修飾的犬瘦素多肽的制作方法
【專利說(shuō)明】修飾的犬瘦素多肽
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/779, 337的權(quán)益。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)含有序列表，其已經(jīng)以ASCII格式電子提交，并因此以其整體通過(guò)引用并 入。在2014年3月7日產(chǎn)生的所述六5(：11副本，被命名為204257-0016-冊(cè)-00(509186)_ SL.txt，大小是2, 597字節(jié)。
[0005] 本發(fā)明涉及聚乙二醇（PEG)修飾的犬瘦素多肽和相關(guān)的組合物，以及可用于治療 陪伴動(dòng)物肥胖及其它瘦素相關(guān)病癥的方法。
[0006] 瘦素（1印tin)是一種神經(jīng)激素，它在下丘腦起作用，來(lái)調(diào)節(jié)能量平衡和食物攝 入。關(guān)于與瘦素及其對(duì)人的受體有關(guān)的問(wèn)題，已經(jīng)記載了很多（US2012/0149, 636)，但是，陪 伴動(dòng)物也遭受瘦素相關(guān)病癥。特別值得注意的是陪伴動(dòng)物，例如犬，其經(jīng)受有瘦素-病癥， 例如肥胖。雖然在人中施用外源性瘦素作為治療是已知的，但它仍被幾個(gè)問(wèn)題所妨礙，最重 要的是不能提供持久的效果。因而，正在進(jìn)行為發(fā)現(xiàn)更好的替代物的努力，這些努力包括發(fā) 現(xiàn)對(duì)人以及陪伴動(dòng)物更安全、更持久且更有效的化合物。
[0007] 本發(fā)明提供包含SEQIDNO: 1的多肽和聚乙二醇（PEG)部分的化合物，其中PEG 部分共價(jià)連接至SEQIDNO: 1的多肽的對(duì)-乙酰-苯丙氨酸（pAF)殘基。
[0008] 本發(fā)明還提供一種治療陪伴動(dòng)物中肥胖的方法，其包括將有效量的根據(jù)本發(fā)明的 化合物施用至有需要的動(dòng)物。
[0009] 本發(fā)明還提供一種預(yù)防陪伴動(dòng)物中肥胖的方法，其包括將有效量的根據(jù)本發(fā)明的 化合物施用至有需要的動(dòng)物。
[0010] 本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明的化合物，其用于治療。
[0011] 本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明的化合物，其用于治療肥胖。
[0012] 本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明的化合物，其用于預(yù)防肥胖。
[0013] 本發(fā)明還提供一種組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的化合物和一種或多種載體、稀釋 劑或賦形劑。
[0014] 多肽的氨基酸序列是：
[0015]
[0016] 其中，Xaa是對(duì)-乙酰-苯丙氨酸（pAF)(SEQIDNO: 1)。
[0017] 編碼SEQIDNO: 1的氨基酸序列的DNA分子的實(shí)例是：
[0018]
[0019] 作為處理的結(jié)果，第一甲硫氨酸可被切割，因而不存在于成熟多肽中，導(dǎo)致形成第 一甲硫氨酸切割和未切割的SEQIDNO1的混合物。優(yōu)選地，最終混合物含有小于百分之 十（10)或小于百分之五（5)的其中第一甲硫氨酸被切割的SEQIDNO1。最優(yōu)選地，最終 混合物含有2%或更低的其中第一甲硫氨酸被切割的SEQIDNO1。
[0020] 非天然存在的氨基酸是本領(lǐng)域已知的。已知一種特定的非天然存在的氨基酸被稱 為對(duì)-乙酰-苯丙氨酸（PAF)。本發(fā)明的多肽可以在體內(nèi)產(chǎn)生，利用修飾的tRNA和tRNA 合成酶來(lái)并入響應(yīng)在編碼多肽的基因中的琥珀終止密碼子的pAF，如在US2012/0149, 636 中描述的。將指導(dǎo)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)的表達(dá)質(zhì)?；蜉d體轉(zhuǎn)染至修飾的大腸桿菌 K-12W3110菌株。大腸桿菌K-12宿主菌株是W3110衍生物，它被修飾來(lái)包含這樣的質(zhì)粒，所 述質(zhì)粒含有在并入PAF位點(diǎn)處帶有琥珀終止密碼子（TAG)、在SEQIDNO:1的位置112處有 Xaa的DNA序列。質(zhì)粒還含有來(lái)源于詹氏甲燒球菌（Methanococcusjannaschii)DSM2661 的修飾酪氨酰tRNA和氨酰-tRNA合成酶（aa-RS)對(duì)（MjTyrCUAtRNA和Tyr-RS)的基因。 該對(duì)被修飾且遺傳選擇來(lái)并入響應(yīng)琥珀終止密碼子的pAF。
[0021] 用于本發(fā)明中的PEG部分具有IkDa至100kDa、或IkDa至50kDa、或20kDa至50kDa 的平均分子量。優(yōu)選的PEG部分具有約20kDa的分子量。另一優(yōu)選的PEG部分具有約30kDa 的分子量。又另一優(yōu)選的PEG部分具有約40kDa的分子量。PEG用于包括直鏈和支化的聚 合物兩者。大部分PEG是可商購(gòu)獲得的。優(yōu)選地，PEG是30kDaPEG(a-甲基氨基乙 氧基氨基甲?；⒕垩跻蚁?。
[0022] 動(dòng)物是指陪伴動(dòng)物，例如犬和貓。
[0023] 本發(fā)明的化合物可用于治療具有由瘦素調(diào)節(jié)的病癥的陪伴動(dòng)物。這種病癥包括肥 胖和肥胖誘導(dǎo)的或肥胖相關(guān)的病癥。肥胖是一種狀況，其中存在與瘦肉組織相比過(guò)量的脂 肪組織。肥胖和肥胖誘導(dǎo)的或肥胖相關(guān)的病癥的治療是指：施用本發(fā)明的化合物來(lái)減少食 物攝入，以優(yōu)先減少脂肪組織的量，并減少肥胖的陪伴動(dòng)物的體重。一種治療結(jié)果可以是： 相對(duì)于在施用本發(fā)明化合物之前動(dòng)物的體重，減少肥胖陪伴動(dòng)物的體重。治療可適當(dāng)?shù)貙?dǎo) 致動(dòng)物減少食物或熱量攝入，包括減少總食物攝入，和減少有需求的動(dòng)物的重量。肥胖和肥 胖相關(guān)的病癥的預(yù)防是指：施用本發(fā)明的多肽來(lái)減少食物攝入，以減少體重，或者維持處在 肥胖風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物的體重。預(yù)防的另一結(jié)果可以是預(yù)防之前由于飲食、鍛煉或藥物療法而 減去的體重的體重恢復(fù)。預(yù)防的另一結(jié)果可以是，如果在肥胖開(kāi)始之前，在處于肥胖風(fēng)險(xiǎn)中 的動(dòng)物中施用治療的話，則預(yù)防肥胖發(fā)生。
[0024] 本發(fā)明的化合物可以與在對(duì)具有通過(guò)犬瘦素調(diào)節(jié)的病癥的動(dòng)物的療法中或者用 于治療所述動(dòng)物的一種或多種其它活性成分組合或者利用所述一種或多種其它活性成分。
[0025] 本發(fā)明的化合物可以并入適合于施用至動(dòng)物的組合物中。設(shè)計(jì)這種組合物來(lái)適 合于選擇的施用方式，并且適當(dāng)?shù)厥褂每山邮艿南♂寗?、載體、和/或賦形劑例如分散劑、 緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等。所述組合物可以按照常規(guī)技術(shù)設(shè) 計(jì)，所述技術(shù)公開(kāi)在例如Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy，第 19 版， Gennaro,編輯，MackPublishingCo.，Easton，PA1995中，其提供了如從業(yè)者通常已知的 制劑技術(shù)的概略。組合物用的合適的載體包括當(dāng)與本發(fā)明的化合物組合時(shí)，保持該化合物 的活性并且是與動(dòng)物免疫系統(tǒng)非反應(yīng)性的任何材料。本發(fā)明的組合物包含化合物和一種或 多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0026] 包含本發(fā)明化合物的組合物可使用標(biāo)準(zhǔn)的施用技術(shù)施用至處于顯示如本文中描 述的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物。本發(fā)明的組合物含有有效量的本發(fā)明的化合物。有效量 是指：實(shí)現(xiàn)所需治療結(jié)果（以劑量計(jì)和對(duì)于時(shí)間段和對(duì)于施用方式）的量?；衔锏挠行?量可根據(jù)例如動(dòng)物的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及化合物在動(dòng)物中引起所需反應(yīng)的能 力因素而改變。有效量也是其中治療有益效果超過(guò)化合物的任何毒性或不利影響的量。有 效量可以是動(dòng)物初始體重的大約2% /周，直至動(dòng)物達(dá)到如由獸醫(yī)和客戶確定的所需體重。 有效量/劑量可以為每周約〇. 1至約l〇mg/kg動(dòng)物重量，例如通過(guò)皮下注射來(lái)施用。有效 量/劑量可以是通過(guò)SC注射每周一次施用的lmg/kg。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] SEQIDN0:1的多肽基本上按照US2012/0149,636中所述獲得的。SEQIDN0:1 的多肽在pH4. 0下20mMTris;2M尿素；和50mM甲硫氨酸中被配制成4mg/mL。以10 : 1的 PEG與多肽摩爾比，向該配制的多肽加入30KPEG(a-甲基氨基乙氧基氨基甲?；?， 聚氧乙烯，SunbrightME-300CA，N0F，日本）。將多肽和PEG輕輕混合，并且允許在28°C下 進(jìn)行48-72小時(shí)的綴合。然后，通過(guò)常規(guī)的陽(yáng)離子交換層析將PEG化的多肽純化，并在具有 4%海藻糖的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水）7. 4中配制成lmg/mL。該處理導(dǎo)致形成含有1-2%之 間的SEQIDNO:1的混合物，其中第一甲硫氨酸被切割掉。
[0029] 體外牛物數(shù)據(jù)
[0030] 利用在STAT3響應(yīng)元件控制下的螢光素酶報(bào)告基因和OB-Rb(瘦素受體）（其被表 達(dá)在細(xì)胞表面上）兩者將J1EK293細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。瘦素結(jié)合至瘦素受體，并活化STAT3同 二聚體和STAT3/STAT1異二聚體，其與STAT3序列響應(yīng)元件相互作用并與其結(jié)合。該相互作 用驅(qū)動(dòng)螢光素酶基因的表達(dá)，并刺激細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)光。發(fā)光的量與化合物的活性成比例。生 物活性是基于4-PLS形曲線的EC50。
[0031]第一天
[0032] 將細(xì)胞以20, 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板中，并放置在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中 24-30小時(shí)。
[0033]第二天
[0034] 野生型（WT)犬瘦素和實(shí)施例1的PEG化多肽的起始濃度是1200ng/mL。從中，從 各個(gè)樣品取出400yL體積，并且越過(guò)稀釋塊的行進(jìn)行4x連續(xù)稀釋。首先，將300yL/孔測(cè) 定培養(yǎng)基