘 蛛絲的開發(fā)利用，同時(shí)也可以用于提高蠶絲的機(jī)械性能。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：
[0008] (1)采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建pBac[3xP3-DsRed]-MaSpl質(zhì)粒作為在家蠶絲腺中 表達(dá)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因載體，pBac[3 XP3-DSRed]-MaSpl質(zhì)粒（如圖1~圖3 所示）以PiggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)包含外源基因的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因和作為標(biāo) 記基因的紅色熒光DsRed基因表達(dá)框；
[0009] (2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBaC[3XP3-D SRed]-MaSpl質(zhì)粒及能夠提供 PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG按濃度比1 :1的比例導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后6小時(shí)以內(nèi)的 受精卵內(nèi)，利用pBac[3xP3-DsRed]_MaSpl質(zhì)粒中的piggyBac轉(zhuǎn)座子將黑寡婦蜘蛛牽引絲 蛋白1基因插入到家蠶基因組內(nèi)；
[0010] ⑶蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，然后與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代，此代為Gl代，在 Gl代蠶卵的轉(zhuǎn)青期，通過(guò)熒光體視顯微鏡觀察篩選出單眼表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的 轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲再與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代成為G2代；
[0011] (4) G2代家蠶采用單蛾育，篩選出熒光體視顯微鏡下表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基 因的家蠶，采用同蛾區(qū)蠶蛾相互交配制成G3代；
[0012] (5)G3代家蠶采用單蛾育，同蛾區(qū)表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的蠶蛾相互交配， 制成G4代；
[0013] (6)從G4代開始并經(jīng)連續(xù)3代采用紅眼表型純一的蛾區(qū)飼養(yǎng)、單蛾育和同蛾區(qū)蠶 蛾交配的相同方法進(jìn)行選擇和交配，育成紅眼基因和黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因純合、 絲腺細(xì)胞能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的轉(zhuǎn)基因家蠶；
[0014] (7)通過(guò)家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1，并隨家蠶吐絲結(jié)繭行 為進(jìn)入蠶繭。
[0015] 所述的質(zhì)粒pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl是以piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有 Amp抗性基因，包括piggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBL和PBR，以及兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂之間的 兩個(gè)功能表達(dá)框，一個(gè)功能表達(dá)框是3XP3啟動(dòng)子啟動(dòng)的紅色熒光蛋白基因表達(dá)框，即 3 X P3Promoter - DsRed-SV40，另一個(gè)功能表達(dá)框是包含家蠶絲素蛋白重鏈基因啟動(dòng)子、絲 素蛋白重鏈基因信號(hào)肽、黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因和家蠶絲素蛋白重鏈基因3'末端的 表達(dá)框，即 Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-MaSpI-Fibroin H chain PolyA0
[0016] 所述的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白I基因長(zhǎng)度是包含2倍到16倍MaSpl基因重復(fù)單 jt Typel-Type2-Type3-Type4〇
[0017] 所述步驟（7)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因在家蠶絲腺細(xì)胞特異表達(dá)，在家蠶 絲素蛋白重鏈信號(hào)肽的作用下分泌到絲腺腺腔，并隨吐絲行為分泌到蠶繭。
[0018] 本發(fā)明是先構(gòu)建家蠶合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因的載體 pBac [3xP3-DSRed] -MaSp 1，再利用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將這種質(zhì)粒與能夠提供 piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG質(zhì)粒（如圖4所示）一起導(dǎo)入到家蠶受精卵內(nèi)，依靠 piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特性，使紅色熒光蛋白基因和黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因?qū)氲?家蠶基因組內(nèi)，并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從而創(chuàng)制成一種能夠在家蠶絲腺細(xì)胞特異性合成 分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的轉(zhuǎn)基因家蠶，自交使黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因純合，育 成能分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1的轉(zhuǎn)基因家蠶，然后利用該種家蠶合成分泌黑寡婦蜘蛛 牽引絲蛋白1。
[0019] 本發(fā)明具有的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明借助熒光標(biāo)志基因篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠在家蠶絲腺細(xì)胞 特異地合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1，黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1具有功能活性。本發(fā)明 開發(fā)了一種新型的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1生產(chǎn)工藝，為大量生產(chǎn)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白 1奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為提高蠶絲的機(jī)械性能奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是家蠶后部絲腺細(xì)胞合成分泌重組黑寡婦牽引絲蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpI X 2 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0022] 圖2是家蠶后部絲腺細(xì)胞合成分泌重組黑寡婦牽引絲蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpl X 12 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0023] 圖3是家蠶后部絲腺細(xì)胞合成分泌黑寡婦重組牽引絲蛋白1的 pBac [3 X P3-DsRed] -MaSpl X 16 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0024] 圖4是本發(fā)明涉及的piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0026] 本發(fā)明的實(shí)施例如下：
[0027] 本發(fā)明的三個(gè)實(shí)施例中的pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl X2質(zhì)粒、 pBac [3xP3-DsRed]-MaSpl X 12 質(zhì)粒和 pBac [3xP3-DsRed]-MaSpl X 16 質(zhì)粒采用以下方式制 備合成：
[0028] A)先將家蠶絲素重鏈蛋白基因啟動(dòng)子（Fib-H-P)連到pMD18-T simple(Takara) 載體，并和基本的含有A3啟動(dòng)子（其堿基序列如SEQ ID NO. 3)和綠色熒光蛋白（其堿基序 列如SEQ ID NO. 4)表達(dá)框的piggyBac質(zhì)粒piggy6212載體（其堿基序列如SEQ ID NO. 5) 分別經(jīng)過(guò)Xhol/Ncol雙酶切，膠回收重鏈啟動(dòng)子序列部分與piggyBac載體骨架連接，獲得 piggy6609載體（其堿基序列如SEQ ID NO. 6)。
[0029] B)pBac[3xP3_DsRed]-MaSpl質(zhì)粒構(gòu)建方法和步驟如下：
[0030] 根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的全長(zhǎng)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白1基因（MaSpl)序列特征設(shè)計(jì)質(zhì)粒， 并根據(jù)家蠶的密碼子偏好性作了堿基優(yōu)化，詳細(xì)信息如下。
[0031] 人工合成家蠶絲素重鏈蛋白基因的信號(hào)肽、2倍的MaSpl分子的