一株蕈狀芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治植物病害領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明設(shè)及一株能夠高效防治植 物病害的芽抱桿菌及其用途，W及采用該芽抱桿菌制備的生物防治制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病害是植物在生物或非生物因子的影響下，發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化上 的病理變化，阻礙了正常生長、發(fā)育的進(jìn)程，從而影響人類經(jīng)濟(jì)效益的現(xiàn)象。目前對于植物 病害的防治，常規(guī)采用的方法包括傳統(tǒng)的化學(xué)防治、培育抗病品種W及生物防治?？共∑贩N 培育周期長，抗性單一，而化學(xué)防治，極易造成農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染；同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的長期 使用，使得病原菌對其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效下降甚至失敗。因此，利用有益微生物防治植 物病害具有廣闊的前景。
[0003] 芽抱桿菌度acillus)，在分類上是細(xì)菌的一個(gè)科，能形成芽抱（內(nèi)生抱子）的桿 菌或球菌。包括芽抱桿菌屬、芽抱乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽抱八疊球菌屬等。 形成芽抱后，它們對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于±壤、水、空氣W及動物腸道等 處。由于它們代謝快、繁殖快，四小時(shí)增殖10萬倍；生命力強(qiáng)，耐受性好；體積大，占據(jù)空間 優(yōu)勢，抑制有害菌的生長繁殖等優(yōu)勢而備受矚目。芽抱桿菌是植物病害生防微生物的重要 組成部分，可用于防治多種植物病害。芽抱桿菌作為生防菌防治植物病害的機(jī)制主要有：抗 生作用、營養(yǎng)競爭、空間競爭、重寄生作用W及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等機(jī)制，芽抱桿菌的生防 機(jī)制主要是W產(chǎn)生括抗物質(zhì)抑制有害病菌的生長或殺死病原菌。運(yùn)些物質(zhì)絕大多數(shù)為膚類 抗生素，具有高效、低殘留、與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于高效防治多種植物病害的新的微生物一一葦狀芽 抱桿菌WWM09。本發(fā)明的芽抱桿菌菌株具有直徑長、耐低氧、作用譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)，在低營養(yǎng) 下即可快速生長繁殖等特點(diǎn)，因此具有良好的應(yīng)用前景。
[0005] 本發(fā)明所提供的菌株為葦狀芽抱桿菌度acillusmycoides)WWM09,是從勸海淺海 海水中分離獲得的，已于2015年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究 所），保藏編號為CGMCCNo. 11047。其具有W下生物學(xué)特性：在牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基或 LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形或不規(guī)則形，乳白偏黃色，表面粗糖起權(quán)皺，在牛肉膏蛋白腺瓊 脂培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)兩天后，鏡檢，菌體細(xì)胞呈桿狀，能運(yùn)動。經(jīng)革蘭氏染色呈陽性（W 大腸桿菌為對照）。經(jīng)芽抱染色后觀察芽抱呈楠圓形或柱狀。
[0006] 本發(fā)明葦狀芽抱桿菌度acillusmycoides)菌株WWM09的培養(yǎng)方法或繁殖方法包 括：
[0007] (1)普通培養(yǎng)保存采用LB培養(yǎng)基，配方為：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，氯化鋼 1〇邑，瓊脂15-20g，蒸饋水1000血，抑調(diào)至7. 0-7. 2 ;
[0008] (2)實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基，配方為：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g， 氯化鋼lOg，蒸饋水1000血，抑調(diào)至7. 0-7. 2;
[000引 做固體培養(yǎng)基配方：固料和無機(jī)鹽溶液，固料和無機(jī)鹽溶液的質(zhì)量比為1:2.0; 所述固料由按質(zhì)量比為65 :20 :15的玉米面、豆巧和教皮組成；按質(zhì)量百分比計(jì)，所述無機(jī) 鹽溶液的組分及含量為：2. 7%憐酸二氨鐘，0. 04%硫酸儀，3. 5%硫酸錠，剩余為水；
[0010] (4)大量發(fā)酵培養(yǎng)基配方：同（3)中固體培養(yǎng)基配方。
[0011] 本發(fā)明還提供一種含有所述的葦狀芽抱桿菌菌株WWM09的生物防治制劑。
[0012] 本發(fā)明所述的生物防治制劑的制備方法包括W下步驟：
[0013] (1)制備葦狀芽抱桿菌菌株WWM09的種子液；
[0014] (2)將步驟（1)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28-30°C下恒溫培養(yǎng)3~5d;
[0015] (3)將步驟（2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基， 在室溫28-30°C、相對濕度85%W上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016] 其中，步驟（2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶 液的質(zhì)量比為1 :2. 0 ;所述固料由質(zhì)量比為65 :20 :15的玉米面、豆巧和教皮組成；按質(zhì)量 百分比計(jì)，所述無機(jī)鹽溶液的組分及含量為：2. 7%憐酸二氨鐘，0. 04%硫酸儀，3. 5%硫酸 錠，剩余為水。
[0017] 并且，步驟（3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同固體培養(yǎng)基。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述制備方法包括W下步驟：
[0019] (1)將所述葦狀芽抱桿菌菌株WWM09的抱子移植到LB液體培養(yǎng)基中，28-30°C搖床 振蕩培養(yǎng)3~5d得到種子液；
[0020] 似將步驟（1)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28-30°C 下振蕩培養(yǎng)3~5d;
[002。 做將步驟似培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水按質(zhì)量比1 :15的比例混合，過濾，將濾 液按體積比1 :6的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫28-30°C、相對濕度85%W上的發(fā)酵室中發(fā) 酵培養(yǎng)5~6d。
[0022] 本發(fā)明也提供了上述葦狀芽抱桿菌菌株WWM09或者上述生物防治制劑在防治植 物葉部病害中的用途。所述植物葉部病害可W選自黃瓜白粉病、葡萄霜霉病、月季白粉病等 一種或幾種。
[0023] 并且，本發(fā)明還提供了一種用于防治植物葉部病害的生物防治方法，所述生物防 治方法包括向具有葉部病害的植物施用上述葦狀芽抱桿菌菌株WWM09或者上述生物防治 制劑。
[0024] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的葦狀芽抱桿菌菌株WWM09具有直徑長、耐低氧、作用譜廣、適 應(yīng)性強(qiáng)，在低營養(yǎng)下即可快速生長繁殖等特點(diǎn)，因此具有良好的應(yīng)用前景。由該葦狀芽抱 桿菌菌株WWM09制備的生物防治制劑可W作為生物農(nóng)藥或生物肥料，防治黃瓜白粉病、葡 萄霜霉病、月季白粉病等葉部病害，還可W防治棉花立枯病、西瓜枯萎病等多種±傳植物病 害。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但運(yùn)些實(shí)施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但運(yùn)些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 1、葦狀芽抱桿菌菌株WWM09的分離與純化
[0028] 本發(fā)明的葦狀芽抱桿菌菌株WWM09是從海水中采用稀釋平板法和平板劃線法分 離獲得的，分離方法為：
[0029] (1)芽抱桿菌的分離：水樣的采集，在山東省濰坊北部勸海海域不同地點(diǎn)，采用隨機(jī) 取樣法，分別采集離海岸2. 5米范圍內(nèi)的海水適量，混勻。標(biāo)明采集地點(diǎn)、時(shí)間和采集人。稱 取Ig水于lOOmL無菌水中，置于30°C搖床中15化pm震蕩lOmin，然后置于60°C水浴鍋中 解育30min，取100yL10 1、10 2、103稀釋液涂布于LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度涂布S個(gè)平 行，在3(TC培養(yǎng)2d后挑取LB培養(yǎng)基上的不同形態(tài)的微生物菌落于LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃 線，定時(shí)觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化芽抱桿菌菌株，分別編號保存。
[0030] 似黃瓜白粉病高效括抗芽抱桿菌的篩選
[0031] ①初篩：黃瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea(Schlecht)Poll.病原為單絲白粉 菌屬子囊菌亞口真菌。該菌系專性寄生菌，只在活體寄主上存活。因此，篩選時(shí)必須在黃瓜 上接種病原菌培養(yǎng)而不是離體平板培養(yǎng)測定。
[0032] 黃瓜白粉病喜溫濕、耐干燥。溫度10~30°C，相對濕度25%~85%，其抱子即可 萌發(fā)。發(fā)病最適溫度16~24°C，最適相對濕度為75 %。溫度高于30°C，濕度超過95 %，貝。 病情受到抑制。根據(jù)白粉病流行的規(guī)律，尤其當(dāng)高溫干旱與高溫高濕交替出現(xiàn)，又有大量白 粉菌源時(shí)很易流行的特點(diǎn)，人為通過人工氣候室進(jìn)行環(huán)境模擬，通過人為接種使黃瓜白粉 病發(fā)生。
[0033] 我們從2010年開始，每年秋季10至11月份在溫室大棚中，人為接種白粉病，進(jìn)行 盆栽黃瓜白粉病抑菌試驗(yàn)。
[0034] 栽培的盆栽黃瓜長至5片葉時(shí)，進(jìn)行接種。首先將冷藏在冰箱中的黃瓜白粉病病 葉置于無菌水中，輕微攬拌均勻，用手動微型噴霧器噴灑在黃瓜葉片上，控制條件，使其生 長、發(fā)育。
[0035] 每個(gè)試驗(yàn)4盆一組，噴灑生防菌菌液后，用塑料布單獨(dú)隔離，不設(shè)空白對照，只對 照發(fā)病輕重。在白粉病發(fā)病5天和13天分別調(diào)查2次，進(jìn)行病情記錄和統(tǒng)計(jì)分析，將抑菌 效果好的菌株排序，選擇表現(xiàn)最好的前3株進(jìn)行復(fù)篩，W便進(jìn)行抑菌穩(wěn)定性和適應(yīng)性試驗(yàn)， 為確定工業(yè)化菌株奠定基礎(chǔ)。
[0036] 對黃瓜白粉病的抑制試驗(yàn)分兩個(gè)方法，一是在沒有發(fā)病時(shí)，也就是接種白粉病病 原菌3天后進(jìn)行生防菌菌液噴布；二是在白粉病已經(jīng)發(fā)病，且菌絲在黃瓜葉片能夠用肉眼 看到，并發(fā)病均勻后進(jìn)行菌液噴灑。目的是驗(yàn)證所篩選的生防菌是否具備預(yù)防和治療雙重 作用。
[0037] ②復(fù)篩：將篩選到的具有高效括抗活性的芽抱桿菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，主要是經(jīng)過耐 溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗(yàn)，篩選到耐性較好的芽抱桿菌菌株，進(jìn)行田間試驗(yàn)。
[0038] 本發(fā)明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治多種植物病害的葦狀芽抱桿 菌化mycoides)WWM09。實(shí)驗(yàn)證明，該葦狀芽抱桿菌原粉在防治黃瓜白粉病顯示出非常高效 的防治效果，兼有預(yù)防和治療作用，使得黃瓜增產(chǎn)顯著。因而，本發(fā)明的葦狀芽抱桿菌是具 有廣泛應(yīng)用前景的葦狀芽抱桿菌新菌株，可W用于制備防治黃瓜白粉病的生物防治制劑。
[0039] 2、菌株鑒定
[0040] (1)微生物學(xué)特性：在牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形或 不規(guī)則形，乳白偏黃色，表面粗糖起權(quán)皺，在牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)兩天 后，鏡檢，菌體細(xì)胞呈桿狀，能運(yùn)動。經(jīng)革蘭氏染色呈陽性大腸桿菌為對照）。經(jīng)芽抱染 色后觀察芽抱呈楠圓形或柱狀。
[0041] (2)分子生物學(xué)特性
[004引該菌株的16s rRNA基因序列測定結(jié)果如下（SEQ-1):
[0043] TACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATTAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC GTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGG TTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGGGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTT CGGGTCGTAAAACTCTGTCGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTACCAGAA AGCCACGGCTAACTACCTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAG CGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACT TGAGTGCAGAACAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAA G