一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量的 方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycinemax)是世界上重要的油料糧食作物，其種子油是人類與動物營養(yǎng) 以及食品加工業(yè)植物食用油的重要來源。大豆油用量占全世界食用油的31%(Kimand Krishnan，2004)。大豆種子油主要是由甘油和脂肪酸組成的，其中脂肪酸占種子油的90% 以上，主要包括棕櫚酸（16:0)與硬脂酸（18:0)兩種飽和脂肪酸和油酸（18:1)、亞油酸 (18:2)與亞麻酸（18:3)等三種不飽和脂肪酸。脂肪酸的組成及其種類配比決定了種子油 的品質(zhì)。亞麻酸是人體必需脂肪酸，具有降低血清膽固醇和甘油三酯及軟化血管等重要生 理功能，被營養(yǎng)學(xué)家稱之為"安全脂肪酸"。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織指出："鑒于多 不飽和脂肪酸在人體發(fā)育和健康中具有不可或缺的作用，建議所有嬰幼兒配方食品中都應(yīng) 含有多不飽和脂肪酸"。亞麻酸具有多種生理功能，是深海魚油中富含的二十二碳六烯酸 (DHA)和二十碳五烯酸（EPA)的重要代謝前體，尤其對生活在內(nèi)陸地區(qū)、很少食用深海產(chǎn)品 人們的健康極為重要。美、英、法、德、日等國立法規(guī)定嬰幼兒食品中必須添加亞麻酸及其代 謝物。為了解決我國人民攝取亞麻酸不足的問題，需要提高大豆亞麻酸含量，改善脂肪酸配 比以增加大豆的營養(yǎng)價值。
[0003] 由于亞麻酸含量是受多基因控制的數(shù)量性狀且易受環(huán)境影響，利用傳統(tǒng)表型鑒 定和育種方法培育高亞麻酸含量的品種不但需要花費(fèi)很長的時間，而且難于成功，已經(jīng) 不能夠滿足當(dāng)前優(yōu)質(zhì)大豆育種的發(fā)展。隨著分子標(biāo)記的開發(fā)和使用，分子標(biāo)記輔助選擇 (Molecularmarker-assistedselection，MAS)成為可以節(jié)約人力、物力和加速育種進(jìn)程 的有效方法（Creganetal. 1999)。分子標(biāo)記輔助選擇的最大優(yōu)點(diǎn)為在不需要評估表型特 征的情況下，通過確認(rèn)是否帶有目標(biāo)基因而鑒定出高亞麻酸含量的植株。
[0004] 大豆種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著豐富的基因，從育種的物質(zhì)基礎(chǔ)一種質(zhì)資源中發(fā)掘所需要 的優(yōu)異資源及基因可有效促進(jìn)大豆品種改良。作為栽培大豆起源地，我國的大豆種質(zhì)資源 在世界上最為豐富，現(xiàn)保存在國家種質(zhì)資源庫的就有3萬余份，在亞麻酸含量上變異廣泛 (劉興媛等，作物品種資源，1998)。為了有效的研究和利用我國大豆資源，邱麗娟等（作物 學(xué)報，2009)構(gòu)建了可代表我國大豆種質(zhì)資源多樣性的核心種質(zhì)，為深入發(fā)掘種質(zhì)資源中蘊(yùn) 藏的優(yōu)異基因、有效拓寬大豆遺傳基礎(chǔ)奠定了材料基礎(chǔ)。
[0005] 關(guān)聯(lián)分析，又稱關(guān)聯(lián)作圖（AssociationMapping)，是一種以LD(Linkage Disequlibrium)分析為基礎(chǔ)，直接對基因型變異和表型變異進(jìn)行分析，從而把那些與性狀 有關(guān)聯(lián)的基因鑒定出來（Khushetal. 2001)的基因定位方法，已成為發(fā)掘與表型相關(guān)分 子標(biāo)記的強(qiáng)有力工具。新型分子標(biāo)記一SNP因?yàn)榫哂性诨蚪M中數(shù)量多、分布廣泛、可高 通量檢測等優(yōu)點(diǎn)而在近年廣泛用于鑒定多基因控制的復(fù)雜性狀。隨著SNP標(biāo)記數(shù)量的不 斷增多，高通量的SNP分型平臺相繼推出，包括GoladenGate和BeadArray(Illumina)， GenomeLabSNPstream(Beckman)和MegAllele(AfTymetrix)等，其中Illumina公司的BeadArray芯片鑒定技術(shù)具有高效、高通量、成本低、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，適合位點(diǎn)數(shù)從幾十到 幾千的中等通量基因分型研究，實(shí)驗(yàn)成功率>99%，是理想的中高通量基因分型檢測的解決 方案，目前已被廣泛用于人類、擬南芥、水稻等物種的SNP分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量性狀，和/或，篩選或輔助 篩選具有不同亞麻酸含量的大豆籽粒。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含 量性狀的方法，可包括如下步驟：檢測待測大豆基因組中基于Map-6017SNP位點(diǎn)的基因型， 如果為TT純合型、待測大豆籽粒為候選的具有高亞麻酸含量性狀的大豆籽粒，如果為CC純 合型、待測大豆籽粒為候選的具有低亞麻酸含量性狀的大豆籽粒。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種篩選或輔助篩選具有不同亞麻酸含量 的大豆籽粒的方法，可包括如下步驟：檢測待測大豆基因組中基于Map-6017SNP位點(diǎn)的基 因型，如果為TT純合型、待測大豆籽粒為候選的具有高亞麻酸含量性狀的大豆籽粒，如果 為CC純合型、待測大豆籽粒為候選的具有低亞麻酸含量性狀的大豆籽粒。
[0009] 上述方法中，所述Map-6017位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第2條染色體的 Glyma.02gl38100基因；所述Glyma.02gl38100基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6017位點(diǎn)為序列表中序列1的第3230位。
[0010] 上述方法中，所述高亞麻酸含量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以上；所述低亞麻 酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0011] 上述方法中，所述檢測待測大豆基因組中基于Map-6017SNP位點(diǎn)的基因型的方法 可包括：（1)提取大豆基因組DNA。（2)加入Map-6017探針組，進(jìn)行等位基因特異性延伸和 連接酶連接，可以得到一段包含Map-6017SNP位點(diǎn)和地址序列的片段。（3)將得到的片段進(jìn) 行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增體系中具有Cy3標(biāo)記的dATP、Cy5標(biāo)記的dGTP、dCTP和dTTP)后與芯片 (美國11Iumina公司產(chǎn)品，芯片上具有微珠，微珠表面連接有所述地址序列的互補(bǔ)序列）進(jìn) 行雜交。（4)芯片掃描，利用軟件根據(jù)兩種熒光顏色判讀并輸出分型結(jié)果。從而確定待測大 豆品種基于Map-6017SNP位點(diǎn)基因型為TT純合型或CC純合型。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0013] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，可為檢測大豆基因組中基于Map_6017SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或 基因型的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的功能為如下（a)、（b)或（c):
[0014] (a)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的亞麻酸含量性狀；
[0015] (b)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0016] (C)篩選或輔助篩選具有不同亞麻酸含量的大豆籽粒。
[0017] 上述產(chǎn)品中，所述大豆基因組中基于Map-6017SNP位點(diǎn)的基因型可為TT純合型或 CC純合型。
[0018] 上述產(chǎn)品中，所述Map-6017位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第2條染色體的 Glyma.02gl38100基因；所述Glyma.02gl38100基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6017位點(diǎn)為序列表中序列1的第3230位。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述檢測大豆基因組中基于Map_6017SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的 物質(zhì)可包括Map-6017SNP探針組。
[0020] 上述產(chǎn)品中，所述亞麻酸含量為高亞麻酸含量或低亞麻酸含量；所述高亞麻酸含 量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以上；所述低亞麻酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0021] 檢測大豆基因組中基于Map_6017SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在下述 (1)-(6)中的任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022] (1)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的亞麻酸含量性狀；
[0023] (2)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的亞麻酸含量性狀的產(chǎn)品；
[0024] (3)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0025] (4)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn) 品；
[0026] (5)篩選或輔助篩選具有不同亞麻酸含量的大豆籽粒；
[0027] (6)制備篩選或輔助篩選具有不同亞麻酸含量的大豆籽粒的產(chǎn)品。
[0028] 上述應(yīng)用中，所述（1)和/或所述（2)中，所述大豆籽粒的亞麻酸含量性狀可為高 亞麻酸含量性狀或低亞麻酸含量性狀。所述高亞麻酸含量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以 上；所述低亞麻酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0029] 上述應(yīng)用中，所述（3)和/或所述（4)中，所述大豆籽粒的亞麻酸含量性狀可為高 亞麻酸含量性狀或低亞麻酸含量性狀。所述高亞麻酸含量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以 上；所述低亞麻酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述（5)和/或所述（6)中，所述具有不同亞麻酸含量的大豆籽?？?為具有高亞麻酸含量性狀的大豆籽粒或具有低亞麻酸含量性狀的大豆籽粒。所述高亞麻酸 含量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以上；所述低亞麻酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0031] 上述應(yīng)用中，所述大豆基因組中基于Map-6017SNP位點(diǎn)的基因型可為TT純合型或 CC純合型。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述Map-6017位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第2條染色體的 Glyma.02gl38100基因；所述Glyma.02gl38100基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6017位點(diǎn)為序列表中序列1的第3230位。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述用于檢測大豆基因組中基于Map_6017SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)可包括Map-6017SNP探針組。
[0034] 上述任一所述Map-6017SNP探針組可由探針1、探針2和探針3組成：
[0035] 所述探針1為單鏈DNA分子，探針1的序列如序列表中序列2中的核苷酸所示。
[0036] 所述探針2為單鏈DNA分子，探針2的序列如序列表中序列3中的核苷酸所示。
[0037] 所述探針3為單鏈DNA分子，探針3的序列如序列表中序列4中的核苷酸所示。
[0038] 本發(fā)明中，所述高亞麻酸含量指的是亞麻酸含量可為8. 5%以上；所述低亞麻酸 含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
[0039] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒亞麻酸含量性狀的方法 可以用于鑒定或輔助鑒定待測大豆品種中大豆籽粒亞麻酸含量的高低。所述高亞麻酸含量 指的是亞麻酸含量為8. 5%以上；所述低亞麻酸含量指的是亞麻酸含量小于8. 5%。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下