.)，頁數(shù) 189-194，WalterdeGruyter &Co. ,Berlin.)〇
[0146] 通過編碼小C-肽中的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)密碼子的隨機(jī)化，進(jìn)行合成的小C-肽 的開發(fā)。合成的小C-肽的特征通常在于在C-端的酶促加工位點(diǎn)（Lys)，其允許經(jīng)酶促除去 合成的小C-肽。使用摻雜的寡核苷酸進(jìn)行隨機(jī)化，所述摻雜的寡核苷酸在合成的小C-肽 的一個(gè)或多個(gè)位置上引入密碼子變異。一般將用于PCR的兩個(gè)引物（寡核苷酸）之一摻 雜。用于PCR產(chǎn)生具有隨機(jī)化的合成的小C-肽的前導(dǎo)序列-胰島素前體、用于產(chǎn)生具有通 式Ala-Xaa-Lys(A)(K)的合成的小C-肽的寡核苷酸對(duì)的實(shí)例如下： 引物A(引入Bglll-位點(diǎn)）： 5' -ATACAGGAATTCCATTCAAGATCTGTTCAAACAAGAAGA-3'（SEQIDN0: 3) 引物B: 5?-AATCTTAGTTTCTAGACTAGTTGCAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGCATTG TTCGACAATACCCTTMNNAGCCTTAGGAGTGTAGAA- 3'(SEQIDNO:4) N=ACTG M=AC 襲合靡遂式反應(yīng)。通常按如下所示進(jìn)行PCR:5 μL引物A (20 ρπι〇1/μ1)、5 μL引物B (20 ρπιο1/μ1)、10 μL 10X PCR緩沖液、8 μL dNTP混合物、0.75 μL E.H.F.酶、1 μL pAK1119 質(zhì)粒作為模板（大約〇. 2 μ g DNA)和70. 25 μL蒸餾水。
[0147] 一般進(jìn)行12循環(huán)，一個(gè)循環(huán)一般是95°C45秒；48°C1分鐘；72°C1.5分 鐘。隨后將PCR混合物上樣到2%瓊脂糖凝膠上并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電泳。將所得DNA片 段從瓊脂糖凝膠上切下來并通過QIAquickGelExtraction試劑盒分離。
[0148] 圖2顯示pAK1119DNA表達(dá)盒的核苷酸序列（SEQIDNO: 5)，其用作PCR的模板和 所編碼的融合蛋白（PAK1119的α*-前導(dǎo)序列-EEGEPK-胰島素前體（SEQIDN0:6)的推 定的氨基酸。
[0149]將純化的PCRDNA片段溶于緩沖液EB(10mMTrisHC1pH8. 5,在QIAquickGel Extraction試劑盒中提供）并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用合適的限制內(nèi)切酶（例如BglII和XbaI) 消化。Bglll-XbalDNA片段經(jīng)歷瓊脂糖電泳并使用QIAquickGelExtraction試劑盒來純 化。
[0150] 使用T4DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)條件，將經(jīng)消化和分離的DNA片段與合適的載體（例如 CP0T型的）連接在一起。將連接混合物隨后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌菌株，然后用氨芐青霉 素抗性來選擇。使用ManualPerfectprepPlasmid96Vac試劑盒和epMotion5075VAC (自動(dòng)化移液系統(tǒng)）分離來自所得大腸桿菌的質(zhì)粒。
[0151] 質(zhì)粒隨后用于轉(zhuǎn)化合適的釀酒酵母宿主菌株例如MT663 份沿/AiW印i7.vZ孤?/?/^7.·.·Ζ孤？Cir+)。讓單獨(dú)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的釀酒酵母克隆在液 體培養(yǎng)基中生長，通過RP-HPLC確定分泌到培養(yǎng)基上清液中的胰島素前體的量。然后確定 來自分泌增加量的胰島素前體的釀酒酵母克隆的表達(dá)質(zhì)粒的編碼合成的小C-肽的DNA序 列。隨后，經(jīng)鑒定的合成的小C-肽序列可經(jīng)歷另一輪隨機(jī)優(yōu)化。
[0152]實(shí)施例 2-84 通過實(shí)施例1所述的方法產(chǎn)生本發(fā)明的胰島素前體和表達(dá)構(gòu)建體。表1顯示胰島素前 體和相應(yīng)的生產(chǎn)收率（表示為對(duì)照YAK1220的百分率）和0-糖基化水平。發(fā)酵全在5ml YPD中在30°C進(jìn)行72h。通過培養(yǎng)上清液的RP-HPLC確定胰島素前體的收率，并相對(duì)于 對(duì)照菌株的收率表示，所述對(duì)照菌株表達(dá)前導(dǎo)序列-胰島素前體融合蛋白，其中B29殘基通 過小C-肽Ala-Ala-Lys連接到A1殘基。YAP3是YAP3信號(hào)序列。
[0153] 新產(chǎn)生的胰島素前體的一個(gè)實(shí)例是pAK3768。序列EEGEPK(SEQIDN0:2)是B-鏈 的N-末端延伸和α2是前-原-序列 MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASI AAKEEGVSMAKR(SEQIDN0:7)〇
[0154]另一實(shí)例是pAK4053,其中TA39 是前-原-序列MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTE SNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR(SEQIDN0:8)〇
[0155] 用于實(shí)施例的另外的前導(dǎo)序列是具有Ncol-位點(diǎn)的α-前導(dǎo)序列（SEQIDNO: 13) 和具有Bglll-位點(diǎn)的α4-前導(dǎo)序列（SEQIDNO: 14)。
[0156] 表1列舉了胰島素前體和用于發(fā)酵以產(chǎn)生所述胰島素前體的表達(dá)構(gòu)建體。各構(gòu)建 體都已經(jīng)歷兩次或三次獨(dú)立發(fā)酵和分析，在單次實(shí)驗(yàn)中僅進(jìn)行了數(shù)量非常有限的發(fā)酵。
[0157] 表1.胰島素前體和用于在釀酒酵母MT663中表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體的列表，包括前 體收率和前體的糖基化程度。
[0158] 實(shí)施例85. 通過實(shí)施例2-84中所述的相同方法，制備和測試了另外的胰島素前體和表達(dá)構(gòu)建體。
[0159] 表2列舉了胰島素前體和用于發(fā)酵以產(chǎn)生所述胰島素前體的表達(dá)構(gòu)建體。在該表 中也列舉了對(duì)于各構(gòu)建體，通過兩次或三次發(fā)酵所確定的收率和糖基化水平。
[0160] 表2.參考胰島素前體和用于在釀酒酵母MT663中表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體的列表，包 括前體收率和前體的糖基化程度。
[0161] 實(shí)施例 86-97. 為了評(píng)價(jià)序列Z-B-X-Y-A中的Y是K或R的效果，通過實(shí)施例2-84中所述的相同方法 制備和測試了許多胰島素前體和表達(dá)構(gòu)建體。
[0162] 表3列舉了胰島素前體和用于發(fā)酵以產(chǎn)生所述胰島素前體的表達(dá)構(gòu)建體。在該 表中也列舉了對(duì)于各構(gòu)建體，通過兩次或三次發(fā)酵所確定的收率。觀察到對(duì)于具有結(jié)構(gòu) Z-B-X-Y-A的人胰島素前體，收率處于任何X-序列的相同水平，無論Y-序列是K(賴氨酸） 或R(精氨酸）。
[0163] 表3.人胰島素前體和用于在釀酒酵母MT663中表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體的列表，包括 前體收率。
[0164] 表4列舉了胰島素aspart前體和用于發(fā)酵以產(chǎn)生所述胰島素aspart前體的表達(dá) 構(gòu)建體。在該表中也列舉了對(duì)于各構(gòu)建體，通過兩次或三次發(fā)酵所確定的相對(duì)于人胰島素 前體的收率。觀察到對(duì)于具有結(jié)構(gòu)Z-B-X-Y-A的胰島素aspart前體，收率是處于任何X-序 列的相同水平，無論Y-序列是K(賴氨酸）或R(精氨酸）。注意，胰島素aspart前體的 收率是針對(duì)"參考"人胰島素前體而標(biāo)準(zhǔn)化的，因此解釋了相對(duì)收率小于1. 〇。
[0165] 表4.胰島素aspart前體和用于在釀酒酵母MT663中表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體的列表， 包括前體收率。
[0166]實(shí)施例 98-103. 如實(shí)施例2中所述，通過在酵母菌株（其中通過常規(guī)酵母遺傳學(xué)方法已經(jīng)破壞了PMT1 或PMT2的基因）中表達(dá)，測試胰島素前體的0-糖基化水平，并與酵母菌株MT663中表達(dá)的 胰島素前體相比較。
[0167] 依據(jù)實(shí)施例1的程序制備表達(dá)構(gòu)建體，并依據(jù)實(shí)施例2-84中所述的程序進(jìn)行發(fā)酵 和〇-糖基化分析。
[0168] 在實(shí)施例98中表達(dá)的具有DMK作為C-肽的胰島素前體，相比例如表1中的 YAK1220構(gòu)建體（0. 6%)，表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)退降?. 29% 0-糖基化。實(shí)施例99和100證明在 Apmtl以及在Apnit〗菌株中的十分相同的胰島素前體的表達(dá)甚至進(jìn)一步降低了 0-糖基化 水平，從野生型菌株的0. 37%分別降低到兩個(gè)蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶敲除菌株中的0. 17%和 0. 13%。因此，通過在兩個(gè)不同的蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶敲除菌株中表達(dá)，胰島素前體的0-糖 基化降低了 2. 2至2. 9倍。具有SDMKC-肽的其它胰島素前體也得到相同結(jié)論，盡管在此 在Δpmtl菌株中0-糖基化的降低是3. 0倍，而在Δpmt2菌株中是2. 4倍。
[0169] 表5.在釀酒酵母MT663 (wt)和蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶敲除菌株中表達(dá)的不同的 胰島素前體的〇-糖基化程度的比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包含序列Z-B-X-Y-A的胰島素前體，其中 -Z是任選的延伸序列， -B是人胰島素或其類似物的B-鏈， -X是選自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。2. 權(quán)利要求1的胰島素前體，其中X是X3. 權(quán)利要求2的胰島素前體，其中Xi中的所有氨基酸殘基選自G、A、V、L、I、M、Q、N、E、 D、S和T〇4. 權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)的胰島素前體，其中Xi選自D、SDD和A。5. 權(quán)利要求1的胰島素前體，其中X選自EA、AE、AD、DA和AP。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的胰島素前體，其中Y是K。7. 權(quán)利要求1_6中任一項(xiàng)的膜島素前體，其是人膜島素或DesB3〇-人膜島素的前體，BP A是A(1-21)和B是B(1-30)或B(1-29)。8. 制備成熟人胰島素或其類似物的方法，所述方法包括（i)在表達(dá)所述人胰島素或人 胰島素類似物的前體的合適培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)包含編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的人胰島素 或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞；和（ii)分離所表達(dá)的前體。9. 在真菌細(xì)胞中表達(dá)期間降低人胰島素或人胰島素類似物的前體的0-糖基化的方 法，所述方法包括（i)在表達(dá)所述人胰島素或人胰島素類似物的前體的合適培養(yǎng)條件下， 培養(yǎng)包含編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì) 胞。10. 在真菌細(xì)胞中表達(dá)期間增加人胰島素或人胰島素類似物的前體的收率的方法，所 述方法包括（i)在表達(dá)所述人胰島素或人胰島素類似物的前體的合適培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)包 含編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞。11. 權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述真菌細(xì)胞攜帶在PMT1或PMT2的基因內(nèi) 的至少一個(gè)遺傳修飾，這降低其0-糖基化的能力。12. 權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述真菌細(xì)胞是酵母。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述酵母選自釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和多形漢遜氏 酵母。14. 表達(dá)載體，其包含編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的人胰島素或人胰島素類似物的前 體的多核苷酸序列。15. 宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求14的載體轉(zhuǎn)化。
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備成熟人胰島素或其類似物的改善的方法，即通過培養(yǎng)包含編碼人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞，所述前體包含小的連接肽。
【IPC分類】C07K14/62, C12N15/81
【公開號(hào)】CN105308067
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480032597
【發(fā)明人】F.胡巴勒克, A.F.佩特斯森, T.B.克杰德森, A.S.安德森
【申請(qǐng)人】諾和諾德股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2014年6月6日
【公告號(hào)】EP3004156A1, US20160115216, WO2014195452A1