一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種熒光定 量PCR沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙眼衣原體（CT)是一種具有獨(dú)特發(fā)育周期、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生 物，是一類介于病毒、細(xì)菌和立克次體之間的特殊微生物，在微生物分類上屬于細(xì)菌門、立 克次體綱、衣原體目及衣原體屬。是國內(nèi)外最常見的性病病原體之一，在我國生殖道衣原體 感染居STD的第三位，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。機(jī)體感染CT后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生型特異 性細(xì)胞免疫和體液免疫，但通常免疫力不強(qiáng)，且維持短暫，因而常造成持續(xù)感染、隱性感染 和反復(fù)感染。
[0003] 解脲脲原體又稱解脲支原體（UU)，屬于柔膜綱支原體目支原體科的脲原體屬，是 一類介于細(xì)菌與病毒之間的最小原核微生物，主要分布于人體泌尿生殖道內(nèi)，并通過性接 觸而傳播，也可由母體垂直傳染給胎兒。男性生殖道最常見的寄生處在尿道口和精液中，女 性生殖道最常見的寄生處在陰道。解脲脲原體是非淋菌性尿道炎的主要病原體之一，感染 后可導(dǎo)致多種生殖道炎癥。在男性，可導(dǎo)致非淋菌性尿道炎、急性附睪炎、前列腺炎等的發(fā) 生；在女性可引起包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、卵巢炎等，宮內(nèi)感染可引起流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn) 等不良后果。
[0004] 目前沙眼衣原體和解脲脲原體的診斷方法主要有培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，其中，培 養(yǎng)法的特異性和敏感性高，但臨床檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)（至少需要24h-48h，甚至更長(zhǎng)時(shí)間），過程 繁瑣，需要使用特殊的培養(yǎng)介質(zhì)以及易受雜菌影響，不適用于大范圍檢測(cè)。免疫學(xué)方法簡(jiǎn)便 快捷，但特異性差、靈敏度不高。近年來，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上 的優(yōu)勢(shì)，標(biāo)準(zhǔn)PCR過程分為三步：DNA變性（90°C-96°C):雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵 斷裂，形成單鏈DNA;退火（60°C-65°C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙 鏈；延伸（70°C_75°C):在Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，以脫氧核糖核苷三 磷酸（dNTP)為原料，從引物的3'端開始以從5' -3'端的方向延伸，最終合成與模板互 補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
[0005] 運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面：核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0006]目前，國內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)沙眼衣原體和解脲脲原體的核酸進(jìn)行提?。?先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。煮沸法具有諸多 不足之處：1)核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過煮沸裂解、高 速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、 富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的 高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。2)檢測(cè)靈敏度不高，約在lOOOOcopies/ml左右；3) 沒有設(shè)置陽性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），無法監(jiān)控假陰性；4) 一般沒有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施。 另外，對(duì)于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無法看到，看 得到沉淀的是因?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，這樣，導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無 法看到沉淀，使操作者無法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到病毒核酸。
[0007] 目前，國內(nèi)臨床上檢測(cè)沙眼衣原體和解脲脲原體DNA的方法主要基于實(shí)時(shí)熒光定 量PCR技術(shù)及其改進(jìn)。熒光定量PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來 的一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者 治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問 題，減少了污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢 測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過檢 測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過軟件自動(dòng) 分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct值）以及擴(kuò)增曲線的形狀， 可以判斷陰陽性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過軟 件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值（即定量檢測(cè)）。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì) 比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu) 完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過程中有 靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬 滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光 檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié) 束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結(jié)果和樣本濃度的 定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方 法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008] 多重PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上演變而來的，主要用于多種病原微生物的同 時(shí)檢測(cè)或鑒定某些病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。多種病原微生物的同時(shí) 檢測(cè)或鑒定，指的是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定具體病原體的感染類型。多重PCR技術(shù)的具有以 下特點(diǎn)：①高效性：在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的 基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。②系統(tǒng)性：多重PCR很適宜于成組病 原體的檢測(cè)，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌、性病、無芽胞厭氧菌、戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑 的同時(shí)檢測(cè)。③經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性：多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，大大的節(jié)省時(shí)間、試劑 以及其他經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多、更快、更準(zhǔn)確的診斷信息。同時(shí)，多重PCR技術(shù)也可以 結(jié)合光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)熒光定量檢測(cè)，從而使得測(cè)試結(jié)果更靈敏、更特異、更精確。
[0009] 但是，多重PCR技術(shù)中添加的多種病原微生物的特異性引物設(shè)計(jì)難度較大，既不 能互相結(jié)合，也不能與模板DNA上目標(biāo)片段以外的區(qū)域結(jié)合，此外，多重PCR中的不同擴(kuò)增 片段還會(huì)互相競(jìng)爭(zhēng)資源?；谝陨显颍嘀豍CR技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用收到了極大限 制。
[0010]目前，國內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)沙眼衣原體或解脲脲原體DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，但大部分是針對(duì)沙眼衣原體或解脲脲原體單一檢測(cè)方法， 現(xiàn)有技術(shù)中很少將多重PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。對(duì)于臨床檢測(cè)兩種以及多種病原體的 要求，必須對(duì)同一樣本做多管檢測(cè)才能達(dá)到，增加了檢測(cè)成本和操作繁瑣度，降低了檢測(cè)效 率。并且，這些試劑盒所提供的提取方法主要是煮沸法，特異性差、靈敏度低、檢測(cè)效果欠 佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中試 劑盒檢測(cè)效率低、特異性差以及靈敏度低的問題。
[0012] 本發(fā)明提供一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒，所述沙眼衣原體/解 脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒包括：沙眼衣原體/解脲脲原體PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括 反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物以及用于靶多核苷 酸檢測(cè)的探針，其中，所述用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針序列為：沙眼衣原體探針：5'-CTTAA AAGACAATGGATTACCTAT-3' ；解脲脲原體探針：5' -TGGAAGGGGCAAGAGATGGTAAGT-3'。
[0013] 優(yōu)選的，所述