豌豆抗白粉病er1等位基因er1-9及其編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物病理學(xué)、遺傳育種及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及魏豆抗白粉 病erl新等位基因erl-9及其編碼蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 魏豆（PisumsativumL.)是世界上重要的冷季類食用豆作物。據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計， 我國已成為世界上第一大菜用魏豆和第Ξ大干魏豆生產(chǎn)國（FA0STAT數(shù)據(jù)）。魏豆白粉病 巧rysiphepisi化C.)是魏豆上的一種重要病害，可造成25%~50%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重感 染的魏豆品種損失可高達80%W上（化saretal.,2011;Fondevillaet曰1.,2012)。
[0003] 抗病品種的應(yīng)用是防治魏豆白粉病最為經(jīng)濟、有效且環(huán)境安全的方法。目前，國 外已經(jīng)鑒定了大量的抗白粉病魏豆資源，并在抗性資源中鑒定了 3個抗白粉病基因，包括 兩個獨立遺傳的隱性基因（erl和er2)和一個獨立遺傳的顯性基因巧r3)(Harlandet al., 1948 ;He;ringaetal., 1969;Fondevillaetal., 2007)。目前，鑒定的大多數(shù)魏豆抗 白粉病資源的抗性均由erl控制，并且生產(chǎn)中應(yīng)用的抗白粉病魏豆資源的抗性也均由erl 控制燈iwarietal. , 1997;(}hafooretal., 2012;Liuetal. , 2003 ;化idetal., 1997)。 抗病基因erl對白粉菌表現(xiàn)抗病或免疫的機制是抑制病原菌對寄主的表皮細(xì)胞的入侵?？?病基因erl具有抗病持久而且不受外界環(huán)境影響的特點，在歐洲國家已廣泛應(yīng)用于魏豆栽 培種中（Fondevillaet曰1.，2007)。隨著魏豆分子標(biāo)記的開發(fā)和遺傳圖譜的構(gòu)建，抗病基 因erl被定位在魏豆遺傳圖譜的第6連鎖群（LGVI)(Timmermanetal. , 1994)。最近， Hump虹yetal. (2011)和化vanetal. (2011)等研究表明erl基因是與大麥感白粉病 基因（ML0)序列同源的PsMLO功能喪失而產(chǎn)生的，由于魏豆PsMLO同源基因序列發(fā)生基因 插入、缺失、移位、替換等基因突變導(dǎo)致功能喪失而產(chǎn)生了多個erl等位基因?；趀rl基 因PsMLOl突變的位置和方式不同，目前已鑒定了 8個erl等位基因，分別是erl-l、erl-2、 e;rl-3、e;rl-4、e;rl-5、e;rl-6、e;rl-7和erl-S，其中等位基因e;rl-2是由大片段的插入或缺失 產(chǎn)生的，等位基因erl-7是由一個lObp的小片段缺失造成，等位基因erl-8是由3個堿基缺 失造成的，其它已知的5個erl等位基因都是由單堿基突變引起的化ump虹yetal., 2011; Pavanetal., 2011;Sunetal., 2015a;201f5b)。
[0004] 目前，魏豆白粉病已對我國魏豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，在白粉病易發(fā)生地區(qū)，在魏豆 感病品種上發(fā)病率高達100%。目前，我國對魏豆抗白粉病的研究較少，主要集中在魏豆抗 白粉病的資源篩選，并在中國魏豆資源中發(fā)現(xiàn)了對中國白粉菌分離物EPYN和EPBJ均表現(xiàn) 免疫的較好的抗源（彭化賢等，1991 ;曾亮等，2012 ;王仲怡等，2013 ;付海寧等，2014)。通 過控制培養(yǎng)條件，篩選出了多個魏豆抗性資源，并在運些抗病資源中鑒定了抗白粉病基因 erl-l、e;rl-2、erl-G、e;rl-7 和erl-S(Sunetal. , 2015a;201f5b;2015c)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供魏豆抗白粉病erl新等位基因erl-9及其編碼蛋白。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的erl-9蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所 示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 本發(fā)明還提供編碼所述蛋白的魏豆抗白粉病erl等位基因erl-9,其cDNA序列如 SeqIDNo. 2 所示。
[0008] 本發(fā)明進一步提供所述等位基因erl-9在魏豆資源抗白粉病的分子育種中的應(yīng) 用。
[0009] 為了明確魏豆抗白粉病資源G0004400的抗病erl等位基因，本發(fā)明對G0004400 的erl候選基因PsMLOlcDNA進行測序。序列分析結(jié)果顯示G0004400的PsMLOlcDNA序 列與野生型感病基因PsMLOlcDNA序列相比，在928bp處發(fā)生單堿基突變，運一缺失導(dǎo)致第 310個氨基酸由絲氨酸（巧變?yōu)榱涟彼峄?，從而引起PsMLOl蛋白功能的變化。運與已鑒 定的8個erl等位基因的突變位置均不相同，表明運是一個erl的新等位基因，將其命名為 erl-9。該等位基因位于魏豆遺傳圖譜第VI連鎖群的erl基因座位上。魏豆抗白粉病資源 G0004400的PsMLOlcDNA對應(yīng)的CDS序列及其編碼氨基酸序列見SeqIDNo. 5。
[0010] 本發(fā)明通過對魏豆抗白粉病資源G0004400的erl候選基因PsMLOlcDNA序列分 析，發(fā)現(xiàn)了新的抗性等位基因erl-9。確定了新等位基因erl-9的cDNA序列。本發(fā)明首次 鑒定了erl的新等位基因erl-9,對魏豆抗白粉病育種工作具有重要意義，通過育種手段可 有效控制魏豆白粉病的發(fā)生，減輕該病害造成的經(jīng)濟損失，并為魏豆資源抗白粉病的分子 育種提供新的基因資源。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明中抗病資源G0004400(左）和感病品種巧魏6號（右）接種魏豆白 粉菌分離物EPYN10天后的表型。
[0012] 圖2為本發(fā)明中魏豆白粉病抗病資源G0004400和野生型魏豆感病資源在基因 PsMLOl編碼區(qū)的核巧酸序列比對結(jié)果。
【具體實施方式】
[0013]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0014]W下實施例中設(shè)及的抗病魏豆資源G0004400和感病對照品種巧魏6號均來自于 中國國家作物種質(zhì)庫，抗病對照品種YI由美國華盛頓州立大學(xué)陳衛(wèi)東教授提供。
[0015] 實施例1魏豆抗白粉病資源G0004400的表型鑒定
[0016] 將抗病魏豆資源G0004400和感病對照品種巧魏6號W及抗病對照品種YI分別播 種于W粗賠石為基質(zhì)的250mL的紙杯中，每杯播5粒，于18~26°C的溫室培養(yǎng)，待魏豆苗第 3或第4莖節(jié)葉片展開時，采用抖落法接種白粉菌分離物EPYN的分生抱子（NCBI，Accession number:KR957355)，接種后置于18~22°C溫室培養(yǎng)。采用0~4級的病害嚴(yán)重度分級標(biāo) 準(zhǔn)，0級：無??；1級：病斑上有淡薄菌絲層，可見綠色葉面，不產(chǎn)生抱子；2級：菌絲層較厚， 不透綠，產(chǎn)生一定量抱子；3級：菌絲層厚，產(chǎn)抱量較多；4級：產(chǎn)抱量多，病斑上的菌絲層全 被抱子覆蓋（Vaidetal.，1997;Ranaetal.，2013)。接種10天后感病對照品種病害嚴(yán) 重度達4級后調(diào)查各供試資源的發(fā)病情況?？剐栽u價標(biāo)準(zhǔn)為：0級為免疫（I)，1~2級為 抗?。〞r，3~4級為感?。⊿)。共進行Ξ次重復(fù)接種鑒定。
[0017]接種10天后，感病對照品種巧魏6號所有植株的葉片、莖桿和卷須上全部覆蓋 厚的菌絲層，并產(chǎn)生大量分生抱子，莖桿和卷須也布滿菌絲體和分生抱子，病害嚴(yán)重度為4 級，表現(xiàn)感病；抗病對照品種ΥΙ(ΡΙ391630)葉片、莖桿和卷須上均無可見癥狀，病級為0， 表現(xiàn)免疫。對照品種對分離物ΕΡΥΝ的表型反應(yīng)與王仲怡等（2013)的鑒定結(jié)果相同?？剐?資源G0004400的表現(xiàn)型與抗病對照ΥΙ相同，對分離物ΕΡΥΝ表現(xiàn)免疫反應(yīng)。
[001引抗病資源G0004400和感病品種巧魏6號接種魏豆白粉菌分離物ΕΡΥΝ10天后的 表型如圖1所示。
[0019] 實施例2抗性資源的erl候選基因PsMLOlcDNA序列鑒定
[0020] 用RNAprep植物總RNA提取試劑盒（離屯、柱型，購自天根生化）提取魏豆資源 G0004400W及感病對照品種巧魏6號的植物總RNA。具體操作方法如下：
[0021] 1)取約lOOmg魏豆幼嫩葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL化（使用前加 入β-琉基乙醇至終濃度為1 % )，滿旋劇烈震蕩混勻；
[0022] 2)將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上（過濾柱CS放在收集管中），1200化pm離屯、 5min，小屯、吸取收集管中的上清至RNase-化ee的離屯、管中；
[0023] 3)緩慢向離屯、管中加入0. 5倍體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起 轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，靜置2min，12000巧m離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液；
[0024] 4)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RW1，靜置2min，12000巧m離屯、Imin，倒 掉收集管中的廢液；
[00巧]5)面aseI工作液的配制：取10μL面aseI儲存液放入新的RNase-化ee離屯、管 中，加入70μLRDD溶液，輕柔混勻；
[002引 6)向吸附柱CR3中央加入80μL的面aseI工作液，室溫放置20min;
[0027] 7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，靜置2min，12000巧m離屯、Imin，倒 掉收集管中的廢液；
[0028]8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入無水乙醇），室溫靜置2min， 1200化pm離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液；
[002引 9)重復(fù)步驟8);
[0030] 10) 12000巧m離屯、2min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底驚干 殘留的漂洗液；
[0031] 11)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-化ee離屯、管中，向吸附膜的中間位置懸空 滴加50μLRNase-freed地2〇,室溫放置lOmin，12000巧m離屯、2min，得到RNA溶液；
[003引 RNA完整性檢測：普通瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：膠濃度1. 2 % ; 1XT邸電泳 緩沖液；150V;15min。
[003引用BioRT逆轉(zhuǎn)錄擴增腳-PCR)試劑