一種以小興安嶺落葉松鋸末為原料制備高純度花旗松素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，尤其涉及一種利用小興安嶺落葉松鋸末為原料制備高純度花旗松素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在北半球，有十幾種樹木屬于落葉松屬。在中國的小興安嶺，廣泛生長著興安落葉松。興安落葉松的生長地占據(jù)了整個(gè)小興安嶺面積的55%。國內(nèi)外學(xué)者通常將天然活性成分分為初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物兩大類。文獻(xiàn)曾報(bào)道了，落葉松的樹干部分含有初級(jí)代謝產(chǎn)物包括微量元素，維生素，游離氨基酸，蛋白質(zhì)；次級(jí)代謝產(chǎn)物包括揮發(fā)油，黃酮類物質(zhì)，萜類物質(zhì)及木質(zhì)素類等物。作為興安落葉松樹干中一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，花旗松素具有廣泛的臨床藥用價(jià)值。該化合具有二氫黃酮醇所具有的典型生物活性如，抗氧化，抗炎，抗菌，抗自由基等。近年的關(guān)于花旗松素的藥物活性研究表明，該化合物還具有擴(kuò)張血管并促進(jìn)血液微循環(huán)，抑制血小板凝結(jié)，治療腦梗塞，抗腦血栓，治療冠心病等藥理活性。
[0003]花旗松素，其分子式為C15H1207，分子量不大，值為304.3。其化合物骨架如圖1.該化合物易溶解于甲醇，乙醇，溶于水但是溶解度不高。在前人的工藝中基本都涉及沉淀或者有機(jī)溶劑萃取等操作單元。沉淀劑多選擇有機(jī)鹽類物質(zhì)，這個(gè)方法雖然對(duì)提升花旗松素的純度有一定效果，可是對(duì)于整個(gè)工藝來講，后期的鹽類物質(zhì)處理會(huì)增加工藝的成本。有機(jī)溶劑的消耗不利于環(huán)境保護(hù)，大量應(yīng)用有機(jī)溶劑也會(huì)提高大規(guī)模生產(chǎn)化合物的成本。個(gè)別的工藝中提到脫脂脫蠟，可是加入該單元后依然把工藝的設(shè)計(jì)思路基本指向了大量有機(jī)試劑的引入。綜上所述，設(shè)計(jì)一條相對(duì)綠色環(huán)保并且低成本的工藝生產(chǎn)高純度花旗松素是非常有工業(yè)意義的。
[0004]天然化合物分離提取工藝設(shè)計(jì)首先考慮目標(biāo)化合物及雜質(zhì)間的相似性，然后根據(jù)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)來選擇提取的溶劑、柱層析分離過程中的洗脫溶劑、結(jié)晶溶劑。工藝中各操作單元間的耦合設(shè)計(jì)取決于目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的相似性，而分離體系中所有化合物結(jié)構(gòu)的相似性又是由最初的提取操作單元有直接的關(guān)系的。
[0005]在該專利中，以落葉松鋸末提取液的分析型高效液相色譜圖為基礎(chǔ)指導(dǎo)信息，設(shè)計(jì)了一條簡單低成本的工藝來制備98%純度的花旗松素產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種利用小興安嶺落葉松鋸末制備高純度花旗松素的方法，以解決上述問題。本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種利用小興安嶺落葉松鋸末制備高純度花旗松素的方法，包括如下步驟:
[0007]—種利用小興安嶺落葉松鋸末來制備高純度花旗松素的方法，其特征在于包括如下步驟:
[0008]1)花旗松素的兩次提取工藝
[0009]對(duì)小興安嶺落葉松鋸末進(jìn)行兩種溶劑提取，首先，體積比為80%乙醇水溶液回流提取，提取時(shí)間為l_3h，提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:8-14，該量度的單位為g/mL。提取溫度為80°C，提取兩次后合并提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液體積是原提取液體積的1/100。向提取器中加水，其體積為乙醇所用量的一半，100°C下，回流提取l_3h。
[0010]2)AB-8大孔吸附樹脂工業(yè)預(yù)純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0011]用于分離的玻璃層析柱的內(nèi)部直徑和高度分別為5cm和1.2m。將2L的AB-8大孔樹脂填充入柱子中，控制上樣液含有花旗松素的濃度范圍為1.2-1.8mg/mL,上樣的流速范圍8-12mL/min，上樣時(shí)間20_25h，洗脫步驟中流速為4_6mL/min，用4-10L的水洗脫后，在用10-16L的體積含量為20%乙醇水溶液洗脫含有花旗松素的富集物。
[0012]3)超聲波輔助冷卻結(jié)晶得到花旗松素粉末
[0013]配置體積含量為35%的甲醇水溶液，將含有花旗松素的富集物溶解于該甲醇水溶液中，控制花旗松素的濃度為40-48mg/mL，隨后超聲波清洗器中超聲，超聲溫度為25°C，超聲時(shí)間為15-20min，白色的大粒晶核析出，3_5°C冷卻水浴保存，結(jié)晶14_18h。離心得到固體結(jié)晶產(chǎn)品。在夾有4 μπι的過膜器上，用1L 4°C的冷卻去離子水清洗結(jié)晶得到的產(chǎn)品，即獲得了花旗松素白色粉末。
[0014]進(jìn)一步，步驟1)提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:10，該量度的單位為g/mL，乙醇的提取時(shí)間為2h,水的提取時(shí)間也為2h。
[0015]進(jìn)一步，步驟2)柱層析分離過程中，上樣液濃度為1.6mg/mL,流速為lOmL/min,上樣時(shí)間為2lh。洗脫流速為5mL/min，水洗4L后，用14L體積含量為20%乙醇水溶液收集預(yù)純化得到的花旗松素產(chǎn)品
[0016]進(jìn)一步，步驟3)將預(yù)純化得到的花旗松素產(chǎn)品溶解于體積含量為35%的甲醇水溶液中，形成濃度為42mg/mL的花旗松素過飽和溶液，放置于超聲反應(yīng)器中的超聲時(shí)間20min。大量晶體吸出后，4°C冰箱保存16h。在夾有4 μπι的過膜器上，用1L 4°C的冷卻去離子水清洗結(jié)晶得到的產(chǎn)品，即獲得了純度為98%的花旗松素白色粉末。
[0017]與現(xiàn)有文獻(xiàn)中的花旗松素生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明有益的效果是:工藝中所用的試劑主要是水，無水乙醇。結(jié)晶單元中也有用到甲醇，但是相對(duì)于水和乙醇來說，甲醇用量很少。全套工藝不是通過加入無機(jī)鹽等沉淀劑獲得高純度(90%以上)花旗松素，而是將大孔樹脂柱層析分離與超聲波輔助結(jié)晶有效耦合來滿足純度為98%的花旗松素產(chǎn)品的高效制備。對(duì)于這兩個(gè)單元耦合來說，決定洗脫溶劑中乙醇與水的體積配比以及結(jié)晶母液中甲醇和水的體積配比是重點(diǎn)。研究中，我們將關(guān)于落葉松鋸末提取液的分析型高效液相色譜圖中色譜峰洗脫規(guī)律作為了分離純化單元中溶劑配比篩選的基礎(chǔ)指導(dǎo)信息。進(jìn)而，我們判定了一個(gè)與花旗松素極性非常相近的雜質(zhì)的合理去除是制備生產(chǎn)純度為98%花旗松素產(chǎn)品的難度所在。由此，在大孔樹脂柱層析過程中，花旗松素與該雜質(zhì)被共同地看作了一個(gè)整體的待分離部分。在所設(shè)定的柱層析洗脫條件下，緊隨水洗后的洗脫液便用來收集含有花旗松素預(yù)純化產(chǎn)品，這樣使得部分比花旗松素極性低的化合物將留在大孔樹脂層析柱中。結(jié)晶則是實(shí)現(xiàn)花旗松素與鄰近雜質(zhì)的有效分離的關(guān)鍵步驟。最后的結(jié)果表明，當(dāng)以上的樹脂與純化產(chǎn)品作為結(jié)晶原料時(shí)，工藝中所選擇的結(jié)晶溶劑對(duì)于制備98%純度花旗松素非常適用。并且所獲得的工藝成本低廉，工藝簡單，產(chǎn)率高，綠色環(huán)保，操作條件溫和，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0018]圖1是小興安嶺落葉松鋸末水提取液的色譜圖以及該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖
[0019]圖2是一種利用小興安嶺落葉松鋸末制備高純度花旗松素的工藝流程圖
[0020]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1利用分析型高效液相色譜測(cè)定花旗松素的純度的分析圖
[0021]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1利用質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定的鑒定圖
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。
[0023]參圖1至參圖4所示，圖1是小興安嶺落葉松鋸末水提取液的色譜圖以及該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明一種利用小興安嶺落葉松鋸末制備花旗松素的方法的流程圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1利用分析型高效液相色譜測(cè)定的花旗松素的純度分析圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1利用質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定的鑒定圖。
[0024]本發(fā)明的實(shí)施方式提供了利用小興安嶺落葉松鋸末制備花旗松素的方法，包括以下步驟:
[0025]1)花旗松素的兩次提取工藝
[0026]用于該工藝設(shè)計(jì)中的小興安嶺落葉松樹干部分鋸末進(jìn)行兩種溶劑提取，首先，體積比為80%乙醇水溶液回流提取，提取時(shí)間為l_3h(可以為lh、2h、3h)，提取原料質(zhì)量與提取溶劑的體積比為1:8-14(可以為1:8、1:10、1:12、1:14)，該量度的單位為g/mL。提取溫度為80°C，提取兩次后合并提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液體積是原提取液體積的1/100。向提取器中加水，其體積為乙醇所用量的一半，100°C下，回流提取l_3h(可以為lh、2h、3h)。
[0027]2)AB-8大孔吸附樹脂工業(yè)預(yù)純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0028]對(duì)于天然化合物的預(yù)純化工業(yè)生產(chǎn)來說，大孔樹脂是一種很好工業(yè)柱層析填充介質(zhì)。大孔樹脂填充柱能夠很好地發(fā)揮其高效富集化合物的效果取決于動(dòng)態(tài)柱層析分離過程中，介質(zhì)球本身對(duì)上樣液中所有化合物的吸附作用有強(qiáng)弱之分。在該專利中，我們充分考慮了花旗松素這一黃酮化合物的理化性質(zhì)后選擇了 AB-8大孔吸附樹脂作為柱子的填充介質(zhì)，具體的實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)如下:
[0029]用于分離的玻璃層析柱的內(nèi)部直徑和高度分別為5cm和1.2m。將2L的AB-8大孔樹脂填充入柱子中，控制上樣液含有花旗松素的濃度范圍為1.