一種用srap分子標(biāo)記對扁穗雀麥品種進(jìn)行鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地說涉及一種用SRAP分子標(biāo)記對扁 穗雀麥品種進(jìn)行鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 扁穗雀麥（BromuscatharticusVahl.)屬于禾本科雀麥屬植物，冷季型一年生或 越年生優(yōu)質(zhì)禾草，在我國西南、華中、華北等地大多作為一年生或越年生牧草加以利用。該 草種具有產(chǎn)量高、冬春季生長快、分蘗多、適應(yīng)性強(qiáng)的特性，是冬春季的優(yōu)良補(bǔ)飼牧草，還具 有營養(yǎng)價值較高、葉量豐富、適口性好、種子成熟后仍能保持青綠等特點，是冬春季的優(yōu)良 補(bǔ)飼牧草，同時由于其根系發(fā)達(dá)還被廣泛用于水土流失治理。基于上述原因，扁穗雀麥在長 江中上游地區(qū)愈來愈受到育種家和牧草種植者的重視。扁穗雀麥為自花授粉植物，種質(zhì)群 體內(nèi)部的一致性較高，目前國內(nèi)外育種主要是對野生或逸生種質(zhì)資源利用混合選擇，選育 出表現(xiàn)優(yōu)良后代群體，如國審品種"黔南"和"江夏"等，國外利用混合選擇或綜合品種選育 法登記的品種約為26個。近年來草地畜牧業(yè)的不斷發(fā)展和壯大，扁穗雀麥等一年生飼草品 種在南方農(nóng)區(qū)得以大面積推廣，草種子需求量日益增加。由于生產(chǎn)、管理、經(jīng)營不規(guī)范，不合 格種子甚至假種頻繁混入市場，不僅對養(yǎng)殖場和農(nóng)戶造成了一定損失，同時損害了品種權(quán) 擁有者的利益和廣大農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)利益，破壞了市場秩序。因此，建立扁穗品種快速可靠的鑒 定技術(shù)體系對于其品種和種質(zhì)資源的研究與保護(hù)及草種和畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展均具有重要 的意義。
[0003]目前對于扁穗雀麥等牧草品種的鑒定仍只是傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法，這依賴于品種之間 的表型差異，而形態(tài)性狀受到氣候、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)和物候期等多種因素影響，且形態(tài)鑒定 法工作量大、鑒定周期長、成本很高。而同工酶和種子貯藏蛋白多態(tài)性不夠豐富，且同工酶 有組織特異性、穩(wěn)定性差，這對于扁穗雀麥品種鑒定、推廣利用和育種等工作造成不利影 響。
[0004]分子標(biāo)記能反映生物個體或種群基因組中具有差異特征的DNA片段，具有豐富的 多態(tài)性和環(huán)境穩(wěn)定性，且操作簡便，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用到植物品種鑒定和種質(zhì)資源分類 等研究領(lǐng)域。目前，應(yīng)用較多的是ISSR、SSR、AFLP和SRAP等分子標(biāo)記。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài) 性（sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)是由美國加州大學(xué)Li和Quiros 于2001年提出的一種基于PCR的通用型分子標(biāo)記方法。SRAP通常為顯性標(biāo)記，呈Mendel 式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，因而是非常理想的分子標(biāo)記。其技術(shù)的原理是使用一 個17堿基正向引物和一個18堿基反向引物擴(kuò)增基因的開放閱讀框（openreadingframe， 0RF)。因為正反引物分別擴(kuò)增基因組的不同區(qū)域，充分利用了非編碼區(qū)和編碼區(qū)的堿基序 列差異，因此SRAP標(biāo)記在基因組中是均勻分布，可以覆蓋整個基因組，利用少數(shù)的引物就 可以進(jìn)行不同組合的擴(kuò)增，這將大大提高引物的多態(tài)性擴(kuò)增豐富度和使用率，同時也節(jié)約 合成引物的成本。由于SRAP標(biāo)記具備RAH)標(biāo)記操作的簡易性和AFLP分子標(biāo)記的高擴(kuò)增 多態(tài)性，目前SRAP分子標(biāo)記已經(jīng)在各個領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用，如植物的遺傳多樣性、品種 鑒定、指紋圖譜繪制、連鎖圖譜構(gòu)建等方面。。但在扁穗雀麥中，應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn) 行品種或種質(zhì)資源鑒定、構(gòu)建品種指紋圖譜的方法尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種用SRAP分子標(biāo)記對扁穗雀麥品種進(jìn)行鑒定的方法使該 方法能夠利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確、簡便的鑒定扁穗雀麥品種和其它種質(zhì)資源。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] -種用SRAP分子標(biāo)記對扁穗雀麥品種進(jìn)行鑒定的方法，包括如下步驟：
[0008]S1、以10個常用的扁穗雀麥品種幼苗植株為材料，每個品種選取10株，每株選取 無病害幼嫩葉片1片，將10片分別來自不同植株的葉片等重量混合，提取每個品種的總 DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測各品種總DNA純度以及完整性，用紫外分光光度計測定各 品種總DNA在260nm和280nm處的吸光值，確定DNA的純度及濃度。取各品種少量原始DNA 溶液稀釋至lOng/uL，于-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0009]S2、以步驟S1所得的DNA進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6 %的聚丙烯酰胺凝 膠電泳分離；200V電壓預(yù)電泳30min，每孔上樣6yL，400V恒壓電泳，直至指示帶距膠底部 3-5cm，停止電泳；用0. 1%AgN03染色，在NaOH溶液中顯影，照相觀察并記錄結(jié)果；
[0010]S3、根據(jù)每對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果建立指紋圖譜，以扁穗雀麥品種編號 為橫行，以每條譜帶的位點編號及其分子量為縱行，在每一橫縱坐標(biāo)交結(jié)處，有擴(kuò)增譜帶就 標(biāo)記為" 1"，無擴(kuò)增譜帶就標(biāo)記為"0"，分別繪制每對引物對供試品種的DNA指紋圖譜表；
[0011] S4、利用Freetree軟件計算供試扁穗雀麥品種之間的Dice遺傳距離系數(shù)，進(jìn)行類 平均法（UPGMA)聚類分析，獲得能反映獲知供試品種間的親緣關(guān)系的樹狀圖（含bootstrap 支持率），獲知供10個常見扁穗雀麥新品種間的親緣關(guān)系。
[0012] 其中，所述扁穗雀麥品種包括國內(nèi)審定的2個品種-"黔南"和"江夏"。
[0013] 其中，所述的步驟S2中SRAP-PCR擴(kuò)增采用15yLPCR反應(yīng)體系，2XTaqPCR Mix(400yMdNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、2.0mMMgCl2)7.5yl、模板DNA3yl(10ng/ yL)、上下游引物均為0? 9yL(5yM)、TaqDNA聚合酶0? 2yL(5U/iiL)，滅菌水補(bǔ)足15yL;
[0014] 其中，所述的步驟S2中PCR擴(kuò)增程序為：94°C變性5min，1個循環(huán)；94°C變性lmin， 35°C退火lmin，72°C延伸90s，共5個循環(huán)；之后35個循環(huán)：94°C變性lmin，51°C退火lmin， 72°C延伸90s;最后72°C延伸lOmin;4°C保存。
[0015] 其中，所述SRAP-PCR擴(kuò)增中采用的引物共14對，包括SEQIDNO. 1~NO. 14。
[0016] 上述方法可用于獲知未知材料與已知常見的扁穗雀麥品種之間的親緣關(guān)系，鑒定 扁穗雀麥種子的真假。
[0017]本發(fā)明選取10個在生產(chǎn)中常用的扁穗雀麥品種為供試材料，采用400對SRAP 引物（上下游各20條）分別擴(kuò)增上述扁穗雀麥品種的DNA，根據(jù)10個扁穗雀麥品種的 SRAP-PCR擴(kuò)增譜帶的特異性、多態(tài)性以及帶型的易區(qū)分程度進(jìn)行篩選，篩選出在不同品種 間能夠擴(kuò)增出多態(tài)性豐富、帶型清晰而且能夠穩(wěn)定重復(fù)的特征譜帶的引物對，共計14對， 并經(jīng)Freetree軟件檢驗無重合。在本發(fā)明所述方法的指紋圖譜構(gòu)建過程中，所述將有擴(kuò)增 條帶標(biāo)記為1、無擴(kuò)增條帶標(biāo)記0,以便用于相關(guān)分析軟件，提高數(shù)據(jù)分析效率。此外，品種 編號為橫坐標(biāo)、條帶編號為縱坐標(biāo)，或者采取相反的做法，這屬于數(shù)據(jù)格式的不同，本發(fā)明 不做具體限制。采用本發(fā)明構(gòu)建的扁穗雀麥DNA指紋圖譜，可以根據(jù)扁穗雀麥品種數(shù)量增 加及品種的更新?lián)Q代等需要不斷增加和更新，以滿足草地畜牧業(yè)生產(chǎn)中扁穗雀麥品種真實 性鑒定的需要。除此之外，按照本發(fā)明所述方法還可以將表1常用扁穗雀麥品種外的其他 種質(zhì)資源構(gòu)建SRAP指紋圖譜，如此便可鑒定更多的待測扁穗雀麥品種或種質(zhì)。同時，待測 扁穗雀麥品種SRAP指紋圖譜與已經(jīng)構(gòu)建的SRAP指紋圖譜比對時，需要計算出品種間的遺 傳距離或相似系數(shù)，來判定品種間的親緣關(guān)系和區(qū)分品種。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明選取適合于扁穗雀麥的高多態(tài)性SRAP引物，應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建 常用扁穗雀麥品種的DNA指紋圖譜，有利于對扁穗雀麥品種及種質(zhì)資源進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的 鑒定，且操作簡單實用，結(jié)果穩(wěn)定可靠，為扁穗雀麥品種和其它種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定、育種 利用和新品種知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了重要依據(jù)，為扁穗雀麥種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的構(gòu)建初步 奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為引物組合11F6R對10個國內(nèi)外主要扁穗雀麥品種的擴(kuò)增結(jié)果電泳圖（M: marker50bp;1-10 :表1中所列的10個扁穗雀麥品種）。
[0021] 圖2為引物組合18F10R對10個國內(nèi)外主要扁穗雀麥品種的擴(kuò)增結(jié)果電泳圖（M: marker50bp;1-10 :表1中所列的10個扁穗雀麥品種）。
[0022] 圖3為本發(fā)明實施例1中構(gòu)建的品種間的親緣關(guān)系的樹狀圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0024] 本發(fā)明實施例提供了一種用SRAP分子標(biāo)記對扁穗雀麥品種進(jìn)行鑒定的方法，包 括如下步驟：
[0025]Sl、DNA提?。阂员馑肴耕溒贩N幼苗植株為材料，每個品種選取10株，每株選取無 病害幼嫩葉片1片，將10片分別來自不同植株的葉片等重量混合，提取每個品種的總DNA， 用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測各品種總DNA純度以及完整性，用紫外分光光度計測定各品種 總DNA在260nm和280nm處的吸光值，確定DNA的純度及濃度。取各品種少量原始DNA溶 液稀釋至lOng/uL，于-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0026]S2、SRAP-PCR擴(kuò)增及電泳檢測：
[0027] 15 y L PCR反應(yīng)體系中，2XTaq PCR Mix(400 yM dNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、 2. OmM MgCl2) 7. 5y1、模板DNA3y1 (lOng/L)、上下游引物均為0?9yL(5yM)、Taq DNA聚 合酶0. 2 y L (5U/ y L)，滅菌水補(bǔ)足15 y L。
[0028]PCR擴(kuò)增程序：94°C變性5min，1個循環(huán)；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸 90s，共5個循環(huán)；之后35個循環(huán)：94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸90s;最后72°C 延伸lOmin;4°C保存。
[0029] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。200V電壓預(yù)電泳30min，每孔 上樣6yL，400V恒壓電泳，直至指示帶距膠底部3-5cm，停止電泳；用0. 1 %AgN03染色，在NaOH溶液中顯影；照相