1株系中的花青素，洗脫時(shí)同樣產(chǎn)生三個(gè)峰，但是第三個(gè)峰與 峰3的出峰時(shí)間明顯不同，命名為峰4 (如圖4)。
[0199] 將天竺葵-3-0-葡萄糖苷和矢車菊-3-0-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成 512 y g/mL、256 y g/mL、128 y g/mL、64 y g/mL、32 y g/mL、16 y g/mL、8 y g/mL、4 y g/mL、 2yg/mL、liig/mL。做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出的定量計(jì)算公式。根據(jù)天竺葵-3-0-葡萄糖苷和 矢車菊-3-0-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知，峰1為矢車菊-3-0-葡萄糖苷，峰2為天竺 葵-3-0-葡萄糖苷。從這圖5A和圖5B中可以看出在所有的草莓品種主要積累天竺葵-3-0 葡萄糖苷；4-1株系中的天竺葵-3-0-葡萄糖苷和矢車菊-3-0-葡萄糖苷的含量極顯著均 尚于其他品種；在甜查理中未檢測(cè)到矢車菊 _3_0_匍萄糖苷。
[0200] 三、基因表達(dá)分析結(jié)果
[0201]目前，花青素的代謝途徑已基本清晰，控制花青素合成的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被克 隆，花青素含量主要受基因表達(dá)調(diào)控（Espley RV，Hellens RP，Putterill J, Stevenson DE, Kutty-Amma S, Allan AC. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor, MdMYBlO. Plant Journal, 2007, 49:414-427)。為i全釋 4-1株系中花青素高積累的原因，發(fā)明人還測(cè)定了與草莓花青素代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄 因子在不同品種間的表達(dá)特性。
[0202] 從圖6可以看出，以PMV株系（空載）為對(duì)照，4-1株系果實(shí)中多數(shù)檢測(cè)基因的表 達(dá)量高于PMV株系。其中上調(diào)趨勢(shì)最明顯的是查爾酮合成酶基因（CHS)，該基因上調(diào)8. 5 倍。其次是查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI)，在4-1株系中上調(diào)了 6.1倍。另外，4-1株系中黃烷 酮-3-羥化酶基因（F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR)、花色素苷合成酶基因（ANS)、 類黃酮-3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UFGT)也有2-4倍的上調(diào)趨勢(shì)。在與花青素相關(guān)的MYB1 基因、MYB10基因、bHLH3基因、bHLH33基因表達(dá)量的測(cè)定中，4-1株系中MYB10基因、bHLH3 基因上調(diào)明顯，上調(diào)3-4倍。對(duì)于MYB1基因和bHLH33基因，4-1株系的變化趨勢(shì)不明顯。
[0203] 如何使根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化具有較高的轉(zhuǎn)化率以及柑橘八氫番茄 紅素合成酶基因CitPSY在草莓中穩(wěn)定表達(dá)是本發(fā)明所述技術(shù)方案的關(guān)鍵內(nèi)容也是難點(diǎn)。
[0204] 遺傳轉(zhuǎn)化的過程相當(dāng)復(fù)雜，受眾多因素影響，如根癌農(nóng)桿菌菌體活力、所帶質(zhì)粒致 病性、濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素類型、篩選壓濃度、受體細(xì)胞活力、受體細(xì)胞DNA 復(fù)雜程度、再生培養(yǎng)條件、外植體再生周期等，這些因素交互作用，從而影響轉(zhuǎn)化效率。根 癌農(nóng)桿菌菌液的濃度及侵染時(shí)間，必需能夠滿足能夠得到較高再生頻率以及較高的轉(zhuǎn)化頻 率，低濃度的菌液侵染時(shí)間過長或者高濃度侵染較短時(shí)間都不能得到很好的轉(zhuǎn)化效果。Kan 是植物遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的抗生素，選擇合適的Kan濃度是成功篩選并獲抗性芽的關(guān)鍵。 Kan對(duì)于植物組織有不良的影響，濃度過高會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞造成劇烈的毒害作用，會(huì)致使外植 體快速死亡；濃度低，篩選不徹底，會(huì)得到很多的假陽性苗或者嵌合體苗。Cef?是常用的農(nóng) 桿菌抑制劑，為是受體細(xì)胞正常發(fā)育，要在共培養(yǎng)后抑制農(nóng)桿菌繼續(xù)生長。Cef?同樣對(duì)于外 植體材料有毒害作用，會(huì)抑制愈傷組織形成和不定芽再生，同時(shí)會(huì)使被侵染葉片發(fā)育畸形。 本發(fā)明中，Kan濃度達(dá)到10mg/L時(shí)，葉片的愈傷再生率已變的極低，幾乎完全抑制不定芽發(fā) 生。接種的葉片及再生的不定芽逐漸由綠色變淺至白化死亡。當(dāng)Kan濃度高于20mg/L時(shí)， 葉盤得再生幾乎被完全抑制。Cef濃度在250mg/L時(shí)已能較好抑制根癌農(nóng)桿菌的繁殖，再高 的濃度容易是葉片的生長畸形。在本發(fā)明中，共培養(yǎng)后的葉盤用還有相同濃度的Cef液體 再生培養(yǎng)基漂洗1-2次，能有有效的抑制農(nóng)桿菌，很好的降低了愈傷的褐化和葉片的畸形 生長。本發(fā)明對(duì)于Kan濃度的選擇與常用的用量差別很大。Kan對(duì)草莓葉片的不定芽再生 抑制作用很明顯，但不同基因型的草莓對(duì)其敏感度不同，無法根據(jù)已有的用量來直接用于 本發(fā)明的技術(shù)方案中。本發(fā)明中，前期以l〇mg/L Kan作為篩選壓，不定芽伸長后，篩選壓逐 步加大到15mg/L。在生根培養(yǎng)基中，Kan對(duì)轉(zhuǎn)化植株的生根具有強(qiáng)烈的抑制作用，不定芽伸 長生長后，接種于含有l(wèi)〇mg/L Kan的生根培養(yǎng)基中，每3w繼代一次，10w后才生根，之后正 常生長。
[0205] 本發(fā)明中，以推遲2w(即2周）篩選后轉(zhuǎn)化效果最佳，而非立即篩選。葉盤共培養(yǎng) 后立即接于篩選培養(yǎng)基上，傷口褐化嚴(yán)重，大部分葉盤黃化或白化，再生率大大降低。推測(cè) 的原因可能為：葉盤在培養(yǎng)時(shí)邊緣開始膨大、向上翹起或者卷曲，如果立即接種于含Kan的 篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，葉盤中部受到抗生素影響而產(chǎn)生黃化或白化，導(dǎo)致生長素和營養(yǎng) 供應(yīng)不足，葉盤的邊緣上轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能分化成芽。此外，單個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能不能承受Kan 選擇壓而死亡，推遲l〇d篩選，其周圍形成大量細(xì)胞團(tuán)，增加篩選壓的承受能力，但是這種 情況下，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞同時(shí)生長，假陽性和嵌合體出現(xiàn)是不可避免的。本發(fā)明中， 得到的假陽性植株在后期繼代中慢慢白化，嵌合體植株中出現(xiàn)一半白化、一半保持綠色的 狀態(tài)，之后也相繼死亡。
[0206] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 柑橘八氫番茄紅素合成酶基因用于轉(zhuǎn)入草莓中以提高草莓花青素含量的用途。2. -種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 構(gòu)建柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒； 2) 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將步驟1)構(gòu)建的柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入草 莓中，獲得轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓； 3) 將轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定； 4) 檢測(cè)表達(dá)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓中花青素的含量； 5) 轉(zhuǎn)入柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓中花青素代謝相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟2)所述獲 得轉(zhuǎn)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓的方法包括以下步驟： 21) 制備草莓無菌試管苗材料； 22) 制備接種用的草莓外植體； 23) 利用葉盤法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟23)所述利 用葉盤法農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化具體包括以下步驟： a) 將含有柑橘八氫番前紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)； b) 將草莓外植體于固體外植體再生培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，得到葉盤； c) 取步驟a)的單菌落接種于含有抗生素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)； d) 取步驟c)中培養(yǎng)的菌液接種到不含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)； e) 取步驟d)培養(yǎng)的菌液離心，棄上清，重懸； f) 將步驟b)培養(yǎng)的葉盤于無菌條件下懸浮備用； g) 將步驟f)中用于懸浮的液體濾出，向葉盤中加入步驟e)重懸的菌液，搖動(dòng)，濾出菌 液，將葉片多余菌液吸干后，接于固體的外植體再生培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)為 暗培養(yǎng)，之后進(jìn)行推遲篩選，所述推遲篩選也為暗培養(yǎng)； h) 將推遲篩選后的葉片接于篩選培養(yǎng)基； i) 進(jìn)行暗培養(yǎng)至葉片長出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，篩選抗性芽； j) 將篩選培養(yǎng)后得到的抗性芽切下，接在含有抗生素的植株繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)芽 體長出并出現(xiàn)小葉片后，移至含有抗生素的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根； 上述步驟c)、j)中所述的抗生素的抗性與柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒所 攜帶的抗性基因抗性一致。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟g)中，所 述外植體再生培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為I. 5mg/L的脫葉靈和終濃度為 0? 2mg/L的吲噪丁酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟g)中，共培 養(yǎng)時(shí)間為3d，推遲篩選的時(shí)間為7-14d。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟h)中，所述 篩選培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為I. 5mg/L的脫葉靈、終濃度為0. 2mg/L的 吲哚丁酸、終濃度為250mg/L的頭孢霉素和終濃度為10mg/L的卡那霉素。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項(xiàng)所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步 驟j)中，所述含有抗生素的植株繼代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為0. 2mg/L 的6-芐基腺嘌呤、終濃度為0.02mg/L的吲哚丁酸、終濃度為0.2mg/L的赤霉素、終濃度為 10mg/L的卡那霉素和終濃度為250mg/L的頭孢霉素。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步驟j)中，所述 含有抗生素的生根培養(yǎng)基為將MS培養(yǎng)基稀釋兩倍后同時(shí)添加終濃度為0. 2mg/L的吲哚丁 酸、終濃度為l〇mg/L的卡那霉素和終濃度為250mg/L的頭孢霉素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及柑橘八氫番茄紅素合成酶基因用于提高草莓花青素含量以及利用所述柑橘八氫番茄紅素合成酶基因提高草莓花青素含量的方法，包括以下步驟：構(gòu)建柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒；優(yōu)化草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將柑橘八氫番茄紅素合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入草莓中，獲得表達(dá)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓；將轉(zhuǎn)入柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，檢測(cè)表達(dá)柑橘八氫番茄紅素合成酶基因的草莓中花青素的含量。利用柑橘八氫番茄紅素合成酶基因以及上述的方法可以顯著提高草莓中花青素的含量。
【IPC分類】C12P17/06, C12N9/00, C12N15/52, C12N15/84
【公開號(hào)】CN105039360
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510504689
【發(fā)明人】徐娟, 賈楠, 李紹杰, 吳海靜, 田靜, 趙甜甜
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月17日